列根據(jù)其對(duì)蛋白 溶解度和穩(wěn)定性的一般作用對(duì)鹽進(jìn)行分級(jí)），kosmotropic陰離子如硫酸鹽通常穩(wěn)定蛋白 (產(chǎn)生更高的TJ，而離液陰離子如高氯酸鹽則對(duì)蛋白進(jìn)行去穩(wěn)定（產(chǎn)生更低的TJ。在該 研究中，具有相同陽(yáng)離子的所有測(cè)試的陰離子顯示在rFSH變性溫度上的相似增加。與白 Hofmeister系列的預(yù)期完全相反，高氯酸離子的鹽顯示在rFSH變性溫度上的最大增加。
[0256] 換言之，在加入鹽之后觀察到的穩(wěn)定作用（即rFSH 增加）完全獨(dú)立于測(cè)試的 陰離子。鈉鹽和鉀鹽顯示特別大的穩(wěn)定作用。尤其是將高氯酸鈉加入rFSH溶液導(dǎo)致rFSH 變性溫度的巨大增加。然而，高氯酸鹽通常是高度反應(yīng)性的，并且是氧化劑，并且因此沒有 批準(zhǔn)將高氯酸鹽作為藥物制劑中的非活性成分。
[0257] 在加入鹽后獲得的rFSH的預(yù)料之外的穩(wěn)定作用不能通過在rFSH的糖結(jié)構(gòu)部分上 存在唾液酸來解釋。對(duì)去唾液酸化的rFSH的rFSH變性溫度確定顯示與未修飾的rFSH相 同的在加入鹽后對(duì)rFSH穩(wěn)定作用的趨勢(shì)。
[0258] 實(shí)施例3-關(guān)于rFSH溶液的實(shí)時(shí)穩(wěn)定性
[0259] 研究目的
[0260] 本研究的目的是確定各種制劑中的rFSH的實(shí)時(shí)穩(wěn)定性是否遵循與下述相同的趨 勢(shì)：如在通過如實(shí)施例2中所述的液體DSC測(cè)量rFSH變性溫度中所觀察到的，以及如在實(shí) 施例1中所述的如用CD光譜測(cè)量的在加熱后rFSH二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。在該研究中確定了通 過rFSH解離為其單體的傾向測(cè)量的rFSH在貯存過程中的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。
[0261] 在長(zhǎng)期5±3°C /環(huán)境RH以及加速的30±2°C /65±5% RH條件下達(dá)6-12個(gè)月， 研究在兩個(gè)不同的貯存溫度貯存后rFSH 600IU/ml制劑的穩(wěn)定性。將所有小瓶倒置貯存。 將含有相應(yīng)制劑但不沒有加入rFSH的對(duì)照劑對(duì)照在如對(duì)于活性rFSH所述的相同條件下貯 存。
[0262] 待研究的產(chǎn)品
[0263] 批次信息
[0264] rFSH，藥物物質(zhì)批號(hào) 08800060 和批號(hào) 09800020 由 Bio-Technology General (BTG)，Israel 生產(chǎn)
[0265] 上述rFSH批次的生物學(xué)活性的確定根據(jù)Ph. Eur.進(jìn)行
[0266] 材料
[0267] 賦形劑
[0268] 在表14中描述在該研究中使用的賦形劑列表。
[0269] 表14 :賦形劑列表
[0270]
[0271] 容器和密封系統(tǒng)
[0272] 所用的主要包裝材料在表15中列出。
[0273] 表15:容器/密封系統(tǒng)
[0274]
[0275] rFSH儲(chǔ)液和不同的制劑（rFSH和對(duì)照劑）的組成在表16、表17和表18中列出。 除了不含有任何穩(wěn)定劑/張性劑的制劑之外，調(diào)節(jié)穩(wěn)定劑/張性劑的濃度以提供等滲溶液。
[0276] 表16 :rFSH儲(chǔ)液的組成
[0277]
[0278] 表17 :rFSH制劑的組成
[0279]
[0280] *pH指最終溶液的pH
[0281] 表18對(duì)照劑制劑的組成
[0282]
[0284] *pH指最終溶液的pH
[0285] 制備方法
[0286] 在 Ferring Pharmaceuticals A/S，Copenhagen，Denmark 以實(shí)驗(yàn)室規(guī)模制備所有 的溶液（表17和表18)。如下總結(jié)制備方法。
[0287] 制備rFSH和對(duì)照劑制劑
[0288] 在Mi 11 i-Q水中制備所有賦形劑的儲(chǔ)液。
[0289] 對(duì)于制備對(duì)照劑制劑，將每種賦形劑的儲(chǔ)液混合以獲得在表18中給出的濃度。在 稀釋到體積之前，如果必要，調(diào)節(jié)每種制劑的pH。
[0290] 對(duì)于制備rFSH制劑，從每種賦形劑的儲(chǔ)液制備稀釋溶液。調(diào)節(jié)稀釋溶液的pH。將 稀釋溶液與rFSH儲(chǔ)液（見表16)混合以產(chǎn)生在表17中列出的最終濃度。
[0291] 無菌過濾和無菌填充
[0292] 使用0? 22 ym PVDF濾器（Millipore)無菌過濾最終制劑。使用Stericup濾器將 對(duì)照劑制劑無菌過濾到高壓滅菌的玻璃瓶中。使用Sterivex-GV濾器和無菌的20ml Luer Lock注射器（Braun)將rFSH制劑無菌過濾到高壓滅菌的玻璃大口杯中。使用高壓滅菌 的小瓶和橡膠塞在LAF臺(tái)中進(jìn)行無菌過濾、填充和密封小瓶。在填充之前和之后，用通過 0. 20 y m Millex-FGPFTE濾器（Millipore)的氮?dú)鉀_洗小瓶至少6秒。以1. 5ml樣品/小 瓶填充小瓶。對(duì)所有的小瓶進(jìn)行無菌填充并且立即用橡膠塞和鋁制flip-off蓋密封。
[0293] 貯存條件
[0294] 將包含rFSH 600IU/ml和對(duì)照劑的樣品在5±3°C /環(huán)境RH貯存6-18個(gè)月。此 外，在加速的條件，30±2°C /65±5% RH將樣品貯存6-18個(gè)月。在每個(gè)貯存溫度，將小瓶倒 置貯存。避光保存所有的小瓶。
[0295] 穩(wěn)定性程序
[0296] rFSH 600IU/ml和對(duì)照劑的穩(wěn)定性程序描述在下述表19中。
[0297] 表19 :倒置貯存的rFSH液體制劑600IU/ml和對(duì)照劑的穩(wěn)定性程序 [02981
[0299] -根據(jù)穩(wěn)定性程序計(jì)劃的，沒有測(cè)試
[0300] *僅對(duì)一些制劑測(cè)試
[0301] 分析方法
[0302] 在該研究中使用的分析方法在下面描述。在每個(gè)測(cè)試情形，對(duì)于每種制劑分析2 瓶rFSH和1瓶相應(yīng)的對(duì)照劑。
[0303] 低分子量（LMW)形式
[0304] 通過在大小排阻（SEC)柱上利用等度洗脫的LC-UV確定rFSH的LMW形式。使用 基于硅的柱子用TRIS緩沖液作為移動(dòng)相和UV檢測(cè)進(jìn)行分析。rFSH的LMW形式是具有比 rFSH主峰的分子量更低（在之后）的分子量的洗脫峰。將LMW形式確定為總峰面積的百分 比峰面積。
[0305] 對(duì)于包含防腐劑的樣品，在進(jìn)入大小排阻柱之前，將防腐劑從樣品溶液中去除。
[0306] 結(jié)果和討論
[0307] rFSH在貯存過程中的解離
[0308] 由于非共價(jià)偶聯(lián)的單體解離后rFSH失去其生物活性，所以追蹤由于單體解離導(dǎo) 致的rFSH活性喪失的直接方法是測(cè)量溶液中的rFSH LMW形式的量。該信息可以由SEC色 譜法重新獲得，其中已知在rFSH主峰之后的LMW形式的洗脫峰來自解離的rFSH。
[0309] 表20 :在30±2°C /65±5% RH貯存后通過SEC確定的LMW形式的rFSH相對(duì)量 (% )。所有制劑的完全描述在表17中列出。
[0310]
[0311] N.P.未進(jìn)行.
[0312] 表21 :在5±3°C /環(huán)境RH貯存后通過SEC確定的LMW形式的rFSH相對(duì)量（％ )。 所有制劑的完全描述在表17中列出。
[0313]
[0314] N.P.未進(jìn)行.
[0315] 如可從表20中所見，含有不同穩(wěn)定劑、添加和不添加防腐劑的新鮮制備的rFSH溶 液顯示類似相對(duì)量的解離的rFSH(LMff形式）。由于SEC方法的定量限制是3%，所以在該 限制以下不能進(jìn)行制劑之間的明確區(qū)分，意味著在起始時(shí)間點(diǎn)觀察到的LMW形式的差異在 方法變化的限制內(nèi)。
[0316] 在30 ± 2 °C /65 ± 5 % RH貯存一個(gè)月后，對(duì)于含有苯酚以及蔗糖但是無穩(wěn)定劑的樣 品，解離的rFSH的相對(duì)量增加，而包含硫酸鈉或氯化鈉的樣品并未顯示在解離的rFSH上的 任何顯著增加（見表20)。
[0317] 在30±2°C /65±5% RH貯存六個(gè)月后，苯酚而未添加穩(wěn)定劑的rFSH樣品包含超 過20%的解離的沖311仏麗形式）。包含苯酚、具有蔗糖作為穩(wěn)定劑的沖311樣品也顯示解 離的rFSH的顯著增加（超過10%的解離的rFSH)，而包含苯酚、被用氯化鈉或硫酸鈉穩(wěn)定 的樣品僅顯示在解離的rFSH上的微小增加（見表20)。在貯存過程中，不包含任何防腐劑 的樣品針對(duì)解離是最穩(wěn)定的；然而對(duì)于目標(biāo)在腸胃外使用的水性多劑量制劑，需要加入防 腐劑，因此這種制劑僅加入作為比較。
[0318] 在5±3°C /環(huán)境RH貯存六個(gè)月后，測(cè)試的rFSH制劑沒有顯示在解離的rFSH相 對(duì)量上的增加（見表21)?？墒?，在5°C至少貯存24個(gè)月和伴隨的在室溫貯存1個(gè)月，優(yōu)選 3-4個(gè)月，是rFSH的商業(yè)產(chǎn)品成功所需要的。
[0319] rFSH變性溫度，二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化和解離的程度
[0320] 由于該實(shí)施例的目的是確定實(shí)時(shí)穩(wěn)定性研究數(shù)據(jù)、通過DSC的rFSH變性溫度測(cè)定 和通過CD光譜、部分DSC數(shù)據(jù)（見實(shí)施例2)和部分CD數(shù)據(jù)（見實(shí)施例1)(如以下列出 的）測(cè)定的rFSH二級(jí)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性，。在實(shí)施例2中給出關(guān)于顯示的DSC結(jié)果的 所有詳情，并且在實(shí)施例1中給出關(guān)于CD數(shù)據(jù)的詳情。
[0321] 表22 :在30±2°C /65±5% RH貯存6個(gè)月后通過SEC確定的LMW形式的rFSH相 對(duì)量（％ )和如通過DSC測(cè)量的rFSH變性溫度。在DSC研究中，與在表中給出的實(shí)時(shí)穩(wěn) 定性研究中所用的量比較，所有測(cè)試溶液的穩(wěn)定劑的濃度保持在〇. 1M。
[0322]
[0323] 如可從表22中看出，在30±2°C /65±5% RH貯存6個(gè)月后，通過DSC獲得的rFSH 變性溫度與實(shí)時(shí)穩(wěn)定性數(shù)據(jù)良好相關(guān)，對(duì)于重組抗體和重組糖蛋白之前已經(jīng)提出了 DSC和 如通過SEC分析的實(shí)時(shí)穩(wěn)定性之間的類似相關(guān)（見例如.Burton等（2007)，Pharm. Dev. Technol. 12 :265-273 和 Remmele 等（1998)，Pharm. Res. 15 :200-208)。未加入防腐劑、用 硫酸鈉穩(wěn)定的rFSH溶液在6個(gè)月貯存后僅顯示低程度的解離的rFSH，與包含防腐劑的溶液 相比其還顯示顯著更高的變性溫度。還進(jìn)一步觀察到，與包含蔗糖或不包含穩(wěn)定劑的溶液 相比，在6個(gè)月的貯存后，對(duì)于包含防腐劑（苯酚）的溶液，加入鹽，氯化鈉或硫酸鈉，產(chǎn)生 明顯更低程度的解離的rFSH。與包含鹽的溶液的rFSH 相比，未加入穩(wěn)定劑的rFSH的變 性溫度也明顯更低。尚未確定包含蔗糖、添加有苯酚的溶液的rFSH變性溫度，然而，如可從 表23中觀察到的，在30±2°C /65±5% RH貯存6個(gè)月后，對(duì)未添加防腐劑的溶液的rFSH 1進(jìn)行測(cè)量，顯示與實(shí)時(shí)穩(wěn)定性數(shù)據(jù)相同的趨勢(shì)（見表22)。結(jié)論是，針對(duì)結(jié)構(gòu)降解，NaCl 和Na 2S04是比蔗糖明顯更好的穩(wěn)定劑。這通過測(cè)量（見表23)和實(shí)時(shí)穩(wěn)定性數(shù)據(jù)（見 表22)顯示。
[0324] 表23 :通過DSC測(cè)定未加入防腐劑的溶液的rFSH變性溫度關(guān)于詳情見實(shí)施例 2〇
[0325]
[0326] 表24 :當(dāng)加入在表中列出的防腐劑或鹽時(shí)，rFSH樣品的變性溫度的變化A L，所 述 rFSH 樣品包含 2.4mg/ml rFSH，0.5mg/ml L-甲硫氨酸，0.005mg/ml 聚山梨醇酯 20，lmM 磷酸鈉緩沖液口!16.5。掃描速率：2°(：/11^。&1'" 1=1'"1(防腐劑/鹽)-1'"1(無添加 ）
[0327]
[0328] 尚未測(cè)定包含芐醇作為防腐劑的溶液的實(shí)時(shí)穩(wěn)定性數(shù)據(jù)，然而，當(dāng)比較如通過DSC 確定的rFSH變性溫度與如利用CD光譜測(cè)定的加熱后的rFSH二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化時(shí)，觀察到相 同的趨勢(shì)（見表24)。已經(jīng)確定不同蛋白樣品的rFSH的二級(jí)結(jié)構(gòu)；可以將在24°C測(cè)定的二 級(jí)結(jié)構(gòu)視為天然結(jié)構(gòu)，并且在此，對(duì)于加入芐醇（以〇. 17mg/ml)或硫酸鈉后的rFSH溶液， 觀察不到在rFSH二級(jí)結(jié)構(gòu)上的差異。盡管，當(dāng)將溶液加熱到76. 5°C時(shí)，觀察到的rFSH二 級(jí)結(jié)構(gòu)的損失隨加入的賦形劑而變化。與不包含任何防腐劑的rFSH溶液相比，加入防腐劑 (芐醇）導(dǎo)致rFSH二級(jí)結(jié)構(gòu)的更大損失，同時(shí)與不加入鹽的rFSH溶液相比，加入鹽（硫酸 鈉）產(chǎn)生更少的rFSH二級(jí)結(jié)構(gòu)的損失?？梢詫⒂行虻膔FSH二級(jí)結(jié)構(gòu)的損失解釋為蛋白的 部分或完全變性。
[0329] 實(shí)施例4-hCG的差示掃描量熱法（DSC)數(shù)據(jù)
[0330] 人絨毛膜促性腺激素（hCG)是由以下兩種糖基化單體組成的異二聚體蛋白：hCG、 促卵泡激素（FSH)、黃體生成素（LH)和促甲狀腺激素（TSH)共有的92個(gè)氨基酸的a -亞基， 和hCG特異的145個(gè)氨基酸的0 -亞基。包括FSH和hCG在內(nèi)的糖蛋白激素，在非共價(jià)偶 聯(lián)的單體解離后都失去了它們的生物學(xué)活性。來自穩(wěn)定性分析的結(jié)果顯示重組FSH (rFSH) 的不穩(wěn)定性主要基于二聚體解離（四級(jí)結(jié)構(gòu)的分解，和伴隨的免疫結(jié)合反應(yīng)的減少）。
[0331] 該實(shí)施例的目的是確定：對(duì)于非常相似的蛋白hCG是否也觀察到以前觀察到的如 利用DSC測(cè)定以及在上述實(shí)施例1-3中所述的各種糖和鹽與rFSH變性溫度的相關(guān)性。另 外，將在該研究中確定的hCG的DSC變性溫度與以前公開的實(shí)時(shí)穩(wěn)定性數(shù)據(jù)（Samaritani， F. 1995, hCG liquid formulations (hCG 液體制劑）.EP 0 814,841)進(jìn)行比較。
[0332] 在含0. 5mg/ml L-甲硫氨酸和0. 005mg/ml聚山梨醇酯20的ImM磷酸鹽緩沖液中， 在存在和不存在0. 1M的各種鈉鹽或蔗糖的情況下，研究hCG的變性溫度。研究了四種不同 的糖和鹽：蔗糖、硫酸鈉、氯化鈉和高氯酸鈉。
[0333] 尿液來源的人絨毛膜促性腺激素（hCG)
[0334] 使用從來自Massone S. A.，Argentina的人尿液中純化的hCG，藥物物質(zhì)，批號(hào) 2823287510 (7059IU/mg)。將材料冷凍貯存在 2-8°C。
[0335] 根據(jù)Ph. Eur.進(jìn)行上述hCG批次的生物學(xué)活性的測(cè)定。
[0336] 如在實(shí)施例2-3中所述，使用rFSH和其他材料。
[0337] 表25 :賦形劑列表
[0338]
[0339] 不同的hCG制劑的組成在表26中列出。
[0340] 表26 :hCG制劑的組成
[0341]
[0342] *關(guān)于該批次，對(duì)應(yīng)于35 300IU/ml.
[0343] 制備方法
[0344] 在 Ferring Pharmaceuticals A/S，Copenhagen，Denmark 以實(shí)驗(yàn)室規(guī)模制備所有 的溶液（表26)。
[0345] 制備hCG制劑
[0346] 在Mi 11 i_Q水中制備所有賦形劑的儲(chǔ)液。從儲(chǔ)液制備具有不同賦形劑的對(duì)照劑溶 液。將hCG藥物物質(zhì)溶解在對(duì)照劑溶液中以獲得在表26中給出的濃度。由于未獲得這些制 劑的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)，所以總是在自樣品制備后的1小時(shí)內(nèi)，對(duì)新鮮制備的樣品進(jìn)行DSC分析。
[0347] 如可從圖4和表