成骨細(xì)胞和制備成骨細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及成骨細(xì)胞和制備成骨細(xì)胞的方法，并且更具體地設(shè)及通過直接重編程 制備成骨細(xì)胞的方法.
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 可W期望將成骨細(xì)胞移植至受累區(qū)域W修復(fù)由骨腫瘤、創(chuàng)傷、骨髓炎等導(dǎo)致的骨 缺損或者骨腫瘤等的刮除術(shù)之后的骨缺損能夠促進(jìn)骨形成并改善功能和形態(tài)學(xué)預(yù)后。事實(shí) 上，已經(jīng)實(shí)施了通過收集自例如患者的松質(zhì)骨的骨髓細(xì)胞的自體移植進(jìn)行的治療，并且治 療的效果是已知的。在此類情況下，通過自體骨髓細(xì)胞中包含的間充質(zhì)干細(xì)胞的分化誘導(dǎo) 獲得的成骨細(xì)胞被認(rèn)為有助于骨形成和骨重塑。同時(shí)，骨質(zhì)疏松癥患病率的增加與人口老 齡化相一致，并且老年人骨折可能導(dǎo)致長期邸床。成骨細(xì)胞的移植被認(rèn)為能夠促進(jìn)由骨質(zhì) 疏松癥、創(chuàng)傷等導(dǎo)致的骨折，難治性骨折W及假骨折的治愈。此外，成骨細(xì)胞的移植也可W 用于例如：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、特發(fā)性股骨頭壞死、變形性關(guān)節(jié)病、變形性腰椎關(guān)節(jié)強(qiáng)硬 (lumbar spondylosis deformans)、椎管狹窄癥、椎間盤突出、脊椎滑脫、崩裂性脊柱滑脫、 脊柱側(cè)凸、脊髓型頸椎病、后縱初帶骨化、脊髓損傷、髓關(guān)節(jié)病、膝關(guān)節(jié)病、股骨頭骨號(hào)滑脫、 骨軟化癥、術(shù)后骨修復(fù)(如屯、臟手術(shù)之后的胸骨修復(fù)）、與人工踩關(guān)節(jié)手術(shù)相關(guān)的缺損修復(fù)、 骨髓炎W及骨壞死。
[0004] 另一方面，牙周病可被稱作第四生活方式相關(guān)疾病，在人群中發(fā)病率很高，并且引 起各種全身性疾病。隨著牙周病的進(jìn)展，發(fā)生牙槽骨的骨吸收。因此，當(dāng)高效地向局部骨吸 收部位提供成骨細(xì)胞時(shí)，可W再生并治療牙槽骨。
[0005] 當(dāng)將成骨細(xì)胞的移植與骨移植、人工骨移植、人工關(guān)節(jié)和埋植劑組合時(shí)，可W增強(qiáng) 治療效果。
[0006] 迄今為止已經(jīng)將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、包括骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的骨髓細(xì)胞等用作此 類成骨細(xì)胞用于移植。然而，骨髓的收集存在問題。例如，收集對(duì)于患者具有高度侵害性，并 且在一些情況下不能提供足量的骨髓細(xì)胞。另一方面，使用人胚胎干細(xì)胞化S細(xì)胞)不需要 從患者身上收集骨髓，并且可W提供足量的成骨細(xì)胞，但是除倫理問題外，可能會(huì)引起移植 之后剩余的ES細(xì)胞的腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。此外，使用iPS細(xì)胞不需要從患者身上收集骨髓，并 且可W提供足量的成骨細(xì)胞，但是可能會(huì)引起移植之后剩余的細(xì)胞的腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。
[0007] 在非專利文獻(xiàn)1中，公開了向人ES細(xì)胞中導(dǎo)入包括Osterix的慢病毒載體，W及在 成骨細(xì)胞培養(yǎng)基中分化誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞。
[000引在非專利文獻(xiàn)2和非專利文獻(xiàn)3中，公開了通過在成骨細(xì)胞培養(yǎng)基中分化誘導(dǎo)將小 鼠細(xì)胞轉(zhuǎn)化為MSC來制備成骨細(xì)胞。
[0009] 在非專利文獻(xiàn)4中，公開了通過向小鼠 iPS細(xì)胞中導(dǎo)入包括Runx2的腺病毒載體并 在成骨細(xì)胞培養(yǎng)基中將細(xì)胞進(jìn)行分化誘導(dǎo)來制備成骨細(xì)胞。
[0010] 如在非專利文獻(xiàn)1至非專利文獻(xiàn)4中公開的，通過分化誘導(dǎo)從多能干細(xì)胞如ES細(xì)胞 和細(xì)胞制備成骨細(xì)胞，因此該方法需要長期培養(yǎng)并存在致癌作用的風(fēng)險(xiǎn)。
[0011] 例如，基于當(dāng)將組織特異的轉(zhuǎn)錄因子的基因群組導(dǎo)入體細(xì)胞時(shí)，可W在不轉(zhuǎn)變?yōu)?iPS細(xì)胞的情況下實(shí)現(xiàn)直接分化誘導(dǎo)為組織細(xì)胞(直接重編程(直接轉(zhuǎn)化））運(yùn)一事實(shí)，已經(jīng) 做出了下述報(bào)導(dǎo)：
[0012] 小鼠成纖維細(xì)胞一軟骨細(xì)胞(導(dǎo)入S0X9+Klf4+c-Myc基因），
[0013] 小鼠成纖維細(xì)胞一屯、肌細(xì)胞（導(dǎo)入GATA4+Mef2c巧b巧基因），
[0014] 小鼠成纖維細(xì)胞一肝細(xì)胞（導(dǎo)入!1址4〇+(。〇皿1^〇皿2或化皿3)基因），
[0015] 小鼠成纖維細(xì)胞一神經(jīng)干細(xì)胞（導(dǎo)入例如Sox2+FoxGl基因）和小鼠細(xì)胞或人細(xì)胞 ^造血干細(xì)胞。
[0016] 然而，沒有體細(xì)胞直接轉(zhuǎn)化為成骨細(xì)胞的報(bào)導(dǎo)。
[0017]引用列表
[0018] 非專利文獻(xiàn)
[0019] [NPL 1化arner E et al.J Cell Physiol.2009.
[0020] [NPL 2]Li F et al.J Cell Biochem.2010.
[0021] [NPL 3]Biloussova G et al.Stem cells.2011.
[0022] [NPL 4]Tashiro K et al.Stem cells.2009.
[0023] 發(fā)明概述
[0024] 技術(shù)問題
[0025] 本發(fā)明的目標(biāo)是提供制備成骨細(xì)胞的方法，所述成骨細(xì)胞適用于修復(fù)由各種腫 瘤、損傷、手術(shù)等導(dǎo)致的骨缺損W及治療W牙周病、骨折、骨質(zhì)疏松癥等為典型的骨吸收，并 且具有較低的致癌作用風(fēng)險(xiǎn)。
[0026] 解決方案
[0027] 本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在不轉(zhuǎn)化為多能干細(xì)胞，如ES細(xì)胞和細(xì)胞的情況下，可W 通過向哺乳動(dòng)物的體細(xì)胞中導(dǎo)入組合的特異性基因直接獲得成骨細(xì)胞(直接重編程）。
[0028] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，提供了下述成骨細(xì)胞及其制備方法。
[0029] 項(xiàng)1.從哺乳動(dòng)物的體細(xì)胞制備成骨細(xì)胞的方法，所述方法包括向體細(xì)胞中導(dǎo)入重 編程相關(guān)基因或其表達(dá)產(chǎn)物，所述重編程相關(guān)基因包括選自O(shè)ct家族、c-Myc(M)、L-Myc(L)、 化IS家族、Klf家族、Lin-28W及Sox2中的至少一種。
[0030] 項(xiàng)2.從哺乳動(dòng)物的體細(xì)胞制備成骨細(xì)胞的方法，所述方法包括向體細(xì)胞中導(dǎo)入骨 相關(guān)基因或骨相關(guān)基因的表達(dá)產(chǎn)物W及重編程相關(guān)基因或重編程相關(guān)基因的表達(dá)產(chǎn)物，所 述骨相關(guān)基因包括選自Runx2 (R)、0sterix(0)和D1巧（D)的至少一種，所述重編程相關(guān)基 因包括選自O(shè)ct家族、。-]\17(3(]\〇、1-]\17(3化）、化15家族、1(^家族、^11-28和5〇義2中的至少一 種。
[0031] 項(xiàng)3.如項(xiàng)1或項(xiàng)2所述的方法，其中所述體細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞或牙銀細(xì)胞。
[0032] 項(xiàng)4.如項(xiàng)1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述重編程相關(guān)基因或其表達(dá)產(chǎn)物包括 0ct4〇
[0033] 項(xiàng)5.如項(xiàng)4所述的制備成骨細(xì)胞的方法，其中待被導(dǎo)入所述體細(xì)胞的重編程相關(guān) 基因或其表達(dá)產(chǎn)物包括0ct4、0ct化、0ct4M、0ct化M、0ct化Glis巧日Oct化MGlisl之一，其中Μ 代表"c-Myc"，W及L代表"L-Myc"。.
[0034] 項(xiàng)6.如項(xiàng)1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其中待被導(dǎo)入體細(xì)胞的骨相關(guān)基因或骨相關(guān) 基因的表達(dá)產(chǎn)物與重編程相關(guān)基因或重編程相關(guān)基因的表達(dá)產(chǎn)物的組合包括選自下述的 一種組合：0ct4、0ct化MGlisUROD Oct化、畑 Oct化、RO 0ct4ML、D 0ct4ML、R0D 0ct4M、0D Oct化、0 0ct4ML、0 Oct化、0 0ct4M、0D 0ct4、D Oct化、0ct4ML、R0D 0ct4ML、畑 0ct4ML、0D 0ct4ML、0 0ct4MLGlisl、畑 0ct4M、R Oct化 GlisUR 0ct4ML、0D 0ct4M、0 Oct化 Glisl、 ROD 0ct4、R0 0ct4M、R0 0ct4L、R0 0ct4、0 0ct4Glisl、RD 0ct4、0ct4L Glisl、D 0ct4M、D 0ct4Glisl、0 0ct4、0ct化、0ct4M、D 0ct4、R0 0ct4K、R0 0。145〇義2、^及1?0 Oct4Lin28,其 中R代表"Runx2"，0代表"Osterix"，D代表"Dlx5"，M代表"c-Myc" W及L代表"L-Myc"。
[0035] 項(xiàng)7.如項(xiàng)1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其中待被導(dǎo)入體細(xì)胞的骨相關(guān)基因或骨相關(guān) 基因的表達(dá)產(chǎn)物與重編程相關(guān)基因或重編程相關(guān)基因的表達(dá)產(chǎn)物的組合包括選自下述的 一種組合：ROD Oct化、RD Oct化、R0 0ct4ML、D 0ct4ML、R0D 0ct4M、0D Oct化、0 0ct4ML、0 Oct化、0 0ct4M、0D 0ct4、D Oct化W及0ct4ML，其中R代表'書unx2"，0代表"0sterix"，D代表 "Dlx5"，M代表 "c-Myc"，W及L代表 "L-Myc"。
[0036] 項(xiàng)8.如項(xiàng)2或3所述的方法，其中待被導(dǎo)入體細(xì)胞的骨相關(guān)基因或骨相關(guān)基因的表 達(dá)產(chǎn)物與重編程相關(guān)基因或重編程相關(guān)基因的表達(dá)產(chǎn)物的組合包括選自下述的一種組合： ROD Oct化、畑 Oct化、R0 0ct4ML和D 0ct4ML。
[0037] 項(xiàng)9.成骨細(xì)胞，其來源于哺乳動(dòng)物的體細(xì)胞，并且其包括重編程相關(guān)基因或其表 達(dá)產(chǎn)物，所述重編程相關(guān)基因包括選自0ct4、c-Myc(M)、L-Myc(L)、GLIS家族、Klf家族、Lin- 28和Sox2中的至少一種。
[0038] 項(xiàng)10.成骨細(xì)胞，其來源于哺乳動(dòng)物的體細(xì)胞，并且其包括骨相關(guān)基因或骨相關(guān)基 因的表達(dá)產(chǎn)物W及重編程相關(guān)基因或重編程相關(guān)基因的表達(dá)產(chǎn)物，所述骨相關(guān)基因包括選 自Runx2 (R)、0ste;rix(0)和01巧（D)中的至少一種，所述重編程相關(guān)基因包括選自0ct4、 c-Myc(M)、L-Myc(L)、GLIS 家族、Klf 家族、Lin-28 和 Sox2 中的至少一種。
[0039] 本發(fā)明設(shè)及通過導(dǎo)入重編程相關(guān)基因或重編程相關(guān)基因的表達(dá)產(chǎn)物，或者骨相關(guān) 基因或骨相關(guān)基因的表達(dá)產(chǎn)物W及重編程相關(guān)基因或重編程相關(guān)基因的表達(dá)產(chǎn)物，從體細(xì) 胞制備成骨細(xì)胞的技術(shù)。可將選自Runx2 (R)、0sterix(0)和D1巧（D)的至少一種作為那些 基因中的骨相關(guān)基因。所述基因可取地包括Oxterix和D1巧中的至少一種。此外，可將選自 下述基因的至少一種選擇作為重編程相關(guān)基因：0ct4家族、c-Myc(M)、L-Myc(L)、Glis家族、 K1 f 家族化LF1、KLF2、KLF3、KLF4、KLF5、KLF6、KLF7、KLF8、KLF9、KLF10、KLF11、KLF12、KLF13、 KLF14、KLF15、KLF16和KLF17)、Lin-28W及Sox2。所述重編程相關(guān)基因可取地包括0ct4家族 中的至少一種，更可取地包括0ct4家族和L-Myc和/或c-Myc中的至少一種。在0ct4家族中， 0ct4是可取的。因此，所述重編程相關(guān)基因最可取地包括0ct4和L-Myc和/或c-Myc。
[0040] 可與如上文所述相同的方式使用Oct家族的其它基因來代替0ct4。通常，0ct4 可W表示為0ct3/4,但是在本說明中將其表示為"0ct4"。在該說明中，雖然"0ct4"被用于描 述為Oct家族的代表，但是也可與0ct4相同的方式使用Oct家族的其它基因（OctlA和 0ct6)。
[0041 ] 0ct4是用于通過與Sox2、Klf4和c-Myc-起基因?qū)塍w細(xì)胞而重編程體細(xì)胞W誘 導(dǎo)專能性的因子（Tak址ashi K，Yamanaka S.Cell ,126(4) :663-76,2006;Tak址ashi K, Tanabe K,0hnuki M,Narita M,Ichisaka T,Tomoda K,Yamanaka S.Cell.131(5):861-72, 2007)。已知將GATA3、GATA6、S0X7、PAXl、GATA4、CEBPa、HNF4a、GRB2等中的任何一種而非 0ct4與Sox2、Klf4和c-Myc-起基因?qū)塍w細(xì)胞能夠重編程體細(xì)胞W誘導(dǎo)專能性（Shu et al.Cell 153:963,2013)。在本發(fā)明中也可W使用既非重編程因子又不屬于Oct家族但是可 W具有可替代重編程中的Oct的功能的因子來代替0ct4,所述因子如GATA3、GATA6、S0X7、 PAX1、GATA4、CEBPa、HNF4a和GRB2。換言之，在該說明中，術(shù)語"Octr被用于描述為能夠具有 重編程中的0ct4的功能的代表性因子，但是也可與0ct4相同的方式使用具有可替代重 編程中的 Oct 的功能的因子，如:GATA3、GATA6、S0X7、PAX1、GATA4、CEBPa、HNF4a 和 GRB2。
[0042] 也可 W 用 Klf 家族的任何其它基因化 LF1、KLF2、KLF3、KW5、KLF6、KLF7、KLF8、 化尸9、化尸10、化尸11、化尸12、化尸13、化尸14、化尸15、化尸16或化尸17)來替代化尸-4。在該說明中， 術(shù)語"KLF-4"被用于描述為Klf家族的代表，但是也可W W與KLF-4相同的方式使用Klf家族 的其它基因。
[0043] 作為化IS家族，給出了化IS1 (化IS家族鋒指1)等。
[0044] 作為可W具有可替代體細(xì)胞的重編程(iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)）中的KLF-4的功能的基因， 已知的不僅有KLF家族的基因，還有例如IRX家族的成員（如IRX6 (易洛魅（iroquois)同源 框蛋白6))、ΡΤΧ家族成員（如PITX2 (成對(duì)樣同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子2))W及DMRTB1 (具有富 含脯氨酸的C末端1的DMRT樣家族BKW02010/098419 (2010年9月2日））。在該說明中，術(shù)語 "KLF-4"被用于描述，但是可與KLF-4相同的方式使用可具有可替代在體細(xì)胞的重編程 (iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)）中的KLF-4的功能的基因。也可W使用那些基因的產(chǎn)物，即mRNA。
[0045] 可與S0X2相同的方式使用SOX家族的其它基因來代替S0X2。在該說明中，術(shù)語 "S0X2"被用于描述為SOX家族的代表，但是也可與S0X2相同的方式使用SOX家族的其它 基因。
[0046] 在本發(fā)明中，為方便起見，所有基因都被稱作S0X2。
[0047] 可將骨相關(guān)基因和重編程相關(guān)基因的表達(dá)產(chǎn)物用作代替骨相關(guān)基因和重編程相 關(guān)基因中的一種或多種的替代物。此外，可W將能夠誘導(dǎo)或模擬基因的分子試劑等用作代 替骨相關(guān)基因和重編程相關(guān)基因中的一種或多種的替代物。作為可W具有可替代iPS細(xì)胞 的誘導(dǎo)中的0ct4的功能的基因，已知的有，例如GATA3、GATA6、S0X7、PAXl、GATA4、CEBPa、 HNF4a 和 GRB2 (Jian aiu et al.，Cell 153,963-975,2013)，因此可 W 使用此類化合物來 代替導(dǎo)入0ct4基因。作為可W具有可替代神經(jīng)前體細(xì)胞的重編程中的0ct4的功能的小分子 化合物，BIX-01294是已知的（Bo Feng et al.，Cell Stem Cell 4:301,2009)，因此可W使 用此類化合物來代替導(dǎo)入0ct4基因。作為可W具有可替代細(xì)胞的誘導(dǎo)中的Klf-4的功能 的化合物，ke叩aullone是已知的化yssiotis,CA,et al.Jroc 化tl Acad Sci U S A. 2009化ne 2:106(22) :8912-8917.)，因此可W使用此類化合物來代替導(dǎo)入Klf-4基因。在 該說明中，為了方便起見，有時(shí)將基因和其表達(dá)產(chǎn)物統(tǒng)稱為"基因"。在此類情況下，術(shù)語"導(dǎo) 入基卸'被術(shù)語"添加分子'、"添加藥物'、"添加化合物"、"施用分子'、"施用藥物"、"施用化 合物"等替代。
[004引還可W向本發(fā)明的基因組合中添加其它基因。
[0049] 本發(fā)明包括從體細(xì)胞誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的方法。本發(fā)明還包括通過所述方法制備的成 骨細(xì)胞。本發(fā)明還包括用于治療的細(xì)胞制備物，其包括成骨細(xì)胞或包含成骨細(xì)胞的移植材 料。
[0050] 當(dāng)將該技術(shù)應(yīng)用于體內(nèi)的體細(xì)胞時(shí)，可W在體內(nèi)直接產(chǎn)生成骨細(xì)胞。本發(fā)明還包 括該方法和用于直接誘導(dǎo)的制備物。
[0051] 發(fā)明的有益效果
[0052] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，可W通過直接重編程在短期內(nèi)由體細(xì)胞提供成骨細(xì)胞。 可W由待移植的個(gè)體的體細(xì)胞容易地誘導(dǎo)成骨細(xì)胞。因此，即使當(dāng)移植成骨細(xì)胞自身或由 細(xì)胞制備的骨組織時(shí)，也不會(huì)發(fā)生如免疫排斥反應(yīng)的問題。此外，在不轉(zhuǎn)化為iPS細(xì)胞或ES 細(xì)胞的情況下，可W由體細(xì)胞直接誘導(dǎo)成骨細(xì)胞，因此可W避免由多能干細(xì)胞導(dǎo)致的如致 癌作用的問題。
[0053] 附圖簡要說明
[0054] 圖1為編碼目的基因的pMXs載體的制備的圖示。
[0055] 圖2為實(shí)驗(yàn)提綱的圖示。
[0056] 圖3A為茜素紅S染色的結(jié)果。圖3A為皿的肉眼圖(macrogra地）。巧化的骨基質(zhì)被染 成紅色，運(yùn)表明功能性成骨細(xì)胞被誘導(dǎo)。對(duì)于孔的數(shù)量參見圖3H(圖3H的表中的數(shù)字"Γ表 示用含有各自基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染，W及空白表示未用含有各自基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒 載體感染）。
[0057] 圖3B為茜素紅S染色的結(jié)果。圖3B為皿的肉眼圖。巧化的骨基質(zhì)被染成紅色，運(yùn)表 明功能性成骨細(xì)胞被誘導(dǎo)。對(duì)于孔的數(shù)量參見圖3H(圖3H的表中的數(shù)字"Γ表示用含有各自 基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染，W及空白表示未用含有各自基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染）。 [005引圖3C為茜素紅S染色的結(jié)果。圖3C為皿的肉眼圖。巧化的骨基質(zhì)被染成紅色，運(yùn)表 明功能性成骨細(xì)胞被誘導(dǎo)。對(duì)于孔的數(shù)量參見圖3H(圖3H的表中的數(shù)字"Γ表示用含有各自 基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染，W及空白表示未用含有各自基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染）。
[0059] 圖3D為茜素紅S染色的結(jié)果。圖3D為皿的肉眼圖。巧化的骨基質(zhì)被染成紅色，運(yùn)表 明功能性成骨細(xì)胞被誘導(dǎo)。對(duì)于孔的數(shù)量參見圖3H(圖3H的表中的數(shù)字"Γ表示用含有各自 基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染，W及空白表示未用含有各自基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染）。
[0060] 圖3E為茜素紅S染色的結(jié)果。圖3E為皿的肉眼圖。巧化的骨基質(zhì)被染成紅色，運(yùn)表 明功能性成骨細(xì)胞被誘導(dǎo)。對(duì)于孔的數(shù)量參見圖3H(圖3H的表中的數(shù)字"Γ表示用含有各自 基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染，W及空白表示未用含有各自基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染）。
[0061] 圖3F為茜素紅S染色的結(jié)果。圖3F為皿的肉眼圖。巧化的骨基質(zhì)被染成紅色，運(yùn)表 明功能性成骨細(xì)胞被誘導(dǎo)。對(duì)于孔的數(shù)量參見圖3H(圖3H的表中的數(shù)字"Γ表示用含有各自 基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染，W及空白表示未用含有各自基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染）。
[