穩(wěn)定fsh的制作方法
【專利說明】穩(wěn)定FSH
[0001] 本申請是國際申請?zhí)朠CT/EP2011/062986,國際申請日2011年7月28日，中國申 請?zhí)?01180037221. 0,發(fā)明名稱為"穩(wěn)定FSH"的分案申請。 發(fā)明領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明總體涉及穩(wěn)定FSH制劑的領(lǐng)域，具體地涉及穩(wěn)定液體FSH制劑的領(lǐng)域。通過 加入鹽，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過加入具有藥用鹽的堿金屬陽離子的鹽，即Na-鹽或K-鹽 或其組合來實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定。
[0003] 背景
[0004] 促性腺激素是這樣的激素家族，其基本上主要涉及雌性和雄性中的生育周期。促 性腺激素可以來自尿液，用于研究和治療目的，然而一些促性腺激素也可以重組產(chǎn)生。
[0005] 具體地，促性腺激素可以用于治療不育。
[0006] 本文涉及并且都屬于相同糖蛋白家族的四種主要的促性腺激素是促卵泡激素 (FSH)、促甲狀腺激素（TSH)、黃體生成素（LH)和絨毛膜促性腺激素（hCG)。所有這些促性 腺激素由a和0亞基組成；a亞基是所有促性腺激素共有的，即對于所有上述四種促性 腺激素是相同，而0亞基則在每一種中是不同的。
[0007] 如上提及，促性腺激素是一組異源二聚糖蛋白激素，其調(diào)節(jié)雄性和雌性中的性腺 功能。它們包括促卵泡激素（FSH)、黃體生成素（LH)、促甲狀腺激素（TSH)和（人）絨毛膜 促性腺激素（hCG)
[0008] FSH天然由垂體前葉分泌并且功能是支持卵泡發(fā)育和排卵。FSH包括92個(gè)氨基 酸a亞基（也是其他糖蛋白激素例如LH和hCG共有的），和FSH獨(dú)有的111個(gè)氨基酸的 0 亞基，其賦予激素生物學(xué)特異性（Pierce 和 Parsons，1981，Glycoprotein hormones: structure and function (糖蛋白激素：結(jié)構(gòu)和功能），Ann Rev Biochem.，50:465_495)〇 每個(gè)亞基通過加入復(fù)合碳水化合物殘基來翻譯后修飾。兩個(gè)亞基攜帶用于N-連接聚糖連 接的兩個(gè)位點(diǎn)，a亞基在氨基酸52和78處而0亞基在氨基酸殘基7和24處（Rathnam 和 Saxena， (1975)Primary amino acid sequence of follicle-stimulating hormone from human pituitary glands. I. alpha subunit (來自人垂體的促卵泡激素的一級氨 基酸序列.L a 亞基），J Biol Chem(生物化學(xué)雜志）.250(17) :6735-6746;Saxena和 Rathnam， (1976)Amino acid sequence of the beta subunit of follicle-stimulating hormone from human pituitary glands (來自人垂體的促卵泡激素的0亞基的氨基酸 序列），181〇10^111(生物化學(xué)雜志）.251(4):993-1005))。因此？311被糖基化至約30 質(zhì)量％ (Dias 和 Van Roey, (2001) Structural biology of human follitropin and its receptor(人促濾泡素及其受體的結(jié)構(gòu)生物學(xué)）.Arch Med Res. 32(6) :510_519;Fox等 (2001) Three-dimensional structure of human follicle-stiumulating hormone (人促 卵泡激素的三維結(jié)構(gòu)）.Mol Endocrinol. 15 (3)，379-89) ?
[0009] 從更年期后人尿液中純化的FSH已經(jīng)在不育治療中使用了許多年；同時(shí)在自然生 殖中促進(jìn)排卵并且提供卵母細(xì)胞用于輔助生殖技術(shù)。FSH的兩種重組形式，Gonal-F(Merck Serono)和Puregon (Schering-Plough)在90年代中期是可獲得的。這些都在中國倉鼠卵巢 (CH0)細(xì)胞中表達(dá)（Howies，C.M. (1996)，genetic engineering of human FSH(Gonal-F)) (人 FSH(Gonal-F)的遺傳改造），Hum R印rod (人類生殖）?Update，2 :172-191)。CG 通常 用于不育治療，因?yàn)樵摶衔锞哂蠰H活性。
[0010] 人FSH和hCG都是由a亞基和0亞基組成的異源二聚體。在兩種激素中a亞 基是相同的。0亞基賦予兩種激素之間的差異。FSH的成熟0亞基由111個(gè)氨基酸組成， 而hCG的成熟0亞基由145個(gè)氨基酸組成，另外，F(xiàn)SH和hCGP亞基的一級氨基酸序列在 整個(gè)0鏈都是不同的。FSH和hCG兩者的0鏈都包含6個(gè)二硫鍵，然而由于它們不同的氨 基酸序列，它們確實(shí)在它們的更高級結(jié)構(gòu)上不同，導(dǎo)致了帶電、極性和疏水區(qū)域的不同折疊 和分布（Fox 等（2001) ? Three dimensional structure of human follicle-stimulating hormone (人促卵泡激素的三維結(jié)構(gòu)）.Mol Endocrinol. 15 (3)，379-89)
[0011] 盡管FSH和hCG的亞基都是糖基化的，F(xiàn)SH的亞基僅包含N-糖基化（N-7和 N-24)，而 hCG 的 0 亞基包含 N-和 0-糖基化（113，^30,0-121，0-127,0-132 和0-138)。 在hCG的0亞基中的額外糖基化使得其比FSH的0亞基更疏水。0亞基提供受體相互作 用的特異性。
[0012] CH0細(xì)胞通常用于制備藥物重組蛋白。結(jié)構(gòu)分析已經(jīng)鑒定唾液酸僅通過a 2,3_連 接相連。許多人糖蛋白包含唾液酸殘基的a 2, 3-和a 2,6-連接的混合物。因此，使用CH0 系統(tǒng)表達(dá)的重組蛋白在其末端唾液酸連接的類型上與它們的天然對應(yīng)物不同。
[0013] 不育
[0014] 在本發(fā)明的語境中，"不育"應(yīng)該被限定為懷孕和生育后代的能力減少或沒有。能 夠懷孕但是重復(fù)流產(chǎn)的婦女也被認(rèn)為是不育的。不育在專用名詞上也被定義為無避孕的規(guī) 律性交一年懷孕失敗。不育是由很多原因造成的。研究已經(jīng)顯示半數(shù)多一點(diǎn)的不育病例是 由女性疾病導(dǎo)致的。剩余的由精液疾病以及不可解釋的因素所導(dǎo)致。
[0015] 目前存在治療不育的一些可能性。
[0016] 那些可能性是定時(shí)的性交，使用輔助生殖技術(shù)（ARTs)，子宮內(nèi)膜異位、纖維瘤和女 性性功能障礙（FSD)的醫(yī)藥處理，以及外科手術(shù)來校正異常。
[0017] 在輔助生殖技術(shù)中，使用刺激排卵的藥物。在LH和hCG之后，F(xiàn)SH是用于該用途 的那些化合物之一。
[0018] 對于施用，這些化合物的液體制劑是適合的。不幸的是，在過去已經(jīng)顯示，加 入液體制劑的防腐劑，具體地，芐醇（BA)、苯酚和間甲酚對于蛋白施加去穩(wěn)定的作用 (Maa, Y. F.和 Chung，C. H. 1996，Aggregation of recombinant human growth hormone induced by phenolic compounds(由酸類化合物誘導(dǎo)的重組人生長激素的聚集）.Int. J. Pharm. 140 :155-168 ;Lam，X. M.，Patapoff，T. W?，和 Nguyen，T. H. 1997，The effect of benzyl alcohol on recombinant human interferon-gamma (節(jié)酉享對于重組人 y -干擾素 的作用）? Pharm. Res. 14 :725-729 ;Hoffmann，J. A?和 Lu，J. 2002, FSH and FSH variant formulations comprising benzyl alcohol as a preservative (包含節(jié)醇作為防腐劑的 FSH 和 FSH 變體）? EP0974359B1，1-50)。
[0019] 因此重要的是提供穩(wěn)定的制劑，尤其鑒于待施用的FSH的劑量應(yīng)該減少解離或聚 集形式副作用如免疫原性反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)（如果非天然FSH存在的話）。然而由防腐劑導(dǎo)致的 不穩(wěn)定事件減少了在液體制劑中的活性促性腺激素，即FSH的實(shí)際水平。
[0020] 因此，本發(fā)明的目的是提供穩(wěn)定的FSH制劑，尤其是液體制劑，以及穩(wěn)定它們的方 法。
[0021] 發(fā)明概述
[0022] 本發(fā)明涉及使用用于穩(wěn)定液體FSH制劑的包含藥用堿金屬陽離子的鹽以穩(wěn)定液 體FSH制劑。待穩(wěn)定的液體制劑可以是含有或不含防腐劑的制劑。
[0023] 優(yōu)選下述實(shí)施方案：
[0024] 1.包含藥用堿金屬陽離子的鹽用于穩(wěn)定液體FSH制劑的用途，其中所述鹽選自由 藥用Na +鹽和K +鹽或其組合組成的組。
[0025] 2.根據(jù)項(xiàng)目1的用途，其中所述鹽是Na+鹽。
[0026] 3.根據(jù)項(xiàng)目1或2任一項(xiàng)的用途，其中所述鹽是NaCl或Na2S04。
[0027] 4.根據(jù)項(xiàng)目1或2任一項(xiàng)的用途，其中所述鹽是Na2S04。
[0028] 5.根據(jù)項(xiàng)目1或2任一項(xiàng)的用途，其中所述鹽是NaCl和.304的組合。
[0029] 6.根據(jù)項(xiàng)目1-5中任一項(xiàng)的用途，其中以20-500mM的量，或30-300mM的量或 50-200mM的量包含所述鹽。
[0030] 7.根據(jù)項(xiàng)目1-6中任一項(xiàng)的用途，其中所述FSH制劑是rFSH制劑。
[0031] 8.根據(jù)項(xiàng)目1-7中任一項(xiàng)的用途，其中所述制劑還包含防腐劑。
[0032] 9.根據(jù)項(xiàng)目8的用途，其中所述制劑包含芐醇、苯酚和/或間甲酚。
[0033] 10.根據(jù)項(xiàng)目1-9中任一項(xiàng)的用途，其中所述制劑是可注射制劑。
[0034] 11.用于穩(wěn)定液體FSH制劑的方法，其中所述方法包括將包含藥用堿金屬陽離子 的鹽加入所述制劑中的步驟，其中所述鹽選自由Na +鹽和K +鹽或其組合組成的組。
[0035] 12.根據(jù)項(xiàng)目11的方法，其中所述鹽如上述2-6定義。
[0036] 13.根據(jù)項(xiàng)目11和/或12的方法，其中所述待穩(wěn)定的FSH是rFSH。
[0037] 14.根據(jù)項(xiàng)目11-13中任一項(xiàng)的方法，其中所述制劑還包含防腐劑。
[0038] 15.根據(jù)項(xiàng)目14所述的方法，其中所述防腐劑選自由芐醇、苯酚和間甲酚組成的 組。
[0039] 16.根據(jù)項(xiàng)目1-10中任一項(xiàng)的用途，其中所述液體制劑是重構(gòu)的液體制劑，其獲 自凍干的制劑。
[0040] 17.項(xiàng)目11-15中任一項(xiàng)的方法，其中所述加入鹽的步驟在凍干步驟之前進(jìn)行。
[0041] 18.項(xiàng)目17的方法，其中重構(gòu)步驟在所述凍干步驟之后進(jìn)行。
[0042] 19.項(xiàng)目17和/或項(xiàng)目18的方法，其中所述鹽包含在凍干制劑中或其中所述鹽包 含在重構(gòu)液體中。
[0043] 提供有穩(wěn)定鹽的制劑因此是以凍干狀態(tài)貯存的備選實(shí)施方案。凍干以本領(lǐng)域技術(shù) 人員通常所知的方式進(jìn)行。接著可以貯存凍干制劑直到最終用于患者。在施用前，接著將 凍干制劑與任一種已知的重構(gòu)介質(zhì)，例如無菌水重構(gòu)。鹽包含在凍干制劑中或包含在重構(gòu) 液體中。
[0044] 20.上述項(xiàng)目中任一項(xiàng)的用途或方法，其中所述液體制劑是單次用制劑或多劑量 制劑，優(yōu)選地用于注射。
[0045] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，鹽包含在液體中，所述液體制劑本身不是凍干的而是在貯 存中作為液體保存。
[0046] 具體地，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及液體FSH制劑的穩(wěn)定，其中所述堿金屬 陽離子選自由Na +和K +組成的組。特別優(yōu)選的，所述鹽是NaCl或Na 2S04。
[0047] 如上所述，液體FSH制劑適合用于治療不育。在該方面，清楚的是，液體FSH制劑 可以是不穩(wěn)定的；對于包括用于單次使用的那些在內(nèi)的所有液體FSH制劑，這是真實(shí)的。如 果液體FSH制劑包括防腐劑（例如這對于所有多劑量制劑是必須的），那么不穩(wěn)定性甚至可 能是更顯著的。該防腐劑可以是每一種用于保存FSH制劑的防腐劑，因此，防腐劑可以是由 FDA批準(zhǔn)的用于FSH制劑的防腐劑，具體地，例如批準(zhǔn)用于腸胃外FSH制劑的FDA批準(zhǔn)的防 腐劑，如例如芐醇，苯酚和/或間甲酚；然而防腐劑絕不限于那些實(shí)例。FSH的穩(wěn)定性例如 被芐醇、苯酚和/或間甲酚減少。
[0048] 因此，本發(fā)明要求保護(hù)和描述的包含藥用陽離子的鹽用于穩(wěn)定單次用FSH制劑。
[0049] 此外，本發(fā)明要求保護(hù)和描述的包含藥用陽離子的鹽，用于穩(wěn)定多劑量的FSH制 劑；所述制劑不需要包含防腐劑但是也可以包含防腐劑。
[0050] 加入本發(fā)明要求保護(hù)的包含藥用陽離子的鹽，即Na+和K +鹽，穩(wěn)定液體FSH制劑。 在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述鹽是藥用鹽。在單次用或多劑量制劑中尤其在較長的貯存 時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定，并且在又一個(gè)可能的實(shí)施方案中，作為防腐劑（如芐醇、苯酚和/或間甲 酚）的去穩(wěn)定作用的反措施可以是有利的。
[0051] 可以根據(jù)本發(fā)明使用的鹽，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，包括NaCl或Na2S0 4。
[0052] 優(yōu)選地以20-500mM的量包含鹽，甚至更優(yōu)選地以30-300mM的量包含鹽；在特別優(yōu) 選的實(shí)施方案中，以50-200mM的量包含鹽。
[0053] 加入的鹽的最大量被限于溶液摩爾滲透壓濃度。為了使注射后的疼痛最小，溶液 應(yīng)該優(yōu)選是等滲的或至少不是高滲的。由于在溶液中所有賦形劑都對摩爾滲透壓濃度有貢 獻(xiàn)，所以可以加入溶液的鹽的最大量依賴于其它存在的成分的量。
[0054] 優(yōu)選以導(dǎo)致350m〇sm〇l/kg的最大摩爾滲透壓濃度的量包含鹽，甚至更優(yōu)選的以 導(dǎo)致320mosmol/kg的最大摩爾滲透壓濃度的量包含鹽；在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，以導(dǎo)致 300mosmol/kg的最大摩爾滲透壓濃度的量包含鹽。
[0055] 摩爾滲透壓濃度理論
[0056] 摩爾滲透壓濃度是一種實(shí)用手段，其給出對存在于溶液中的各種溶質(zhì)對溶液滲透 壓的貢獻(xiàn)的全面測量。摩爾滲透壓濃度可以根據(jù)Ph. Eur. 2. 2. 35,第7版，增刊2011 (7, 2)， Osmolality (摩爾滲透壓濃度），01/2008 :20235進(jìn)行測量。
[0057] 在本發(fā)明的語境中，"鹽"是通過用金屬或帶正電的原子團(tuán)完全或部分取代氫而從 酸衍生的化學(xué)化合物。
[0058] "具有（或包含）藥用鹽的陽離子的鹽"的定義指所有那些與根據(jù)FDA無活性成 分列表批準(zhǔn)用于肌內(nèi)或皮下遞送的陽離子形成的鹽；該組的堿金屬陽離子是鈉（Na +)和鉀 00。
[0059] 發(fā)明人已經(jīng)令人驚奇地發(fā)現(xiàn)兩個(gè)非常特異性的陽離子特別適合于穩(wěn)定FSH制劑。
[0060] 鹽可以因此與下述藥用陽離子形成：鉀（一元、二元或三元），或鈉（一元、二元或 三元）。優(yōu)選地，所述鹽是鈉鹽。
[0061] 特別優(yōu)選的是NaCl和Na2S04。
[0062] 可以根據(jù)本發(fā)明穩(wěn)定的促性腺激素是FSH，即促卵泡激素，其任選與其他活性