專利名稱：檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生化領(lǐng)域，具體涉及檢測病毒的試劑。
背景技術(shù)：
豬繁殖與呼吸綜合癥(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS) 是以母豬的繁殖障礙、仔豬及成豬的呼吸道癥狀為主要特征的一種病毒性傳染病，其高死 亡率在世界范圍內(nèi)給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。自1987年在美國某個豬場發(fā)現(xiàn)PRRS以 來，該病先后席卷整個北美、歐洲及亞洲。1990-1991年間該病在歐洲暴發(fā)流行，5000多個 豬場發(fā)現(xiàn)本病，100多萬頭豬死亡。我國自1995年從加拿大引進種豬后，年底于華北地區(qū)爆 發(fā)PRRS，1996-1998年更是出現(xiàn)“流產(chǎn)風暴”，發(fā)病母豬流產(chǎn)率達10-50 %，母豬的死亡率高 達10%。由于沒有有效的防治手段，PRRS在我國愈演愈烈，并于2006年出現(xiàn)嚴重疫情，26 省300多個縣，379. 8萬頭豬發(fā)病，死亡99. 2萬頭，給養(yǎng)豬業(yè)帶來沉重打擊。PRRS爆發(fā)的原 因在于其病毒復制過程存在變異，一般的疫苗難于預(yù)防，早發(fā)現(xiàn)，早隔離成為預(yù)防爆發(fā)流行 的主要手段。經(jīng)研究表明引起PRRS的病原體為豬繁殖于呼吸綜合癥病毒(Porcine Reproductive andRespiratory Syndrome Virus, PRRSV),屬于尼多病毒目(Nidovirales) 動脈炎病毒科(Arteriviridae)動脈炎病毒屬(Arterivirus)。PRRSV的基因組為不分節(jié)段 的單股正鏈RNA，直徑約40-80nm，大約為15kd，含9個開放讀碼框(ORFs)。病毒上的囊膜 蛋白是病毒的結(jié)構(gòu)和保護性抗原的組成部分，在致病和免疫過程中發(fā)揮著重要的作用。根 據(jù)序列分析及血清學試驗結(jié)果，將PRRSV分為兩個亞型，即美洲型(代表株VR_2332)和歐 洲型(代表株Lelystad Virus, LV) 0 PRRSV存在較大的基因變異，造成二者抗原性的差異 也較大，因此兩個亞型在血清學試驗中很少有交叉反應(yīng)。引起我國PRRS大規(guī)模暴發(fā)流行的 主要是美洲型，流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)我國亦存在歐洲型PRRSV。隨著病毒基因組的變異，抗原 決定簇的改變或轉(zhuǎn)換，PRRSV的侵襲力和致病性可能還會不斷增強，對養(yǎng)豬業(yè)將造成更大的 威脅。對豬繁殖與呼吸綜合癥做出快速、準確診斷，及時有效掌握PRRSV的流行特點和 監(jiān)測其高致病毒株的出現(xiàn)，對流行趨勢做出預(yù)測，盡早隔離并做出相應(yīng)的防范，將能夠最大 限度地減低疾病所造成的危害。PRRS病毒的檢測方法主要有病毒分離鑒定、免疫過氧化酶技術(shù)及RT-PCR檢測等。 病毒分離培養(yǎng)是最確切方法，但很多豬場不能開展，而且費時；RT-PCR檢測技術(shù)含量及成 本較高，同時易出現(xiàn)假陽性結(jié)果；抗體檢測方法以美國IDEXX和法國LSI最為經(jīng)典，由于目 前各豬場均使用PRRS疫苗預(yù)防，上述兩種方法都很難區(qū)分是疫苗免疫產(chǎn)生的抗體還是豬 感染PRRSV所產(chǎn)生，易出現(xiàn)假陽性；另外有些豬可能感染PRRS病毒但尚未產(chǎn)生抗體或曾感 染過而現(xiàn)在血清轉(zhuǎn)陰等，出現(xiàn)假陰性。PRRSV基因組0RFs7編碼的核衣殼蛋白(Nucleocapsid Protein，NP)包含所有 PRRSV毒株保守的共同抗原決定簇，又有具歐洲型和美洲型特異性的抗原決定簇。同時NP在病毒粒子中含量較高，約占病毒總蛋白的40%，具有極強的免疫原性。該蛋白是一種能夠早期檢測PRRSV感染的有效標志，及早確診PRRSV感染，以便于快速采取有效的治療和 隔離措施，是防止PRRSV感染的擴散及降低死亡率的前提，也是減少經(jīng)濟損失的有效措施， 而目前在國際上尚未有核衣殼蛋白抗原的檢測方法。為此我們利用基因工程技術(shù)，表達該 PRRSV核衣殼蛋白，并制備抗該蛋白的單克隆抗體，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建雙抗體夾心ELISA法檢 測PRRSV中的N蛋白，此抗原檢測方法對于PRRS的早期診斷、預(yù)防PRRS的爆發(fā)流行、疫苗 評測以及流行病學調(diào)查具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提高檢測PRRS病毒的靈敏度和特異性。本發(fā)明解決上述問題的技術(shù)方案是一種檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的檢測抗體，該抗體由保藏號為CCTCC NO. C200851的雜交瘤細胞株G2C51A2分泌得到，記為單抗G2C51A2。一種檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的捕獲抗體，該抗體由保藏號為CCTCC NO. C200850的雜交瘤細胞株V1C12A1分泌得到，記為單抗V1C12A1。本發(fā)明所述的單抗G2C51A2和單抗V1C12A1均能特異性結(jié)合PRRSV核衣殼蛋白， 與臨床PRRSV感染的豬血清及肺組織研磨液分離所獲病毒培養(yǎng)上清反應(yīng)均為陽性；而與其 他常見豬感染性病毒培養(yǎng)上清的反應(yīng)均為陰性，如偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒等。所述單抗G2C51A2和單抗V1C12A1可分別由雜交瘤細胞株V1C12A1和G2C51A2分 泌得到。雜交瘤細胞株V1C12A1和G2C51A2是分別用重組的PRRSV核衣殼蛋白免疫Balb/ c小鼠，然后用免疫后的小鼠脾細胞和商品化的小鼠骨髓瘤細胞NS-I融合，最后用HAT培養(yǎng) 基篩選得到，已于2008年10月30日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)。所述單抗G2C51A2和單抗V1C12A1配對用于檢測PRRSV，主要是結(jié)合雙抗體夾心 方法的檢測，如雙抗體夾心ELISA方法、膠體金免疫層析或免疫化學發(fā)光方法的檢測，其中 單抗V1C12A1作為捕獲抗體，單抗G2C51A2單獨或者結(jié)合各種能發(fā)出可檢測信號的物質(zhì)作 為檢測抗體。基于上述原理，本發(fā)明所述的單抗用于制備成可產(chǎn)業(yè)化的檢測PRRSV的試劑 盒，該試劑盒包括檢測抗體和捕獲抗體，其特征在于所述的檢測抗體是保藏號為CCTCCN0. C200851的雜交瘤細胞株G2C51A2分泌的單抗G2C51A2，所述的捕獲抗體是保藏號為CCTCC NO. C200850的雜交瘤細胞株V1C12A1分泌的單抗V1C12A1。所述的試劑盒可以是雙抗體夾 心ELISA試劑盒、免疫化學放光試劑盒或膠體金快速免疫層析檢測試紙等，例如雙抗體夾 心ELISA試劑盒由以下試劑組成包被單抗V1C12A1的微孔反應(yīng)板、樣品處理液、與標記物 結(jié)合的單抗G2C51A2、陽性對照物、陰性對照物、濃縮洗液、顯色液和終止液，其中所述的標 記物是指能標記在抗體非活性部位且可定量分析的物質(zhì)(如酶、生物素或發(fā)光物質(zhì)等)；而 相應(yīng)的顯色液則含有能與所述標記物反應(yīng)并產(chǎn)生顏色變化的物質(zhì)(例如酶的底物)?？梢?變換和選擇相應(yīng)標記物與顯色液，如生物素親和素系統(tǒng)，再如辣根過氧化物酶及其底物過 氧化氫尿素和四甲基聯(lián)苯胺(簡稱TMB)，也同樣適用于本發(fā)明。所述的樣品處理液、濃縮洗 液和終止液均是雙抗體夾心ELISA方法中的常用試劑，所述的陽性對照物是指PRRSV核衣 殼蛋白，所述的陰性對照物是不含PRRSV核衣殼蛋白的空白對照物。本發(fā)明所說的檢測PRRSV的試劑盒操作簡單、快速，特異性高，與其它豬易感性病毒無交叉反應(yīng)，既可用于豬只進出口檢疫及豬場的檢測監(jiān)控，又可用PRRSV的診斷及流行 病學調(diào)查。本發(fā)明試劑盒與現(xiàn)有檢測PRRSV的技術(shù)相比有以下優(yōu)點1、用于進出口檢疫及豬場的檢測監(jiān)控，與現(xiàn)有PRRSV檢測技術(shù)相比，可利用本發(fā) 明酶聯(lián)免疫技術(shù)試劑盒，對進出口豬只進行檢測嚴格控制PRRSV毒株的引入及輸出，可以 對豬的排泄物及血清樣本初步篩查，可簡易、快速、準確地檢測出樣本中PRRSV ； 2、用于豬場的檢測監(jiān)控，可利用本發(fā)明酶聯(lián)免疫技術(shù)試劑盒，對可疑感染PRRSV 的豬場大規(guī)模的初步篩查，可簡易、快速、準確地檢測出樣本中PRRSV ；3、與目前用于診斷PRRSV的早期診斷試劑盒相比，具有相似的靈敏度，但技術(shù)要 求低，特異性好，與偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒等無假陽性反應(yīng)，成本低，適合各大豬場及獸醫(yī) 防疫站使用。


圖1是本發(fā)明獲得單抗V1C12A1和單抗G2C51A2所用的免疫源，誘導表達純化獲 得重組PRRSV核衣殼蛋白的結(jié)果。其中條帶M為低分子量Marker，條帶1為經(jīng)IPTG誘導后 蛋白表達菌體，條帶2為經(jīng)Glutathione Sepharose 4B結(jié)合柱純化的重組PRRSV核衣殼蛋 白(箭頭所示)。圖2是本發(fā)明獲得單抗V1C12A1和單抗G2C51A2所用的免疫源，誘導表達純化獲 得重組PRRSV核衣殼蛋白免疫印跡鑒定結(jié)果。其中條帶1為Anti-GST單抗，條帶2為PRRSV 減毒疫苗免疫小鼠血清，條帶3為無關(guān)抗體。圖 3 是本發(fā)明單抗 V1C12A1 和單抗 G2C51A2 對經(jīng) Glutathione Sepharose 4B 結(jié) 合柱純化的重組PRRSV核衣殼蛋白進行免疫印跡的結(jié)果，其結(jié)合條帶的分子量為41kDa ；其 中條帶1是V1C12A1，條帶2是單抗G2C51A2，條帶5是單抗Anti-GST單抗，條帶6是單抗 Marker,條帶3，4為無關(guān)單抗。圖4是誘導表達純化獲得重組歐洲株P(guān)RRSV核衣殼蛋白的結(jié)果。其中條帶M為低 分子量Marker，條帶1為經(jīng)IPTG誘導后蛋白表達菌體，條帶2為經(jīng)Glutathione Sepharose 4B結(jié)合柱純化的重組歐洲株P(guān)RRSV核衣殼蛋白(箭頭所示)。圖5是本發(fā)明獲得單抗V1C12A1和單抗G2C51A2，與誘導表達純化獲得重組歐洲 株P(guān)RRSV核衣殼蛋白免疫印跡鑒定結(jié)果。其中條帶1為無關(guān)單抗，條帶2和3分別為本發(fā) 明獲得單抗G2C51A2和單抗V1C12A1，條帶4為PRRSV減毒疫苗免疫小鼠血清。圖6是本發(fā)明檢測PRRSV N蛋白的雙抗體夾心ELISA試劑盒檢測歐洲株及美洲株 N蛋白的結(jié)果曲線圖，其中+表示美洲株N蛋白，+表示歐洲株N蛋白，★表示陰性對 照。
具體實施例方式例1本發(fā)明單克隆抗體的制備和鑒定1、單抗V1C12A1和單抗G2C51A2的制備1)豬繁殖與呼吸綜合癥病毒抗原制備利用基因工程技術(shù)，設(shè)計美洲株P(guān)RRSV基因組0RFs7編碼的核衣殼蛋白基因兩端 引物，上游引物5，-CGCGGATCCGTATGCCAAATAACAACGGCAAG-3，引入BamH I限制性內(nèi)切酶位點，下游引物5，-CCGCTCGAG TTATCATGCTGAGGGTGATGCTGT-3，引入Xhol限制性內(nèi)切酶位點， 以PRRSV(ch-la株，與美洲株同源性為93. 5% )擴增所得細胞上清提取RNA為反轉(zhuǎn)錄模板， 合成N蛋白基因CDNA，進而獲得其dsDNA，構(gòu)建進入PGEX-5X-3原核表達系統(tǒng)，IM IPTG，28°C 誘導表達PRRSV核衣殼蛋白，并純化獲得該蛋白(圖1所示)，同時以PRRSV減毒疫苗免疫 小鼠血清及Anti-GST單抗、無關(guān)抗體鑒定所得重組蛋白后(圖2所示)，并儲存于-80°C備 用。
2)免疫小鼠取4-6周齡雌性BALB/c小鼠，第一次采用弗氏完全佐劑與等體積PRRSV核衣殼蛋 白抗原混勻乳化，皮下注射100 μ g/只小鼠，以后每10天以弗氏不完全佐劑與50 μ g抗原 等體積乳化，腹腔和皮下多點注射，小鼠免疫4次后，于融合前3天靜脈加強100 μ g/只抗原。3)免疫血清效價測定采用間接ELISA法測定免疫血清效價。配制10yg/ml PRRSV核衣殼蛋白抗原的 50mMpH9. 6碳酸鹽緩沖液，包被聚苯乙烯微96孔板，100 μ 1/孔，4°C過夜。次日，含0. 25% 酪蛋白(Sigma)的封閉液300 μ 1/孔4°C過夜，甩干包被板條，真空干燥12 24h，用鋁膜 袋真空包裝4°C保存，用于鼠免疫血清效價測定。于第三次免疫后10天眼眶采血，鼠免疫 血清用含BSA IOmM PBS以1(Γ3 1(Γ6倍稀釋，加入96孔板，100 μ 1/孔37°C 30min, IOmM PBS含0. Tween-20洗滌液洗板四次后，加入1 1000倍稀釋辣根過氧化物酶標 記羊抗小鼠IgG(Sigma, INC)，100 μ 1/孔37°C 30min,同上洗板后，加入含有0. 05% (W/V) TMB和0.06% (W/V)雙氧pH5. O檸檬酸緩沖液，100 μ 1/孔，室溫避光lOmin，加100 μ 1/孔 IM H2SO2終止反應(yīng)，測450nm吸收值，以免疫前小鼠血清作為陰性對照，以測定值與對照值 得比> 2. 1為陽性來判斷免疫血清的效價。4)雜交瘤制備選擇血清抗體效價達1 X IO5的小鼠，于融合前3天尾靜脈注射100 μ g PRRSV核衣 殼蛋白抗原。無菌取小鼠脾臟，制成脾細胞懸液與對數(shù)生長期的小鼠骨髓瘤細胞株NS-I按 10 1的比例混合，用45%聚乙二醇(PEG，MW4000，Sigma)作用下進行融合。按下述步驟 將聚乙二醇溶液加入細胞。在37°C水浴中，在l-2min內(nèi)緩慢加入1. Oml PEG，邊加邊輕輕 搖勻，分別于 lmin、2min、3min、4min、5min 內(nèi)加 lml、2ml、3ml、4ml、5ml 無血清 RPMI-1640 培 養(yǎng)基終止融合，最后加入IOml含15% FBS的二合一培養(yǎng)基，室溫IOOOrpm離心5min，棄上 清，用36ml含15%胎牛血清的培養(yǎng)基輕輕懸起細胞。將此細胞懸液加入6塊96孔培養(yǎng)板 上，在二氧化碳培養(yǎng)箱中溫度為37°C、5% C02的培養(yǎng)箱中。一天以后，于每孔加入100 μ 1 含次黃嘌呤、氨基喋呤-胸腺嘧啶脫氧核苷(HAT，Sigma)篩選培養(yǎng)基。以后每3天用此篩 選培養(yǎng)基給培養(yǎng)物換液一次，直到克隆細胞形成。5)篩選分泌抗PRRSV核衣殼蛋白抗原單克隆抗體的雜交瘤細胞間接ELISA法篩選細胞培養(yǎng)上清，選擇強陽性克隆雜交瘤細胞進行亞克隆化，并 用有限稀釋法連續(xù)克隆化2-3次，得到2株穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細胞株。將克隆化后陽 性率達100%的細胞擴增培養(yǎng)后液氮凍存。小鼠體內(nèi)接種陽性雜交瘤細胞，制備腹水，并采用辛酸_硫酸銨沉淀法純化腹水 中的抗體。
2、本發(fā)明單克隆抗體的特異性鑒定 (1)實驗材料豬繁殖與呼吸綜合癥減毒疫苗(ch-la株)(購自廣州市動物防疫 監(jiān)督所)(2)抗原制備利用基因工程技術(shù)，設(shè)計PRRSV核衣殼蛋白基因兩端引物，合成NP蛋白基因，構(gòu)建 入PGEX-5X-3原核表達載體，ImM IPTG 37°C誘導4h，，并純化獲得PRRSV核衣殼蛋白，并儲 存于-80°C備用。(3)抗體亞類鑒定Ig亞類鑒定采用間接ELISA，包被PRRSV核衣殼蛋白抗原，封閉后與雜交瘤細胞 培養(yǎng)上清孵育，再分別與為1 1000倍稀釋HRP標記的兔抗小鼠不同亞類特異性免疫球 蛋白，這些抗體包括兔抗小鼠IgGl (Sigma, Inc)，兔抗小鼠IgG2a(Sigma，Inc)，兔抗小鼠 IgG2b(Sigma, Inc)，兔抗小鼠 IgG3 (Sigma，Inc)，兔抗小鼠 IgM (Sigma，Inc)。檢測結(jié)果兩 株雜交瘤細胞株均為IgGl陽性(4)間接ELISA法進行單克隆抗體特異性分析用PRRSV核衣殼蛋白抗原包被微孔板，按照常規(guī)的間接ELISA法進行檢測。在包 被的微孔板中加入本專利發(fā)明的雜交瘤細胞培養(yǎng)上清液，37°C再孵育lh，加入1 1000稀 釋辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠IgG (Sigma，Inc)，100 μ 1/孔37°C 30min，加TMB顯色液 室溫避光IOminJn IM H2SO2終止反應(yīng)，測450nm吸收值(A45tl)。表1結(jié)果顯示本專利發(fā)明 的單克隆抗體與PRRSV核衣殼蛋白抗原產(chǎn)生很強的特異性的免疫反應(yīng)。表1 =PRRSV核衣殼蛋白單克隆抗體與PRRSV核衣殼蛋白抗原反應(yīng)間接ELISA結(jié)果
權(quán)利要求
一種檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的檢測抗體，該抗體由保藏號為CCTCCNO.C200851的雜交瘤細胞株G2C51A2分泌得到。
2.一種檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的捕獲抗體，該抗體由保藏號為CCTCCN0. C200850的雜交瘤細胞株V1C12A1分泌得到。
3.—種產(chǎn)生權(quán)利要求1所述抗體的雜交瘤細胞株，其保藏號是CCTCC N0.C200851。
4.一種產(chǎn)生權(quán)利要求2所述抗體的雜交瘤細胞株，其保藏號是CCTCC N0.C200850。
5.一種檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的試劑盒，該試劑盒包括檢測抗體和捕獲抗體， 其特征在于權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，所述的捕獲抗體是權(quán)利要求2所述的單克隆抗 體。
6.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒是雙抗體夾心ELISA試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明提供了檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)的檢測抗體和捕獲抗體，這兩種抗體分別由保藏號為CCTCC NO.C200851的雜交瘤細胞株G2C51A2分泌得到和由保藏號為CCTCC NO.C200850的雜交瘤細胞株V1C12A1分泌得到。上述抗體均能特異性結(jié)合PRRSV核衣殼蛋白，可用于制備PRRSV的試劑。本發(fā)明還提供了一種檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的試劑盒，該試劑盒包括檢測抗體和捕獲抗體，其特征在于所述的檢測抗體由保藏號為CCTCC NO.C200851的雜交瘤細胞株G2C51A2分泌的抗體，所述的捕獲抗體由保藏號為CCTCC NO.C200850的雜交瘤細胞株V1C12A1分泌得到。該試劑盒對PRRSV的美洲株和歐洲株都具有較高的準確度和靈敏度。
文檔編號G01N33/577GK101955531SQ20091016162
公開日2011年1月26日 申請日期2009年7月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月17日
發(fā)明者王壓娣, 蔡建飄, 袁國勇, 車小燕 申請人:南方醫(yī)科大學;香港大學