豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體競(jìng)爭(zhēng) AlphaLISA檢測(cè)試劑盒及其方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體競(jìng)爭(zhēng)AlphaLISA檢測(cè)試劑盒及其方法，其包括供體微珠、受體微珠、豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白單克隆抗體及帶His標(biāo)簽的N蛋白抗原。本發(fā)明通過(guò)優(yōu)化供體微珠、受體微珠、單克隆抗體、抗原以及血清等試驗(yàn)反應(yīng)條件，建立了檢測(cè)PRRSV抗體的競(jìng)爭(zhēng)AlphaLISA檢測(cè)方法。利用本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行PRRSV抗體的檢測(cè)，特異性好，靈敏度高，血清用量少，不需洗滌，不受溶血影響，檢測(cè)成本低，檢測(cè)時(shí)間短。
【專(zhuān)利說(shuō)明】豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體競(jìng)爭(zhēng)AIphaLISA檢測(cè)試劑盒及其方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體的免疫學(xué)檢測(cè)，具體涉及一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體競(jìng)爭(zhēng)AlphaLISA檢測(cè)試劑盒及其方法。
【背景技術(shù)】
[0002]豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV)是引起豬繁殖與呼吸綜合征?。≒RRS)的主要病原。該病主要引起懷孕母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎和木乃伊胎等繁殖障礙，仔豬和育肥豬呼吸道癥狀，感染豬免疫抑制和亞臨床感染，并對(duì)其它致病因子的易感性增加。自1987年美國(guó)首次報(bào)道了豬繁殖與呼吸綜合征以來(lái)，該病呈世界性流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失。我國(guó)自1996年首次分離到該病毒以來(lái)，已先后在廣東、上海、福建等省暴發(fā)和流行，目前該病在我國(guó)已普遍存在?，F(xiàn)有的檢測(cè)方法主要有病毒的分離鑒定、免疫過(guò)氧化物酶技術(shù)，免疫膠體金技術(shù)，免疫熒光抗體染色技術(shù)，核酸探針雜交技術(shù)（ISH)，ELISA、PCR和real time PCR等，各有優(yōu)缺，且特異性差異較大。同時(shí)，方法對(duì)樣品和人員的要求較高。由于豬感染豬繁殖與呼吸綜合征病毒或免疫豬繁殖與呼吸綜合征疫苗均能產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，且抗體能較好的反應(yīng)其免疫或感染病毒的情況，因此，可以通過(guò)檢測(cè)PRRSV的抗體來(lái)反應(yīng)其免疫感染病毒情況。
[0003]AlphaLISA技術(shù)主要依賴(lài)于Alpha供體微珠和受體微珠的相互作用。當(dāng)生物反應(yīng)使供體微珠和受體微珠相互接近時(shí)，激光激發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而產(chǎn)生極大放大的信號(hào)。具體來(lái)說(shuō)，在680nm的激光照射下，供體微珠上的光敏劑將周?chē)h(huán)境中的氧氣轉(zhuǎn)化為更為活躍的單體氧。單體氧擴(kuò)散至受體微珠，產(chǎn)生一系列的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，最后將能量傳遞到銪，發(fā)射波長(zhǎng)為615nm。在生物分子不存在特異的互相作用時(shí)，單體氧無(wú)法擴(kuò)散到受體微珠，則不會(huì)有信號(hào)的產(chǎn)生。AlphaL ISA技術(shù)憑借一種專(zhuān)有的基于微珠的技術(shù)，將傳統(tǒng)的ELISA轉(zhuǎn)化為均相的“無(wú)需洗滌”的檢測(cè)。
[0004]AlphaLISA技術(shù)所使用的稀土元素銪（Eu)，發(fā)射波長(zhǎng)非常尖銳，為615nm，從而大大減少了檢測(cè)樣品中雜質(zhì)的干擾，可直接檢測(cè)復(fù)雜樣品(血清和體液）中的生物分子。在臨床上，這非常適合測(cè)定人和動(dòng)物的血清和體液樣本。而此技術(shù)的高通量、高靈敏度、操作簡(jiǎn)便，能更準(zhǔn)確、更省時(shí)的測(cè)定細(xì)胞因子等生物標(biāo)志物。目前，已廣泛用于藥物篩選、細(xì)胞因子、病變基因、血清抗體等的檢測(cè)。
[0005]中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利（申請(qǐng)?zhí)枮?201210031802. X,201210047016. 9)分別公開(kāi)了采用AlphaLISA技術(shù)檢測(cè)腸道病毒71型衣殼蛋白（Anti-EV71 VPl IgM)和甲型肝炎病IgM的方法。但是，目前尚無(wú)利用AlphaLISA技術(shù)檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體的試劑盒及檢測(cè)方法的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的第一目的是提供一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體競(jìng)爭(zhēng)AlphaLISA檢測(cè)用試劑盒，第二目的是提供一種用于食品安全檢測(cè)的豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體競(jìng)爭(zhēng)AlphaLISA檢測(cè)方法。
[0007]豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體競(jìng)爭(zhēng)AlphaLISA檢測(cè)試劑盒，包括供體微珠、受體微珠、豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白單克隆抗體及帶His標(biāo)簽的N蛋白抗原。
[0008]其中，所述供體微珠為螯合鎳的供體微珠，PE, ASlOlD (即Nickel chelate Donorbeads (PE, AS101D))，濃度為80 y g/mL, 500 y L ;所述受體微珠為抗鼠IgG受體微珠，PE, AL105C (即 Anti-mouse IgG Acceptor beads (PE, AL105C))，濃度為 80 u g/mL, 500 u L。
[0009]所述帶His標(biāo)簽的N蛋白抗原的氨基酸序列如SEQ ID No. I所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0010]所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白單克隆抗體是針對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白的特異性抗體。
[0011]前述試劑盒，包括供體微珠80 u g/mL、受體微珠80 u g/mL、豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白單克隆抗體100nM/L及帶His標(biāo)簽的N蛋白抗原180nM/L。使用時(shí)，以總體系20 ii L計(jì)，每孔添加量為 ：801^/1^受體微珠31^、801^/1^供體微珠51^、180碰/1帶把8標(biāo)簽的N蛋白抗原5iiL、100nM/L豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白單克隆抗體5 y L及待測(cè)樣本2 ii L。待測(cè)樣本可以是血清、體液等。
[0012]具體地，編碼前述帶His標(biāo)簽的N蛋白抗原的基因?yàn)镻RRSV N基因，其核苷酸序列為 SEQ ID NO. 2。
[0013]更具體地，前述PRRSV N基因是通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)得到的；RT_PCR擴(kuò)增反應(yīng)的上游引物的核苷酸序列為SEQ ID NO. 3，下游引物的核苷酸序列為SEQ ID NO. 4。
[0014]一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體競(jìng)爭(zhēng)AlphaLISA檢測(cè)的非疾病診斷目的的檢測(cè)方法，包括如下步驟：
1)反應(yīng)板的待測(cè)孔中每孔加入2y L待測(cè)樣本，反應(yīng)板的對(duì)照孔中加入2 y L IX稀釋緩沖液；
2)每孔加入5ii L 180nM/L帶His標(biāo)簽的N蛋白抗原和5iiL 100nM/L豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白單克隆抗體，1000rpm離心10 sec，室溫23°C避光孵育Ih;
3)每孔加入80ii g/mL受體微珠3 u L、80 y g/mL供體微珠5 y L, 1000rpm離心10sec，室溫23°C避光孵育30 min ；
4)結(jié)果讀取：將反應(yīng)板置Enspire(PE) AlphaLISA檢測(cè)系統(tǒng)中讀值。
[0015]采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明至少具有下列優(yōu)點(diǎn)及有益效果：利用本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體的檢測(cè)，特異性好，靈敏度高，血清用量少，不需洗滌，不受溶血影響。
[0016]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是（I)、操作簡(jiǎn)單，不需要洗滌；（2)、高特異性：抗原與抗體的特異性結(jié)合,均相的反應(yīng),所需樣本體積小,僅需2 --L ;(3)、檢測(cè)時(shí)間短：檢測(cè)時(shí)間比傳統(tǒng)的ELISA時(shí)間短，僅需1.5 h即可完成檢測(cè)；（4)、靈敏度高：最低檢測(cè)極限比普通ELISA高5~10倍；樣本檢測(cè)的檢出率達(dá)到96. 7% ; (5)、背景低，抗淬滅能力強(qiáng)：采用長(zhǎng)波長(zhǎng)激發(fā)，短波長(zhǎng)發(fā)射，不會(huì)有來(lái)自熒光的背景；且利用時(shí)間分辨熒光的檢測(cè)模式，進(jìn)一步降低了背景，確保結(jié)果的真實(shí)性，615nm的發(fā)射波長(zhǎng)，非常尖銳，基本沒(méi)有來(lái)自樣品的淬滅干擾，是進(jìn)行血清、血漿、體液等復(fù)雜樣品檢測(cè)的理想選擇；（6)、用途：可用于血清及其相關(guān)樣本中豬繁殖與呼吸綜合征抗體的快速檢測(cè)。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0017]圖I為PRRSV N基因全長(zhǎng)的核酸擴(kuò)增電泳圖；
圖2為PRRSV N蛋白的SDS-PAGE凝膠電泳分析結(jié)果；圖中M-為預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，從上至下分子量依次為 170KD、95KD、72 KD,55 KD、43KD、34KD、26KD、17KD、IOKD ; I-為未誘導(dǎo)的對(duì)照；2_為誘導(dǎo)的全菌液，3-為誘導(dǎo)的上清液，4-為沉淀；2、3、4泳道均為PRRSV N全長(zhǎng)1-372，分子量大小約為31 KD，與預(yù)期結(jié)果一致；
圖3為His-標(biāo)簽PRRSV N全長(zhǎng)蛋白的Western blot鑒定結(jié)果；圖中I和2為His標(biāo)簽的PRRSV N蛋白全長(zhǎng)1-372，分子量大小約為31 KD; M為Western blot蛋白分子標(biāo)準(zhǔn)，從上至下分子量依次為 170KD、95KD、72 KD,55 KD、43KD、34KD、26KD、17KD、IOKD ;
圖4為重組質(zhì)粒pET-32a-PRRSV N經(jīng)Xho I、Kpn I雙酶切后電泳圖；圖中1_為pET-32a-PRRSV N進(jìn)行雙酶切后，2-為空載體，3-為pET-32a_PRRSV N進(jìn)行雙酶切前，M-為15000DL Marker0
【具體實(shí)施方式】
[0018]以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
[0019]以下實(shí)施中使用的豬繁殖與呼吸綜合征病毒VR2332株購(gòu)自美國(guó)ATCC，保存于重慶出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心。
實(shí)施例`
[0020]一、PRRSV N重組蛋白原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 I、目的片段擴(kuò)增
I. I RT-PCR 擴(kuò)增
以毒株P(guān)RRSV VR2332 (GenBank No. :EF536003. I)的基因組為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR)擴(kuò)增所需目的片段PRRSV N基因，其核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示，編碼的氨基酸序列如SEQ ID No. I所示。
[0021]上下游引物分別引入Kpn I和Xho I酶切位點(diǎn)，引物設(shè)計(jì)采用Primer Preier5( —種引物設(shè)計(jì)軟件），引物由寶生物(大連）公司合成，引物序列見(jiàn)表1。
[0022]表1引物序列
【權(quán)利要求】
1.豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體競(jìng)爭(zhēng)AlphaLISA檢測(cè)試劑盒，其特征在于：包括供體微珠、受體微珠、豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白單克隆抗體及帶His標(biāo)簽的N蛋白抗原； 其中，所述供體微珠為螯合鎳的供體微珠，PEjASIOID ;所述受體微珠為抗鼠IgG受體微珠，PE, AL105C ； 所述帶His標(biāo)簽的N蛋白抗原的氨基酸序列如SEQ ID No. I所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有與N蛋白抗原同等功能的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體競(jìng)爭(zhēng)AlphaLISA檢測(cè)試劑盒，其特征在于：所述供體微珠80y g/mL、受體微珠SOil g/mL、豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白單克隆抗體100nM/L及帶His標(biāo)簽的N蛋白抗原180nM/L ； 使用時(shí)，以總體系20 ii L計(jì)，每孔添加量為：80 u g/mL供體微珠5 y L、80 u g/mL受體微珠3 ii L、180nM/L帶His標(biāo)簽的N蛋白抗原5 y L、100nM/L豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白單克隆抗體5 u L及待測(cè)樣本2 u L0
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體競(jìng)爭(zhēng)AlphaLISA檢測(cè)試劑盒，其特征在于：編碼所述帶His標(biāo)簽的N蛋白抗原的基因?yàn)镻RRSV N基因，其核苷酸序列為 SEQ ID NO. 2。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體競(jìng)爭(zhēng)AlphaLISA檢測(cè)試劑盒，其特征在于：所述PRRSV N基因是通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)得到的；RT_PCR擴(kuò)增反應(yīng)的上游引物的核苷酸序列為SEQ ID NO. 3，下游引物的核苷酸序列為SEQ ID NO. 4。
5.利用權(quán)利要求1或2所述試劑盒進(jìn)行豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體競(jìng)爭(zhēng)AlphaLISA檢測(cè)的非疾病診斷目的的檢測(cè)方法，包括如下步驟： 1)反應(yīng)板的待測(cè)孔中每孔加入2y L待測(cè)樣本，反應(yīng)板的對(duì)照孔中加入2 y L IX稀釋緩沖液； 2)每孔加入5ii L 180nM/L帶His標(biāo)簽的N蛋白抗原和5iiL 100nM/L豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白單克隆抗體，1000rpm離心10 sec，室溫23°C避光孵育Ih; 3)每孔加入80ii g/mL受體微珠3 u L、80 y g/mL供體微珠5 y L, 1000rpm離心10sec，室溫23°C避光孵育30 min ； 4)結(jié)果讀取：將反應(yīng)板置Enspire(PE) AlphaLISA檢測(cè)系統(tǒng)中讀值。
【文檔編號(hào)】G01N33/577GK103487582SQ201310471251
【公開(kāi)日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2013年10月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月11日
【發(fā)明者】聶福平, 王昱, 楊俊 , 向海洋, 王國(guó)民, 肖進(jìn)文 申請(qǐng)人:重慶出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心