專利名稱：：用于檢測抗-類脂抗體的方法、免疫測定法和裝置的制作方法用于檢測抗-類脂抗體的方法、免疫測定法和裝置相關(guān)申請的交叉引用本申請要求2005年6月21日提交的美國臨時(shí)專利申請No.60/693,120的優(yōu)先權(quán)，該申請被全文并入本文作為參考。對政府支持的感謝本發(fā)明是由NationalCenterforHIV,STDandTBPrevention,DivisionofAIDS,STD，andTBLaboratoryResearch,LaboratoryReferenceandResearchBranchCentersforDiseaseControlandPrevention(美國政府的機(jī)構(gòu))作出的。
技術(shù)領(lǐng)域：
本公開涉及使類脂抗原固定于固相支持體的方法和相關(guān)的免疫測定法和免疫測定裝置(例如，檢測條、流通裝置、或橫向流動(dòng)裝置)，該測定法和裝置可用于例如檢測抗-類脂抗體和/或診斷疾病(例如，梅毒)。發(fā)明背景梅毒是由梅毒螺旋體(Treponemapallidum)引起的性傳播疾病(STD)。全世界每年報(bào)告超過100,000例成年人梅毒病例。另外，該疾病先天傳播并且每年影響3,000名或更多的嬰兒。梅毒感染的進(jìn)程跨越許多年并且可以產(chǎn)生多種臨床表現(xiàn)，通過四個(gè)階段對其進(jìn)行表征。梅毒感染的初期發(fā)生在細(xì)菌感染之后的10-100天，并且特征在于出現(xiàn)一處或多處下疳(紅色、不流血、無痛性潰瘍，一般直徑小于1cm)。下疳可以出現(xiàn)在生殖器或身體的其它地方上。下疳持續(xù)3-6周并且不經(jīng)治療而痊愈，留下小的疤痕。感染者在這個(gè)階段是有傳染性的。梅毒感染的第二階段特征在于可以覆蓋身體的部分或全部的皮疹樣皮膚損傷。皮膚損傷通常是不痛的并且在最初的下疳發(fā)作之后的1-6月出現(xiàn)。皮膚損傷可與疣、膿瘡、或者潰瘍相似。不經(jīng)治療，它們在2-12周痊愈，無疤痕。在感染的這個(gè)階段中也可發(fā)生發(fā)燒、咽喉痛、虛弱、體重?fù)p失、淋巴結(jié)腫脹、和睫毛和/或部分眉毛的損失。另外，癥狀可以發(fā)展為腦脊膜血管性梅毒，其特征在于遍布腦和脊髓的炎癥和/或腦脈管系統(tǒng)的變化。感染者在第二階段也是有傳染性的。這種疾病的下一個(gè)階段是潛伏梅毒或隱藏階段。在這個(gè)階段過程中，感染者看起來己經(jīng)病愈并且是無癥狀的。這個(gè)階段在沒有進(jìn)行梅毒治療的人中有大約三分之二持續(xù)終身。在潛伏狀態(tài)的第一年過程中，可以發(fā)生第二階段癥狀的復(fù)發(fā)。除了在復(fù)發(fā)過程中之外，感染者在這個(gè)階段過程中沒有傳染性；然而，在出現(xiàn)初期下疳的四年內(nèi)潛伏感染的母親所生的小孩可能感染先天梅毒。第三級或晚期梅毒是未經(jīng)治療的感染的最后階段。這個(gè)階段可以早在感染之后的一年發(fā)生，或者在其后的任何時(shí)候發(fā)生，10到20年是最常見的。以被稱為梅毒瘤的損傷為特征的良性梅毒可以發(fā)生在骨、皮膚、和內(nèi)臟中。罕見死亡，但是可發(fā)生嚴(yán)重的毀容和疼痛。心血管梅毒的特征在于主動(dòng)脈的動(dòng)脈瘤以及其它心血管問題，并且經(jīng)常導(dǎo)致死亡。神經(jīng)病學(xué)并發(fā)癥可以發(fā)生在梅毒的早期階段以及表現(xiàn)為晚期階段的癥狀。在晚期階段疾病中，神經(jīng)梅毒可能是無癥狀的，或者患者可具有嚴(yán)重的神經(jīng)病學(xué)問題，例如可能的癡呆、精神錯(cuò)亂、活動(dòng)性受損、盲、聾、甚至死亡。梅毒的免疫應(yīng)答包括產(chǎn)生以下物質(zhì)(i)密螺旋體抗體，其是對梅毒螺旋體(T.pallidum)抗原特異性的，和(ii)抗-類脂抗體，其識(shí)別從受損的宿主細(xì)胞釋放的類脂物質(zhì)、脂蛋白樣物質(zhì)和可能的從密螺旋體釋放的心磷脂。梅毒篩選和診斷的主要依據(jù)是針對這兩種抗體的任一種或其二者的血清學(xué)檢驗(yàn)。對于抗-類脂抗體的檢驗(yàn)(經(jīng)常稱為"非密螺旋體檢驗(yàn)")一般地基于由天然存在的心磷脂、膽固醇和卵磷脂(lethicin)組成的抗原。廣泛使用的非密螺旋體檢驗(yàn)(例如，VenerealDiseaseResearchLaboratory(VDRL)檢驗(yàn)和RapidPlasmaReagin(RPR)檢驗(yàn))在顯微鏡下監(jiān)測(例如，VDRL檢驗(yàn))或肉眼監(jiān)測(例如，RPR檢驗(yàn))包括抗原-抗體配合物的絮狀沉淀的形成。非密螺旋體檢驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)在于廣泛可用、便宜和便于對大量樣品進(jìn)行檢驗(yàn)。此外，因?yàn)榭?類脂抗體滴度隨梅毒的成功治療而降低，最終在大多數(shù)患者中消失，而密螺旋體抗體滴度在數(shù)年甚至終生保持很高，因此認(rèn)為非密螺旋體檢驗(yàn)是監(jiān)測治療或檢驗(yàn)再感染的更好的選擇。密螺旋體檢驗(yàn)基于衍生自T.pallidum的抗原，并且包括梅毒螺旋體顆粒凝集(TP-PA)、熒光密螺旋體抗體吸收檢驗(yàn)(FTA-ABS)和酶免疫測定。密螺旋體檢驗(yàn)主要用于驗(yàn)證非密螺旋體檢驗(yàn)中的反應(yīng)性。密螺旋體檢驗(yàn)也可用于確認(rèn)其中非密螺旋體檢驗(yàn)不起反應(yīng)的梅毒的臨床印象。進(jìn)行密螺旋體檢驗(yàn)在技術(shù)上更困難、費(fèi)時(shí)、和昂貴，并且不能用于監(jiān)測治療治療，因?yàn)樵摍z驗(yàn)在大約85%的成功治療梅毒的人中在數(shù)年或終生保持有反應(yīng)性。上述的每一種抗體檢驗(yàn)都使用在臨床背景下得到并且送到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分析的血清樣品進(jìn)行。因此，一般地在收集樣品之后的幾天都不能得到檢驗(yàn)結(jié)果。由于跟蹤STD患者的時(shí)常發(fā)生的困難，需要開發(fā)快速的、床邊檢驗(yàn)(point-of-caretest)，以幫助臨床醫(yī)師作出判斷，最好在檢驗(yàn)的當(dāng)天作出。提供快速的現(xiàn)場結(jié)果的免疫測定裝置(例如檢測條、流通裝置、橫向流動(dòng)裝置)可用于定性地檢驗(yàn)密螺旋體抗體的血清水平(例如，DiaSysCorporation;ACONLaboratories,Inc.;Biokit,S.A.;GenixTechnology;StandardDiagnostics;CortezDiagnostics,Inc.;和PhoenixBio-TechCorp)。然而，更難以開發(fā)用于抗-類脂抗體的類似檢驗(yàn)，至少部分是因?yàn)榭?類脂抗體的疏水性抗原(例如，VDRL，USR或RPR抗原、或心磷脂)抵抗連接于作為免疫測定裝置的一個(gè)元件的固相支持體。根據(jù)一些專家的觀點(diǎn)，梅毒檢測可以通過用于篩選和診斷目的的非密螺旋體檢驗(yàn)和密螺旋體檢驗(yàn)的組合得到進(jìn)一步的幫助。這是WorldHealthOrganization,TreponemalInfections,TechnicalReportSeries674，Geneva:WHO,1982所提倡的方法。能夠同時(shí)檢測非密螺旋體和密螺旋體抗體的易用、快速、床邊檢驗(yàn)將有助于滿足這個(gè)長久己知的需要。
發(fā)明內(nèi)容開發(fā)用于非密螺旋體檢驗(yàn)(或組合的非密螺旋體和密螺旋體檢驗(yàn))的非溶液免疫測定法的努力已經(jīng)受到難以將抗-類脂抗體特異性識(shí)別的抗原(稱為"類脂抗原")，例如心磷脂、VDRL抗原、USR抗原等連接于固體底物例如硝化纖維條的阻撓。例如，心磷脂分子的極小尺寸導(dǎo)致難以將這些分子定位在固體底物上。盡管可以通過使心磷脂與更大分子(例如蛋白質(zhì))結(jié)合而增加心磷脂分子的大小，但是這種結(jié)合導(dǎo)致心磷脂抗原性的喪失。一般地說，類脂抗原的高度疏水性使得難以使這種抗原結(jié)合于許多固體表面，例如硝化纖維和其它微孔膜。本公開提供了可以可靠地使類脂抗原(其至少由心磷脂、磷脂酰膽堿(也稱為卵磷脂)、和膽固醇組成)連接于固體底物(例如微孔膜)同時(shí)維持用于抗-類脂抗體的抗原的抗原性和特異性的方法。使用本文中所述的方法，現(xiàn)在有可能將類脂抗原連接于多種固相支持體。用這樣的方式連接類脂抗原的能力使得允許將其用于例如用于快速、現(xiàn)場檢驗(yàn)非密螺旋體抗體的免疫測定裝置。在某些實(shí)施方案中，公開的免疫測定裝置還并入由密螺旋體抗體識(shí)別的梅毒螺旋體抗原，使得該裝置方便地和同時(shí)檢測非密螺旋體(即，抗-類脂)和密螺旋體(即，抗-梅毒螺旋體)抗體。在一個(gè)具體實(shí)例中，使包括心磷脂、卵磷脂和膽固醇的類脂抗原與類脂抗原特異性的Fab片段群接觸，以提供類脂抗原-Fab配合物，該配合物可容易地連接于固相支持體，例如流通或橫向流動(dòng)裝置的可滲透性底物。前述和其它特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)可以從參考附圖進(jìn)行的對幾個(gè)實(shí)施方案的以下詳細(xì)說明變得顯而易見。圖1是得自A蛋白柱的洗脫液在280nm的吸光度的描圖，所述A蛋白柱加載了木瓜蛋白酶消化的純化IgG。使用設(shè)置為靈敏度2和圖移速率1.5的ISC0UA-5吸光度/熒光檢測器收集數(shù)據(jù)。在洗脫峰I之后，在洗脫液280nm的吸光度回到基線時(shí)，向柱中加入甘氨酸洗脫緩沖液。圖2顯示了SDS梯度凝膠的數(shù)字圖像。泳道(l)分子重量標(biāo)準(zhǔn)(從上開始203、135、83、41、31、17和7kD);(2)得自人梅毒血清的硫酸銨沉淀物；(3)沒有被A蛋白保留的硫酸銨沉淀的蛋白質(zhì)(峰I);(4)得自硫酸銨沉淀物的A蛋白-純化的IgG(峰II);(5)在木瓜蛋白酶消化之前由A蛋白-純化的IgG;(6)木瓜蛋白酶消化之后由A蛋白-純化的IgG;(7)沒有被A蛋白保留的得自木瓜蛋白酶IgG消化的蛋白(峰I)(主要是Fab片段)；(8)得自木瓜蛋白酶IgG消化的A蛋白-保留的蛋白(包括Fc片段)；禾卩(9)分子重量標(biāo)準(zhǔn)(從上開始207、116、98、55、37、30、20禾P7kD)。圖3顯示了如實(shí)施例7所述制備的一系列硝化纖維浸量尺(dipstick)。如圖所示，該浸量尺用IgG或Fab或Fc片段點(diǎn)樣，并且隨后浸入包含金綴合的A蛋白的溶液。圖4顯示了如實(shí)施例8所述制備的一系列硝化纖維浸量尺。該浸量尺用USR抗原點(diǎn)樣，并且隨后浸入包含金綴合的A蛋白和反應(yīng)性的梅毒血清(R)或非反應(yīng)性梅毒血清(NR)的溶液中。圖5為兔抗-人IgG(Fc)與膠態(tài)金的混合物的ODsso作為pH的函數(shù)的圖。如實(shí)施例9所述，用于這些試劑的得到穩(wěn)定的金綴合物的pH是對應(yīng)于最低ODs8Q的pH。圖6為兔抗-人IgG(Fc)與膠態(tài)金的混合物的OD58Q作為兔抗-人IgG(Fc)濃度的函數(shù)的圖。如實(shí)施例IO所述，產(chǎn)生最低0058()的蛋白濃度表示與金顆粒結(jié)合的有用的兔抗-人IgG(Fc)的濃度。圖7顯示了本公開方法可使用的橫向流動(dòng)裝置的五個(gè)不同的物理實(shí)施方案的數(shù)字圖像。(A)、(B)和(E)中所示的裝置實(shí)施方案配置為使得各自可被浸入或部分淹沒在樣品或包含樣品的溶液中。(C)和(D)中所示的裝置實(shí)施方案配置為使得接受大量樣品(或包含樣品的溶液)滴入到進(jìn)樣口中。圖8為橫向流動(dòng)裝置的物理實(shí)施方案的透視圖，外殼的一部分被去掉，以顯示裝置的基本組件和它們的彼此關(guān)系。圖9是固定的類脂抗原的一個(gè)實(shí)施方案和捕獲抗-類脂抗體分析物的示意圖。圖IO提供了用于同時(shí)檢測梅毒中的密螺旋體和非密螺旋體抗體的示例性流通裝置的實(shí)例。該裝置配置為接受滴加到進(jìn)樣口(位于裝置的中央)中的大量樣品。詳細(xì)說明I.引言本文公開的是用于測定流體樣品中，例如人血清中的抗-類脂抗體的存在和/或量的免疫測定裝置。這種裝置包括微孔性基底(例如硝化纖維、尼龍、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚醚砜、聚碳酸酯、聚酯、醋酸纖維素、混合的纖維素酯、或其組合)。底物尤其包括其中固定類脂抗原-錨定抗體配合物的抗-類脂捕獲區(qū)域。這種配合物具有固定在基底上的錨定抗體組分，和被錨定抗體特異性結(jié)合從而被錨定在基底上的類脂抗原組分。類脂抗原組分包括心磷脂、卵磷脂和膽固醇，并且可以被抗-類脂抗體(例如存在于感染梅毒螺旋體的主體中的反應(yīng)素抗體)特異性結(jié)合。其它裝置實(shí)施方案還包括樣品實(shí)施區(qū)域和從樣品實(shí)施區(qū)域到抗-類脂捕獲區(qū)域的流動(dòng)通道。樣品實(shí)施區(qū)域與抗-類脂捕獲區(qū)域?yàn)榱黧w連續(xù)接觸，使得置于樣品實(shí)施區(qū)域的流體樣品樣品可以流過或沿著膜(例如通過毛細(xì)管作用或色譜流動(dòng))流動(dòng)到抗-類脂抗體捕獲區(qū)域?？梢酝ㄟ^抗-類脂抗體與固定的類脂抗原-錨定抗體配合物之間形成配合物檢測流體樣品中抗-類脂抗體的存在和/或量。某些公開的裝置還包括吸收劑襯墊，其與膜接觸并且在樣品接觸捕獲區(qū)域之后起到樣品儲(chǔ)庫的作用。在特定的實(shí)例中，公開的裝置是橫向流動(dòng)裝置或流通裝置。在某些實(shí)施方案中，錨定抗體為心磷脂特異性Fab片段。在其它情況中，將從一個(gè)或多個(gè)感染梅毒螺旋體的主體分離的免疫球蛋白所產(chǎn)生的多種Fab片段用作錨定抗體。某些裝置實(shí)施方案包括類脂抗原，即，USR抗原、VDRL抗原、或合成的VDRL抗原。在某些情況中(例如，對于流通裝置)，底物(例如，硝化纖維膜)的孔徑大小為約0.2/xm到約8/mi。在其它情況中(例如，對于橫向流動(dòng)裝置)，基底(例如硝化纖維膜)的孔徑大小最大為約12/xm。在其它裝置實(shí)施方案中，抗-類脂抗體捕獲區(qū)域包括一個(gè)或多個(gè)線(lines)，在某些實(shí)例中，其可具有約8mm到約15mm的寬度。在示例性的裝置中，類脂抗原-錨定抗體配合物通過包括以下步驟的方法固定在膜上(a)使類脂抗原與對于心磷脂、卵磷脂或膽固醇中至少一種具有特異性的一種或多種錨定抗體接觸，以形成類脂抗原-錨定抗體配合物；和(b)對膜施加類脂抗原-錨定抗體配合物。在更具體的實(shí)例中，類脂抗原-錨定抗體配合物通過包括以下步驟的方法固定在膜上(i)將對心磷脂、卵磷脂、或膽固醇中至少一種具有特異性的錨定抗體固定在膜上；(ii)封閉膜上的非特異性結(jié)合部位；(iii)使固定的錨定抗體與類脂抗原接觸，以形成類脂抗原-錨定抗體配合物；和(iv)洗滌該膜，以除去任何未結(jié)合的類脂抗原。公開的裝置的實(shí)例提供了如下的錨定抗體其與在類脂抗原的組分(例如，心磷脂或膽固醇)中天然存在的表位結(jié)合，而不與被引入到抗原中用于提供錨定抗體結(jié)合部位的衍生基團(tuán)結(jié)合。例如，錨定抗體不與類脂抗原的生物素?；慕M分(例如生物素?；穆蚜字蛐牧字?仕A在某些實(shí)施方案中，公開的免疫測定裝置還包括密螺旋體捕獲區(qū)域，其具有(a)能夠被抗-梅毒螺旋體抗體特異性結(jié)合的固定的密螺旋體抗原，或(b)特異性地結(jié)合移動(dòng)的密螺旋體抗原的固定的抗-梅毒螺旋體抗體。在這些實(shí)施方案中，施加在樣品施加區(qū)域的流體樣品可以流過或沿著膜流動(dòng)到抗-類脂抗體捕獲區(qū)域和到密螺旋體捕獲區(qū)域。另外，本文公開的是用于測定流體樣品中抗-類脂抗體的存在和/或量的橫向流動(dòng)裝置。這些裝置一般包括樣品施加區(qū)域和單獨(dú)的其中提供固定的錨定抗體-類脂抗原配合物的抗-類脂抗體捕獲區(qū)域，所述配合物對于流動(dòng)相抗-類脂抗體具有特異性結(jié)合親和力。施加在樣品施加區(qū)域的任何流體(例如流體生物樣品)沿著從樣品施加區(qū)域到抗-類脂抗體捕獲區(qū)域的流動(dòng)通道流動(dòng)。流動(dòng)通道可以延伸到與橫向流動(dòng)裝置結(jié)合的下游的吸收劑襯墊，所述吸收劑襯墊至少部分地起到流體儲(chǔ)庫的作用。可以檢測在抗-類脂抗體和固定的類脂抗原配合物之間形成的配合物，以測定流體樣品中抗-類脂抗體的存在和/或量。在橫向流動(dòng)裝置的某些實(shí)施方案中，綴合物襯墊(conjugatepad)處于從樣品施加區(qū)域到抗-類脂抗體捕獲區(qū)域的流動(dòng)通道中。綴合物襯墊包括移動(dòng)的或可移動(dòng)的用于抗-類脂抗體的檢測劑試劑，使得通過襯墊的流體流動(dòng)使檢測劑試劑移動(dòng)到抗-類脂抗體捕獲區(qū)域。在檢測劑試劑、抗-類脂抗體、和錨定抗體-類脂抗原配合物之間形成的配合物提供可見的或以其它方式指示生物標(biāo)本中存在抗-類脂抗體的可檢測的指示劑。在可供選擇的實(shí)施方案中，檢測劑試劑不是在綴合物襯墊中提供，但是代之以施加于微孔膜，例如從展開劑瓶施加。檢測劑試劑的例子包括被標(biāo)記的A蛋白、G蛋白、或抗-人抗體，其中標(biāo)記是酶、膠態(tài)金顆粒、彩色乳膠顆粒、吸收蛋白的銀顆粒、吸收蛋白的鐵顆粒、吸收蛋白的銅顆粒、吸收蛋白的硒顆粒、吸收蛋白的硫顆粒、吸收蛋白的碲顆粒、吸收蛋白的碳顆粒、或結(jié)合蛋白的染料袋中的一種或者多種。橫向流動(dòng)裝置的某些實(shí)施方案還包括從樣品施加區(qū)域開始的流動(dòng)通道中的密螺旋體捕獲區(qū)域。這種密螺旋體捕獲區(qū)域可以包括，例如，對于移動(dòng)的抗-梅毒螺旋體抗體具有結(jié)合親和力的固定的密螺旋體抗原或?qū)σ苿?dòng)的梅毒螺旋體生物體或梅毒螺旋體抗原具有結(jié)合親和力的固定的抗-梅毒螺旋體抗體。橫向流動(dòng)裝置還可以具有對綴合物襯墊中的密螺旋體抗體有特異性的移動(dòng)的或可移動(dòng)的檢測劑試劑。用于密螺旋體抗體的檢測劑試劑可與用于抗-類脂抗體的檢測劑試劑中在相同或不同的襯墊中。在具體的實(shí)施方案中，對于抗-梅毒螺旋體抗體具有特異性檢測劑試劑包括金綴合的A蛋白、金綴合的Fc-特異性G蛋白、或金綴合的抗-人抗體(Fc部分)。在其它實(shí)施方案中，密螺旋體捕獲區(qū)域可以包括抗-密螺旋體抗體，用于捕獲存在于流體樣品中的移動(dòng)的密螺旋體抗原。在這種實(shí)施方案中，用于移動(dòng)的密螺旋體抗原的檢測劑試劑可為金標(biāo)記的抗密螺旋體抗原抗體。公開的免疫測定裝置(例如，流通或橫向流動(dòng)裝置)可用于檢測抗-類脂抗體和/或診斷主體中梅毒的方法，通過將得自主體的生物樣品(例如血液、血清、皮膚潰瘍滲出液、尿、唾液或唾沫)施用于公開的裝置，并且檢測捕獲區(qū)域中的在抗-類脂抗體、錨定抗體-類脂抗原配合物和抗-類脂抗體檢測劑試劑之間形成的配合物。檢測捕獲區(qū)域中配合物的形成檢測與梅毒螺旋體感染或疾病梅毒有關(guān)的抗-類脂抗體。在其中裝置包括在樣品施加區(qū)域到心磷脂捕獲區(qū)域的流動(dòng)通路中的綴合物襯墊的那些方案中，檢測的配合物包括移動(dòng)的或可移動(dòng)的檢測劑。在其中從外部來源將檢測劑試劑施用于裝置的其它實(shí)施方案中，被檢測的配合物包括外部施用的檢測劑。在一些實(shí)施方案中，檢測劑試劑是被標(biāo)記的A蛋白、Fc特異性的G蛋白、或抗-人抗體。在該方法的特別有利的實(shí)施方案中，公開的裝置能夠檢測抗-類脂抗體(例如，活性感染(activeinfection)的指示齊U)和抗密螺旋體抗體(例如，驗(yàn)證非密螺旋體檢驗(yàn)的反應(yīng)性)。在包括密螺旋體抗原的裝置的那些實(shí)施方案中，該方法包括檢測捕獲區(qū)域中在抗-梅毒螺旋體抗體、固定的密螺旋體抗原、和檢測劑試劑之間形成配合物。與用于抗-類脂抗體的檢測劑試劑的情況一樣，用于密螺旋體抗體的檢測劑試劑可以在裝置上提供，或者從外部來源施加。另外，本文公開的是用于將免疫活性的心磷脂固定在固相支持體(例如，硝化纖維)上的方法。這種方法包括(a)使類脂抗原(包括免疫活性的心磷脂)與對于類脂抗原的至少一種組分為特異性的一種或多種抗體接觸，以形成類脂抗原-抗體配合物；和(b)將類脂抗原-抗體配合物施加到固相支持體；其中對固相支持體施加類脂抗原-抗體配合物使免疫活性的心磷脂固定在固相支持體上。在具體的實(shí)例中，類脂抗原為USR抗原、VDRL抗原、或合成的VDRL抗原。在其它實(shí)例中，抗體是實(shí)質(zhì)上不與A蛋白、Fc特異性的G蛋白、或抗-人抗體(Fc部分)(例如，F(xiàn)ab片段)反應(yīng)的抗體片段。在其它實(shí)例中，從梅毒螺旋體感染的或梅毒螺旋體接種的主體的血清分離抗體。用于使免疫活性的心磷脂固定在固相支持體上的其它示例性方法包括(a)將對于心磷脂、卵磷脂和/或膽固醇為特異性的一種或多種抗體固定在固相支持體上；(b)封閉固相支持體上的非特異性結(jié)合部位；(c)對固相支持體施加包括免疫活性的心磷脂、卵磷脂和/或膽固醇的類脂抗原，以形成類脂抗原-固定的抗體配合物；和(d)洗滌固相支持體以除去沒有被一種或多種固定抗體特異性結(jié)合的任何類脂抗原。本文還公開了用于診斷梅毒的試劑盒。這些試劑盒包括公開的裝置(例如流通裝置或橫向流動(dòng)裝置)和用于對樣品施加區(qū)域或裝置施加生物樣品的說明書。試劑盒也可包括用于解釋檢驗(yàn)結(jié)果的說明書。公開的裝置也可用于通過分析得自主體的生物樣品診斷主體狼瘡(lupus)的方法，通過對裝置施加生物樣品并且檢測在捕獲區(qū)域中在抗-類脂抗體、錨定抗體-類脂抗原配合物、和檢測劑試劑之間形成配合物。檢測捕獲區(qū)域中配合物形成檢測與狼瘡相關(guān)的抗-類脂抗體。在有些情況中，對于檢測狼瘡而言，有一種或多種輔因子(例如，32-糖蛋白I)存在(例如，被加入到樣品中)。II.縮寫和術(shù)語Ab抗體HPLC高壓液相色譜LFD橫向流動(dòng)裝置PEG聚乙二醇PVA聚乙烯醇PVDF聚偏二氟乙烯PVP聚乙烯基吡咯烷酮SDS十二烷基硫酸鈉USR未受熱的血清反應(yīng)素(unheatedserumregain)除非另作說明，術(shù)語根據(jù)常規(guī)的用法使用。分子生物學(xué)中常見術(shù)語的定義可見BenjaminLewin,GenesV，由OxfordUniversityPress出版，1994(ISBN0-19-854287-9);Kendrew等人(eds.)，TheEncycl(jpediaofMolecularBiology,由BlackwellScienceLtd.出版，1994(ISBN0-632隱02182-9);禾卩RobertA.Meyers(ed.)，MolecularBiologyandBiotechnology:aComprehensiveDeskReference,由VCHPublishers,Inc.出版，1995(ISBN1-56081-569-8)。為了便于對本發(fā)明的各個(gè)實(shí)施方案進(jìn)行評論，提供以下專用名詞的說明被分析物試圖進(jìn)行檢測或測量能夠特異性結(jié)合本文中所述的被固定的類脂抗原的對象，例如原子、分子、分子組或天然或合成來源的化合物(例如，藥物、激素、酶、生長因子、抗原、抗體、半抗原、外源凝集素、脫輔基蛋白、或輔因子)。被分析物可包括但不限于生物學(xué)被分析物、抗體、藥物、激素、抗原、半抗原、外源凝集素、脫輔基蛋白、或輔因子。在一些實(shí)施方案中，被分析物包括響應(yīng)于梅毒螺旋體感染產(chǎn)生的抗體，例如抗-類脂抗體(例如，抗心磷脂抗體)。在其它實(shí)施方案中，被分析物包括響應(yīng)于任何以下因素所產(chǎn)生的抗-類脂抗體(i)自身免疫性疾病，例如狼瘡，(ii)各種靜脈和動(dòng)脈血栓性病癥，包括腦梗塞，(iii)深靜脈血栓形成，(iv)血小板減少。抗體由一種或多種多肽組成的蛋白質(zhì)基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段編碼。已識(shí)別的免疫球蛋白基因包括K、入、a、Y、S、e和U恒定區(qū)基因，以及無數(shù)的免疫球蛋白可變區(qū)基因。輕鏈被分類為K或者或A。重鏈分類為y、u、a、S、或￡，其又分別定義免疫球蛋白類型IgG、IgM、IgA、IgD和IgE?；镜拿庖咔虻鞍?抗體)結(jié)構(gòu)單位通常是四聚體。每個(gè)四聚體由兩個(gè)相同的多肽鏈對組成，每對各有一個(gè)輕鏈(約25kD)和一個(gè)重鏈(約50-70kD)。每個(gè)鏈的N-末端定義主要負(fù)責(zé)抗原識(shí)別的約100到110或更多個(gè)氨基酸的可變區(qū)。術(shù)語"可變的輕鏈"(VL)和"可變的重鏈"(VH)分別是指這些輕鏈和重鏈?？贵w是響應(yīng)于呈遞給免疫系統(tǒng)的抗原而在植物和動(dòng)物中天然產(chǎn)生的。天然產(chǎn)生的抗體可以在例如動(dòng)物的血清中發(fā)現(xiàn)。例如，感染梅毒螺旋體的人一般地從感染破壞的宿主細(xì)胞產(chǎn)生至少針對梅毒螺旋體抗原的抗體和針對由密螺旋體感染產(chǎn)生的類脂物質(zhì)的抗體(例如，抗-類脂抗體)?？贵w可以作為完整的免疫球蛋白或者作為通過使用各種肽酶消化或通過重組DNA方法產(chǎn)生的許多明確表征的片段存在。示例性的抗體片段包括例如，F(xiàn)ab、Fab'、F(ab，)2、Fv、Fd、dAb、互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)、和單鏈抗體(scFv)。Fab片段是由VL、VH、CL和CH1結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段；F(ab')2片段是包括通過絞鏈區(qū)的二硫鍵連接的兩個(gè)Fab片段的二價(jià)片段；Fd片段由VH和CH1結(jié)構(gòu)域組成；Fv片段由抗體的單個(gè)臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成；dAb片段由VH結(jié)構(gòu)域組成(參見，例如，Ward等人，Nature,341:544-546,1989;FundamentalImmunology,W.E.Paul,ed"RavenPress,N.Y.，1993)。盡管某些抗體片段是根據(jù)對完整抗體的消化而定義的，但是應(yīng)該理解，F(xiàn)ab片段或其它抗體片段可化學(xué)上或通過利用重組DNA方法重新合成。因此，如本文中使用的術(shù)語抗體還包括通過修飾整個(gè)抗體產(chǎn)生的或使用重組DNA方法重新合成的抗體片段。抗原可以在動(dòng)物中刺激產(chǎn)生或T細(xì)胞應(yīng)答的化學(xué)或生物化學(xué)的化合物、組合物、結(jié)構(gòu)、決定簇、抗原或其部分，包括被注射或吸收到動(dòng)物中的組合物。抗原與特異性的體液或細(xì)胞免疫的產(chǎn)物反應(yīng)，包括由異源免疫原誘導(dǎo)的那些。術(shù)語"抗原"包括所有的相關(guān)抗原表位。[抗原特異性]超免疫血清對特定的抗原(例如，類脂抗原和/或心磷脂)有特異性的多克隆抗血清，該抗血清是響應(yīng)于用所關(guān)注的抗原(或包含或產(chǎn)生所關(guān)注抗原的生物體或其它組合物)重復(fù)攻擊(例如，通過注射、感染或其它途徑)而在主體中產(chǎn)生的。抗-類脂抗體對類脂抗原有特異性的抗體(例如IgM或IgG)(參見下文)。在有些情況中，抗-類脂抗體是響應(yīng)于疾病狀態(tài)，例如微生物(例如，細(xì)菌)感染而由主體(例如，人)的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的。例如，這個(gè)術(shù)語考慮了由于梅毒螺旋體感染產(chǎn)生的抗-類脂抗體。盡管不束縛于理論，但是認(rèn)為感染梅毒螺旋體的主體的抗-類脂抗體是因?yàn)閺乃拗骷?xì)胞釋放的脂質(zhì)和/或從密螺旋體釋放的脂蛋白樣物質(zhì)和可能的心磷脂而產(chǎn)生的?？?類脂抗體也可響應(yīng)于非密螺旋體疾病而產(chǎn)生，包括例如(i)自身免疫性疾病，例如狼瘡(Harris等人，Clin.Rheum.Dis.,11:591-609,19S5)，(ii)各種靜脈和動(dòng)脈血栓性病癥，包括腦梗塞(Harris等人，Clin.Exp.Rheumatol"2:47-51，1984)，(iii)深靜脈血栓形成(Mueh等人，Ann.Intern.Med.,92:156-159,1980)，(iv)血小板減少(Harris等人，Clin.Rheum.Dis.，11:591-609，1985)，(v)肺栓塞(AndersonandAli，Ann.Rheum.Dis.,43:760-763,1984)，或(vi)伴有胎盤梗塞的復(fù)發(fā)性胎兒死亡(Derue等人，J.Obstet.Gynaecol"5:207-209，1985)。在非密螺旋體疾病中發(fā)現(xiàn)的抗-類脂抗體可以在一種或多種輔因子(例如02-糖蛋白I)的存在下特異性結(jié)合類脂抗原。用于本文公開的方法和組合物(例如，裝置)的某些實(shí)施方案的抗-類脂抗體可進(jìn)行任何衍化，但是經(jīng)常在主體的血清中發(fā)現(xiàn)。結(jié)合親和力該術(shù)語是指一個(gè)分子在分子的一個(gè)位點(diǎn)結(jié)合另一個(gè)分子的強(qiáng)度。如果一個(gè)特定的分子結(jié)合于另一個(gè)特定的分子或者特異性地與其結(jié)合，則可以說這兩個(gè)分子彼此表現(xiàn)出結(jié)合親和力。結(jié)合親和力與一對分子的締合常數(shù)和離解常數(shù)有關(guān)，但是測量或測定這些常數(shù)對于本發(fā)明來說不是關(guān)鍵。相反地，如本文中使用的用于描述所述方法和裝置中的分子之間相互作用親和力通常為在實(shí)驗(yàn)研究中觀察到的表觀親和力(除非另作說明)，其可用于比較一個(gè)分子(例如，抗體或其它特異性結(jié)合配偶體)結(jié)合兩個(gè)其它分子(例如，被分析物和被分析物示蹤劑綴合物)的相對強(qiáng)度。結(jié)合親和力、締合常數(shù)、和離解常數(shù)的概念是公知的。生物樣品是指直接或間接得自主體的任何樣品，包括全血、血漿、血清、眼淚、粘液、唾液、尿、胸膜液、脊髓液、胃液、汗液、精液、陰道分泌物、唾沫、得自潰瘍和/或其它表面發(fā)疹(例如水泡、或膿瘡)的流體、羊水、滑液、腦脊髓液、和/或組織、細(xì)胞或器官的提出物。生物樣品也可為實(shí)驗(yàn)室研究樣品，例如細(xì)胞培養(yǎng)上清液。樣品是使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法收集或獲得的。捕獲區(qū)域免疫測定裝置(例如流通裝置或橫向流動(dòng)裝置)的、其中固定捕獲試劑(例如錨定抗體-類脂抗原配合物)的區(qū)域。免疫測定裝置可具有超過一個(gè)的捕獲區(qū)域，例如"第一捕獲區(qū)域"、"第二捕獲區(qū)域"等等。經(jīng)常將不同的捕獲試劑固定在第一、第二、或其它捕獲區(qū)域中。多個(gè)捕獲區(qū)域在基底上可具有相對于彼此的任何取向；例如，第一捕獲區(qū)域可在第二(或其它)捕獲區(qū)域的遠(yuǎn)端或近端，反之亦然。或者，第一捕獲區(qū)域和第二(或其它)捕獲區(qū)域可彼此垂直取向，使得兩個(gè)(或多個(gè))捕獲區(qū)域形成交叉或加號或其它符號?？?類脂抗體捕獲區(qū)域其中將能夠被抗-類脂抗體(例如類脂抗原-錨定抗體配合物)特異性結(jié)合的抗原固定作為捕獲試劑的捕獲區(qū)域。綴合物當(dāng)以動(dòng)詞形式使用時(shí)，術(shù)語"綴合"是指一個(gè)分子(例如，A蛋白、G蛋白、或抗-人IgG(Fc)抗體)對另一個(gè)分子(例如，膠態(tài)金)的偶聯(lián)。這種偶聯(lián)可以包括綴合物組分之間的共價(jià)或非共價(jià)(例如靜電的或其它)相互作用。這種偶聯(lián)可通過化學(xué)方法使用或不用連接基團(tuán)實(shí)現(xiàn)。當(dāng)以名詞形式使用時(shí)，術(shù)語"綴合物"是指通過綴合形成的偶聯(lián)的分子配合物。檢測是指定量地或定量地測定研究的被分析物(例如，抗-類脂抗體和/或抗-梅毒螺旋體抗體或密螺旋體抗原)的存在。"檢測配合物的形成"是指通過適合于觀察與檢測劑試劑結(jié)合的特定標(biāo)記的任何方法檢測包括檢測劑試劑的配合物；例如目視觀察彩色(或以其它方式可見的)標(biāo)記、測量或目測檢測熒光、化學(xué)發(fā)光或放射性標(biāo)記。檢測劑試劑(或檢測劑)允許特異性檢測被分析物(例如抗-類脂抗體)和捕獲試劑(例如錨定抗體-類脂抗原配合物)之間的配合物的試劑(或一系列試劑)。關(guān)于檢測劑試劑和具體的示例性檢測劑試劑的進(jìn)一步描述在以下提供。乳液兩種不混溶流體的混合物，其中一相作為膠態(tài)分散體存在于被稱為連續(xù)相、分散相或溶劑相的另一相中。某些乳液在靜置無干擾時(shí)容易地分離。其它乳液可以在相當(dāng)長的時(shí)間保持混合。表位(或抗原決定簇)抗體分子與之結(jié)合的抗原分子表面上的位點(diǎn)；通常，抗原具有幾個(gè)或許多不同的抗原決定簇并且與許多不同特異性的抗體反應(yīng)。"外源表位"是在所關(guān)注的抗原分子中非天然存在的表位，其一般地被加入到抗原分子中作為對外源表位特異性的抗體(或其它特異性結(jié)合配偶體)的結(jié)合位點(diǎn)?？乖肿涌梢曰瘜W(xué)地或以其它方式進(jìn)行修飾，以包括外源表位。例如，抗原分子可以被生物素?；?即，用生物素衍生)，從而產(chǎn)生可以被抗生物素抗體或其它生物素特異性結(jié)合配偶體(例如抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素)特異性結(jié)合的外源生物素表位。在有些情況中，外源表位為"表位標(biāo)記"。表位標(biāo)記包括抗體可以特異性結(jié)合的肽序列(一般地少于約15個(gè)氨基酸，但是可以甚至是全長的蛋白序列)。通常已知的表位標(biāo)記包括6-His、8-His、FLAG、HA、以及許多其它的。免疫原性能夠引發(fā)生物體內(nèi)免疫應(yīng)答的性質(zhì)。例如，當(dāng)抗-類脂抗體具有結(jié)合心磷脂中存在的表位的能力時(shí)，心磷脂保持免疫原性。標(biāo)記可通過光譜學(xué)、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)、電學(xué)、光學(xué)或化學(xué)的方法檢測的結(jié)合于被分析物、被分析物類似物、檢測劑試劑、或結(jié)合配偶體的任何分子或組合物。已經(jīng)公開了標(biāo)記的例子，包括酶、膠態(tài)金顆粒、彩色的乳膠顆粒(美國專利4,275,149、4,313,734、4,373,932和4,954,452，各自被并入本文作為參考)。有用的標(biāo)記的另外的例子包括但不限于放射性同位素、輔因子、配體、化學(xué)發(fā)光或熒光齊U、吸收蛋白的銀顆粒、吸收蛋白的鐵顆粒、吸收蛋白的銅顆粒、吸收蛋白的硒顆粒、吸收蛋白的硫顆粒、吸收蛋白的碲顆粒、吸收蛋白的碳顆粒、和吸收蛋白的染料袋。化合物(例如，檢測劑試劑)對標(biāo)記的連接可以如在螯合物等中那樣通過共價(jià)鍵、吸附過程、疏水和/或靜電結(jié)合、或這些鍵和相互作用的組合進(jìn)行，和/或可以包括連接基團(tuán)。類脂抗原能夠被抗-類脂抗體特異性結(jié)合的包括(但不限于)心磷脂、卵磷脂和膽固醇的抗原。術(shù)語"類脂抗原"所考慮的心磷脂、卵磷脂和膽固醇的性質(zhì)在說明書的其它地方詳細(xì)論述。微孔膜具有微觀大小的孔的薄膜或結(jié)構(gòu)。微孔膜至少允許流體和可溶解的被分析物沿著膜移動(dòng)或通過該膜，例如通過毛細(xì)管作用。膜用多種材料或原料的復(fù)合物制成，包括例如聚醚砜、尼龍、聚碳酸酯、聚酯、醋酸纖維素、混合的纖維素酯、聚偏二氟乙烯、和/或硝化纖維。非限制性的適合的孔徑可為最大約0.22微米、約0.22微米到約0.45微米、約0.22微米到約0.65微米、約0.22微米到約0.8微米、約0.22微米到約1.2微米、約0.65微米到約3微米、約0.65微米到約5微米、約0.65微米到約8微米、約5微米到約10微米、或約5微米到約20微米。在具體的情況中，孔徑大可為約0.22微米、約0.45微米、約0.65微米、約0.8微米、約1.2微米、約3微米、約5微米、約S微米、約IO微米、或約20微米。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知適合于橫向流動(dòng)或流通裝置的任何膜都被考慮在術(shù)語"微孔膜"的范圍內(nèi)。A蛋白和G蛋白A蛋白是從金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)分離的蛋白。G蛋白是從鏈球菌分離的蛋白。兩種蛋白都具有哺乳動(dòng)物IgG的Fc部分的結(jié)合部位。天然的G蛋白還包含用于白蛋白的結(jié)合部位Ig的Fab區(qū)域、和膜結(jié)合區(qū)域，其可以導(dǎo)致非特異性結(jié)合；然而，重組的G蛋白已經(jīng)被工程化以除去白蛋白、Fab、和膜結(jié)合位點(diǎn)，而保留Fc結(jié)合位點(diǎn)，這使得其對于IgG的Fc部分為特異性的。如本文中使用的，"G蛋白"是指的Fc特異性重組形式G蛋白(也稱為"Fc特異性G蛋白")。特異性結(jié)合配偶體(或結(jié)合配偶體)能夠識(shí)別和結(jié)合另一個(gè)分子或組合物的特異性結(jié)構(gòu)形態(tài)的分子或組合物。典型的特異性結(jié)合配偶體對包括抗原/抗體、半抗原/抗體、激素/受體、核酸鏈/互補(bǔ)核酸鏈、底物/酶、抑制劑/酶、碳水化合物/外源凝集素、生物素/(鏈霉)抗生物素蛋白、和病毒/細(xì)胞受體。短語"特異性結(jié)合于"是指，與其它非特異性分子種類相比，第一分子種類(例如抗體)優(yōu)先結(jié)合第二分子種類(例如該抗體識(shí)別的抗原)的能力。因此，短語"能夠被…特異性結(jié)合"是指，與其它非特異性分子種類相比，第一分子種類(例如抗原)優(yōu)先被第二分子種類(例如對于該抗原為特異性的抗體)識(shí)別和結(jié)合的能力。主體活的多細(xì)胞生物體，包括脊椎動(dòng)物生物體，包括人和非人哺乳動(dòng)物的種類。除非另外說明，本文中使用的所有的技術(shù)和科學(xué)名詞具有與本發(fā)明所述
技術(shù)領(lǐng)域：
技術(shù)人員通常理解的相同的含義。單數(shù)的術(shù)語包括復(fù)數(shù)對象，除非上下文清楚地表明不是這樣。同樣地，詞語"或"意在包括"和"，除非上下文清楚地表明不是這樣。因此，"包括A或B"表示"包括A或B"或"包括A和B"。應(yīng)該理解，所有的分子重量或分子質(zhì)量數(shù)值是近似的，并且只用于描述。用于實(shí)踐或檢驗(yàn)公開的主題的適合的方法和材料描述如下；然而，這種材料和方法只是說明性的而非限制性的。還可以使用與本文中所述那些相似或相等的方法和材料。本文中提及的所有的出版物、專利申請、專利和其它參考文獻(xiàn)都以適當(dāng)規(guī)則允許的程度全文并入本文作為參考。在發(fā)生抵觸的情況中，以本發(fā)明的說明書(包括對術(shù)語的說明)為準(zhǔn)。in.類脂抗原類脂抗原是包含(但不限于)心磷脂、卵磷脂和膽固醇的任何抗原，該抗原能夠特異性地結(jié)合抗-類脂抗體。在某些實(shí)例中，類脂抗原特異性地結(jié)合存在于梅毒螺旋體感染的主體(例如，人)中的抗-類脂抗體(例如，抗心磷脂抗體)。包括心磷脂(CL)、卵磷脂(L)和膽固醇(Ch)的類脂抗原已經(jīng)長時(shí)間用于溶液分析以檢測血清中的抗-類脂抗體(參見，例如，參見，例如，關(guān)于梅毒診斷的"非密螺旋體檢驗(yàn)"的前述討論)。先前用于溶液分析的具體的示例性的含CL/L/Ch的類脂抗原包括通常已知的VDRL、RPR、禾口USR抗原(例如，VenerealDiseaseResearchLaboratory(VDRL)玻片檢驗(yàn)，在Larsen等人(ed.)，AManualofTestsforSyphilis,9thEdition,WashingtonD.C.:AmericanPublicHealthAssociation,1998，pp.157-178;Pettit等人，"Unheatedserumreagin[USR]testasaquantitativetestforsyphilis,"J.Clin.Microbiol"15(2):238—242,1982)，和Castro等人(Clin.Diagn.Lab.Immunol.,7(4):658陽661，2000)所述的VDRL抗原的合成形式("合成的VDRL")。不幸的是，這種抗原的類脂性質(zhì)使其難以使任何這些抗原可靠地連接于固相支持體，例如吸水性(例如，微孔)膜，如硝化纖維或其它物質(zhì)。因此，對于提供用于檢測例如生物樣品中的抗-類脂抗體的、基于膜的測定法(例如流通或橫向流動(dòng)免疫測定裝置)有長久已知(但是以前未得到滿足的)需要。這種免疫測定裝置將改革例如以存在抗-類脂抗體為特征的梅毒和其它疾病的床邊診斷。除了別的之外，本公開描述了用于固定類脂抗原(例如VDRL、USR、或合成的VDRL抗原)到膜支持體的方法；因此提供了滿足本領(lǐng)域中長久已知的需要的方法。正如以上的討論，本文中所述的方法和組合物考慮了包括(包含或基本上由...組成)心磷脂、膽固醇和卵磷脂的類脂抗原。類脂抗原的這些示例性組分在以下更詳細(xì)地描述。A.心磷脂心磷脂是具有由通過兩個(gè)磷酸二酯橋連接的三個(gè)甘油分子組成的主鏈的心磷脂(具體地，1,3-雙磷脂酰甘油)。心磷脂的外部的甘油部分的四個(gè)羥基各自被飽和或不飽和脂肪酸鏈(一般地長度為14到18碳)酯化。如本文中使用的，術(shù)語"心磷脂"考慮了具有任何分布的脂肪酸側(cè)鏈的1，3-雙磷脂酰甘油。因此，心磷脂的四個(gè)脂肪酸側(cè)鏈可以具有獨(dú)立變化的長度(例如，從約14到約25個(gè)碳、從約14到約22個(gè)碳、從約14到約20個(gè)碳、從約14到約18個(gè)碳、或從約14到約16個(gè)碳)和/或飽和度(例如，從完全飽和到約6個(gè)雙鍵、從完全飽和到約4個(gè)雙鍵、或從完全飽和到約2個(gè)雙鍵)。本文中考慮的示例性脂肪酸側(cè)鏈獨(dú)立地包括肉豆蔻?；?14:0);棕櫚酰基(16:0);硬脂?；?18:0);油?；?18:1);肉豆蔻腦酰基(14:1);棕櫚油?；?16:1);巖芹?；?18:1);亞油酰基(18:2);亞麻?；?18:3);二十碳烯?；?20:1);花生四烯?；?20:4);芥?；?22:1);DHA(22:6);或神經(jīng)?；?24:1)。在一些實(shí)施方案中，心磷脂是心磷脂的天然存在的形式。天然存在的心磷脂的脂肪酸組成通常根據(jù)各種天然存在的脂肪酸分布，例如棕櫚?；?16:0);硬脂?；?18:0);油酰基(18:1);和亞油?；?18:2)。心磷脂的天然存在形式中最豐富的脂肪酸分子種類為90%亞油酸、隨后是5%的油酸、和1%的棕櫚酸。在其它實(shí)施方案中，心磷脂是非天然存在的形式(也稱為"合成的心磷脂")。合成的心磷脂的非限制性例子包括例如，四肉豆蔻酰基心磷脂、四油?；牧字⑺娜舛罐Ⅴ；?雙-(L-ce-甘油基)磷酸、雙(二棕櫚?；鵇,L-a-甘油基磷?；?-l,3-甘油芐基醚二鈉鹽、雙(二棕櫚?；鵇，L-a-甘油基磷酰基)-l，5-戊垸二醇二鈉鹽、雙(二棕櫚?；鵇，L-a-甘油基磷?；?-l，3-丙烷二醇二鈉鹽、雙(二棕櫚酰基D,L-a-甘油基磷?；?-l,4-丁垸二醇二鈉鹽、雙(二棕櫚?；鵇,L-a-甘油基磷?；?-l，2-乙垸二醇二鈉鹽、雙(二棕櫚酰基D,L-a-甘油基磷?；?-甲垸二醇二鈉鹽、雙(二棕櫚?；?山-仏甘油基磷酰基)-1,3-甘油二鈉鹽、雙(芐基磷?；?-l,3-丙烷二醇二鈉鹽、或D，L-a-二棕櫚酰基雙-磷脂酸。"免疫活性的心磷脂"為特異性地與抗-類脂抗體(例如存在于患有梅毒或者感染有梅毒螺旋體的主體中的抗-類脂抗體)反應(yīng)的心磷脂的任何形式(例如，天然存在的或合成的心磷脂)。B.卵磷脂卵磷脂是磷脂酰膽堿的通用名。磷脂酰膽堿是甘油磷脂，其通常是動(dòng)植物中最豐富的磷脂。它是膜雙層的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)單元，并且還是血漿中循環(huán)的主要磷脂。磷脂酰膽堿包含兩個(gè)脂肪酸側(cè)鏈。如本文中使用的，術(shù)語"卵磷脂"考慮了具有任何脂肪酸側(cè)鏈分布的磷脂酰膽堿。因此，心磷脂的二個(gè)脂肪酸側(cè)鏈可以具有獨(dú)立變化的長度(例如，從約14到約25個(gè)碳、從約14到約22個(gè)碳、從約14到約20個(gè)碳、從約14到約18個(gè)碳、或從約14到約16個(gè)碳)和/或飽和度(例如，從完全飽和到約6個(gè)雙鍵、從完全飽和到約4個(gè)雙鍵、或從完全飽和到約2個(gè)雙鍵)。本文中考慮的示例性脂肪酸側(cè)鏈獨(dú)立地包括肉豆蔻?；?14:0);棕櫚?；?16:0);硬脂酰基(18:0);油?；?18:1);肉豆蔻腦酰基(14:1);棕櫚油?；?16:1);巖芹酰基(18:1);亞油?；?18:2);亞麻?；?18:3);二十碳烯?；?20:1);花生四烯?；?20:4);芥?；?22:1);DHA(22:6);或神經(jīng)酰基(24:1)。在一些實(shí)施方案中，卵磷脂是卵磷脂的天然存在的形式。天然存在的卵磷脂的脂肪酸組成包括棕櫚?；?16:0)、棕櫚油?；?16:1)、亞油?；?18:2)、硬脂?；?18:0)、花生四烯?；?20:4)、肉豆蔻?；?14:0)、油?；?18:1)、和亞麻?；?18:3)。天然存在的卵磷脂中脂肪酸的相對百分比取決于卵磷脂的來源而改變(例如，Balint等人，J.LipidRes.,6(1):96,1965)。例如，據(jù)報(bào)導(dǎo)，人膽囊膽汁中的卵磷脂為約45%16:0、4%16:1、4%18:0、16%18:1、23%18:2、4%20:4，以及微量的18:3和14:0;并且據(jù)報(bào)道，人血漿中的卵磷脂為約35%16:0、1%16:1、14%18:0、17%18:1、17%18:2、14%20:4，以及微量的18:3和14:0。在其它實(shí)施方案中，卵磷脂是非天然存在的形式(也稱為"合成的卵磷脂")。卵磷脂的非限制性例子包括例如:<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>其它特定的卵磷脂實(shí)例包括但不限于DL-o:-二肉豆蔻?；蚜字-a-二肉豆蔻?；X磷脂、L-a-二棕櫚?；蚜字?、二棕櫚?；鵏-a-甘油磷酸單膽堿鹽、L-a-二肉豆蔻?；蚜字?、D-a-二肉豆蔻酰基卵磷脂、L-a-二硬脂?；蚜字⒂仓；视吐蚜字?，2-二油?；?sn-甘油-3-膽堿磷酸(18:1)、1，2-二亞油?；?sn-甘油-3-膽堿磷酸(18:2)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-膽堿磷酸(14:0)、1,2-二十五烷?；?3!>甘油-3-膽堿磷酸(15:0)、1，2-二植垸?；?sn-甘油-3-膽堿磷酸(16:0)、1，2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-膽堿磷酸(16:0)、和l-棕櫚?；?2-油?；?sn-甘油-3-膽堿磷酸。C.膽固醇在一個(gè)實(shí)施方案中，膽固醇是具有以下結(jié)構(gòu)的類固醇:HjC、^^v^^0"^5已知膽固醇與膜或膜樣結(jié)構(gòu)(例如脂質(zhì)體或膠束)中的磷脂(例如，心磷脂和卵磷脂)相互作用。在這些情況中，認(rèn)為膽固醇分子是與磷脂的脂肪酸鏈平行取向的，并且膽固醇羥基與磷脂的頭基相互作用。在形成本文中公開的類脂抗原時(shí)，認(rèn)為膽固醇穩(wěn)定乳液(例如，膠束)。因此，對于本公開的目的，術(shù)語"膽固醇"包括能夠穩(wěn)定包含類脂抗原的乳液的膽固醇或其它膽固醇衍生物的任何形式。在某些實(shí)例中，穩(wěn)定包含類脂抗原的乳液是指延長乳化的類脂抗原保持在溶液中的時(shí)間。例如，與包含較少或沒有膽固醇的可比較的抗原相比，將膽固醇加到類脂抗原中可以使這種抗原保持分散在乳液的連續(xù)相中(例如，在乙醇溶液中)的時(shí)間延長5%、10%、15%或25%。膽固醇衍生物的非限制性實(shí)例包括膽甾-5-烯-3P-基-6-氨基己基醚(AH-Chol;Zimmer等人，Eur.J.Pharm.Biopharm.,47(2):175-8，1999);聚(乙二醇)膽甾烯基醚(PEG(n)-Chols;Baba等人，Traffic,2(7):501-12，2001;Ishiwata等人，Biochim.Biophys.Acta，1359(2):123-35,1997);由Nakanishi和Noguchi描述的具有羥乙基氨基頭基的陽離子性膽固醇衍生物(Adv.DrugDeliv.Rev.,52(3):197-207，2001);膽固醇半琥珀酸鹽(Meuillet等人，Eur.J.Pharmacol.,377(2-3):241-52，1999;脫氫麥角甾醇(DHE)，其不同于具有三個(gè)另外的雙鍵禾卩額外的甲基的膽固醇(Mukherjee,Biophys.J.，75(4):1915-1925,1998);包含具有不同間隔臂的叔胺頭基的膽固醇的陽離子性衍生物(Takeuchi等人，F(xiàn)EBSLett,397(2-3):207-9，1996);膽甾烯基-33-羧酰胺基亞乙基二甲基胺(Noguchi等人，F(xiàn)EBSLett.，433(1-2):169-173，1998);和N-[三[(P-D-半乳糖吡喃糖基氧基)甲基]甲基]-Na-[4-(5-膽甾烯-3e-基氧基)琥珀?；鵠甘氨酰胺(Kempen等人，J.Medicin.Chem.，27:1306-1312,1984)。可用于形成膜和膜樣(例如，脂質(zhì)體或膠束)結(jié)構(gòu)(如公開的類脂抗原)的膽固醇衍生物的另外的例子在美國專利5，888，821、5,043,164、4,900,549、4,442,037、4,157,391、和4,544,545，和歐洲專利EP0606613中描述。D.類脂抗原的制備在CL/L/Ch類脂抗原實(shí)施方案中，心磷脂、卵磷脂和膽固醇可以任何比例合并，形成能夠被抗-類脂抗體(例如，抗心磷脂抗體)特異性結(jié)合的抗原。在有些情況中，類脂抗原為膠束、脂質(zhì)體、膜筏、或其它膜樣結(jié)構(gòu)的形式。在這些結(jié)構(gòu)中，疏水性相互作用引起非極性組分(例如，脂肪酸鏈)聚集并且從"核心"排除水分子。如本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的，膠束實(shí)質(zhì)上為球狀的(或以其它方式閉合的)非雙層結(jié)構(gòu)，具有由脂肪酸鏈組成的疏水性內(nèi)部(并且不包括含水的中心)。比較起來，脂質(zhì)體是比膠束更大的實(shí)質(zhì)上球狀排列的雙分子層結(jié)構(gòu)，并且環(huán)繞含水的中心。由CL/L/Ch混合物形成的結(jié)構(gòu)類型取決于例如心磷脂和卵磷脂的脂肪酸鏈的長度和飽和度、溫度、含水介質(zhì)的離子組成、和將磷脂分散在溶液中的方式。在特定的實(shí)施方案中，CL/L/Ch類脂抗原(例如，VDRL、RPR、USR或合成的VDRL抗原)在含水溶液(例如乙醇溶液)中形成膠束。在更特定的實(shí)施方案中，類脂抗原在含水溶液(例如乙醇溶液)中形成膠束但是不形成脂質(zhì)體。用于公開的組合物或方法的類脂抗原可以商業(yè)上獲得(例如，F(xiàn)isher(Cat.No.B40765)、Fisher(Cat.No.22-415-132)、Fisher(Cat.No.23-038010)、True-Medix、IPXOverseasCorporation(Miami,FL，USA)、CenogenicsCorporation(Morganville,NJ,USA)、NovaCenturyScientific(NiagaraFalls,NY,USA)以及其它供應(yīng)商)或者通過本領(lǐng)域通常己知的任何方法生產(chǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，如實(shí)施例1所述生產(chǎn)類脂抗原。在一些實(shí)施方案中，包含心磷脂、卵磷脂和膽固醇(CL/L/Ch)的非含水溶液與含水溶液混合，以形成乳液?？梢允褂闷渲行牧字?、卵磷脂和膽固醇各自是可溶解的(或部分可溶解的)任何非含水溶液，包括例如乙醇(例如無水乙醇、95%乙醇、或70%乙醇)、氯仿、己烷:乙醇(例如，9:1)、甲苯(例如，95%)、二氯甲烷、或苯。在一個(gè)實(shí)例中，在無水乙醇中制備CL/L/Ch。在一些實(shí)施方案中，可用于制備類脂抗原的CL/L/Ch溶液可包括從約0.001%到約0.1%的心磷脂(例如，從約0.005%到約0.07%、從約0.008%到約0.05%、從約0.01%到約0.04%、或從約0.025%到約0.035%);從約0.05%到約0.5%的卵磷脂(例如，從約0.07%到約0.4%、從約0.09%到約0.3%、從約0.1%到約0.25%、或從約0.14%到約0.21%);和/或從約0.2%到約5%的膽固醇(例如，從約0.4%到約3%、從約0.7%到約2%、從約0.8%到約1。/。)。在特定的實(shí)例中，用于制備類脂抗原的CL/L/Ch溶液包括約0.03%心磷脂(例如，天然存在的心磷脂)、約0.21%卵磷脂(例如，天然存在的卵磷脂)、和約0.9%膽固醇。在另一個(gè)實(shí)例中，用于制備類脂抗原的CL/L/Ch溶液包括約0.03%四肉豆蔻?；牧字?、約0.14%1-棕櫚?；?2-油酰基-811-甘油-3-膽堿磷酸和約0.9%膽固醇。將用于制備類脂抗原的CL/L/Ch溶液與含水溶液混合以形成類脂抗原的乳液。含水溶液可以包括其中CL/L/溶液不混溶的任何溶液，例如鹽溶液(例如，包括0.1-1.0MNaCl，例如0.55MNaCl)。一種示例性的含水溶液包括0.55MNaCl、0.05%(v/v)甲醛、0.26mM，0.35mM到0.66mM磷酸氫二鈉(分別用于十二水合物(12*1120)、七水合物(7^20)、或無水形式)、和1.2mM鉀。CL/L/Ch溶液與含水溶液的比例可為導(dǎo)致形成類脂抗原乳液(例如，包含CL/L/Ch的膠束)的任何比例。在某些實(shí)例中，CL/L/Ch溶液與含水溶液的比例為約1:10、約1:15、約2:33、或約1:20。在其它實(shí)例中，乳液中CL/L/Ch溶液的百分比為約3%(v/v)、約5%(v/v)、約8%(v/v)、約10。/。(v/v)、或約12。/。(v/v)。IV.固定類脂抗原的方法已知人血清中的抗-類脂抗體(例如，反應(yīng)素)與包含心磷脂、卵磷脂和膽固醇的脂質(zhì)抗原(例如，RPR、VDRL、USR、或合成的VDRL抗原)反應(yīng)。正如以上的討論，這個(gè)知識(shí)形成了基于溶液的非密螺旋體血清學(xué)檢驗(yàn)的基礎(chǔ)。盡管對用于梅毒檢驗(yàn)的基于膜的測定法有長久已知的需要，但是以前沒有人認(rèn)識(shí)到可以使用，作為一個(gè)實(shí)例，抗-類脂抗體，將包含CL/L/Ch的類脂抗原固定在膜(或其它固相支持體)上，所述抗體是針對用于檢測的抗原特定地設(shè)計(jì)的。與只有一個(gè)用于被檢測抗體的結(jié)合部位的許多其它抗原不同，類脂抗原具有許多用于抗-類脂抗體的結(jié)合位點(diǎn)。因此，如本文中公開的，可以特異性結(jié)合類脂抗原的抗-類脂抗體或其它抗體(或者，在特定的實(shí)例中，這種抗體的片段，例如Fab片段)的不飽和量可用于將類脂抗原與例如膜表面(包括硝化纖維、尼龍和其它)的固相支持體錨定，而不會(huì)不利地影響固定的類脂抗原進(jìn)一步特異性結(jié)合存在于流動(dòng)相(例如生物樣品)中的抗-類脂抗體的能力。A.錨定抗體在公開的組合物和方法用于將類脂抗原固定于固相支持體(例如微孔膜)的抗體包括能夠特異性結(jié)合類脂抗原的任何抗體，包括例如得自梅毒螺旋體感染的或梅毒螺旋體接種的主體(例如，人或兔)的抗-類脂抗體、抗膽固醇抗體、抗心磷脂抗體、或抗卵磷脂抗體。如以下更詳細(xì)地描述的，具有前述特異性的抗體的抗原結(jié)合片段(例如，F(xiàn)ab片段)也可用作公開的組合物和方法中的錨定抗體。錨定抗體可為單克隆的或多克隆的。在具體的實(shí)施方案中，錨定抗體為多克隆的(例如，從梅毒螺旋體感染的人或兔的超免疫血清分離的那些抗體)。得自梅毒螺旋體感染的或梅毒螺旋體接種的主體的多克隆抗-類脂抗體可以通過例如從市售的血清分離這種抗體或使用本領(lǐng)域中通常已知的方法生產(chǎn)并且分離這種多克隆抗體而得到。得自梅毒螺旋體感染的人的血液制品(例如，血清)的商業(yè)供應(yīng)商包括NewYorkBloodCenter(NewYork,NY，USA);BiomedicalResources(Hatboro，PA，USA);LifeDiagnostics,LifeTherapeutics的分部(原來的Serologicals)(Clarkston，GA，USA);禾卩Teragenix(原來的MillenniumBiotech,Inc)(Ft.Lauderdale,FL,USA)。在其它實(shí)施方案中，可以通過用梅毒螺旋體和/或類脂抗原(例如，VDRL抗原)使宿主動(dòng)物(例如兔、小鼠、馬、山羊和其它)免疫生產(chǎn)包含抗-類脂抗體的多克隆抗血清。用于單克隆或多克隆抗體生產(chǎn)的詳細(xì)步驟在Harlow和Lane(antibodies,ALaboratoryManual,CSHL,NewYork,1988)中描述。用于使用包含免疫原的CL/L/Ch在宿主動(dòng)物中生產(chǎn)抗體的具體的非限制性方法已經(jīng)由例如，Inoue和Nojima(Biochim.Biophys.Acta,144(2):409-414，1967)描述。有具體的非限制性流程可用于通過用梅毒螺旋體感染宿主動(dòng)物生產(chǎn)抗-類脂抗體(參見，例如，Perine等人，Infect.Immun.,8(5):787-790，1973)。此外，有定制的抗體生產(chǎn)服務(wù)(參見，例如，SpringValleyLaboratories(Woodbine,MD，USA);MaineBiotechnologyServices(Portland,ME，USA);CovalAbUK(Cambridge,UnitedKingdom);21stCenturyBiochemicals(Marlboro,MA,USA)和許多其它來源)。這種商業(yè)服務(wù)可用于生產(chǎn)類脂-抗原特異性多克隆或單克隆的抗體。在涉及包含抗-類脂抗體的抗血清的實(shí)施方案中，可以使用公知的方法從血清分離抗體級分。市售的試劑盒適合用于從血清分離抗體(包括抗-類脂抗體)。這種試劑盒得自例如Millipore(Billerica，MA,USA),Pierce(Rockford,IL，USA);BioRad(Hercules,CA，USA)和許多其它來源。從血清分離抗-類脂抗體的一個(gè)具體的非限制性方法在實(shí)施例2-3中描述。可用于公開的組合物和方法方法中的其它示例性錨定抗體包括抗膽固醇抗體和抗-心磷脂抗體。抗膽固醇抗體存在于人血清中并且可以如上對于抗-類脂抗體所述進(jìn)行分離。用于生產(chǎn)和/或分離抗-膽固醇抗體的具體的抗-膽固醇抗體和/或流程可以在Kruth等人(J.LipidRes.,42:1492-1500，2001)、Alving等人(Biochem.Soc.Trans"17:637-639，1989)、Swartz等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:1902,1988)、Stollar等人(Mol.Immunol"26(l):73-79，1989)、和PCT公開WO00/06200、WO97/21099、和WO02/083100中發(fā)現(xiàn)。純化的抗-心磷脂抗體為市售的，例如購自UnitedStatesBiological(Swampscott,MA,USA;例如，Cat.No.C1375)。優(yōu)選用于本發(fā)明組合物和方法的錨定抗體(i)不與其它抗原結(jié)合的錨定抗體凝集，和(ii)不顯著地與用于檢測所關(guān)注的被分析物(例如，存在于樣品中的抗-類脂抗體)的試劑(或一系列試劑)結(jié)合(或與之反應(yīng))。凝集是其中多價(jià)的多價(jià)抗體通過它們相應(yīng)的抗原橋接形成交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的過程，所述抗原必須具有至少兩個(gè)用于所關(guān)注抗體的結(jié)合部位(稱為"多價(jià)抗原")。在這種情況下，單個(gè)的抗體可以結(jié)合于兩個(gè)不同的抗原，兩個(gè)不同的抗體可以結(jié)合于相同的抗原。多價(jià)抗體在某些濃度下與多價(jià)抗原發(fā)生凝集。避免錨定抗體與類脂抗原(性質(zhì)上是多價(jià)的)凝集的一個(gè)示例性方法是使用Fab(或其它單價(jià)的)抗體片段來錨定類脂抗原。單價(jià)的抗體片段不能結(jié)合兩個(gè)抗原，從而不能交聯(lián)兩個(gè)不同的抗原。生產(chǎn)單價(jià)抗體片段的方法為本領(lǐng)域中公知的。用于生產(chǎn)和分離Fab片段的一個(gè)非限制性方法在實(shí)施例5中提供。用于避免凝集的可供選擇的非限制性方法是在不存在類脂抗原的情況下對固體表面(例如，基于膜的免疫測定裝置的膜)施加錨定抗體(無論化合價(jià)如何)；然后使類脂抗原結(jié)合于固定的抗體。在這個(gè)可供選擇的方法中，抗體和抗原被物理上阻止實(shí)質(zhì)上的交聯(lián)。B.固相支持體固相支持體(或底物)為不溶性的、或者可通過隨后的反應(yīng)使其為不溶性的任何物質(zhì)。本文中公開的固定類脂抗原的方法可使用任何固相支持體，錨定抗體以這樣的方式與所述固相支持體連接，即，當(dāng)用水溶液洗滌時(shí)(例如與流體樣品(例如生物樣品)接觸時(shí))，所述連接實(shí)質(zhì)上阻止分離。用于公開的免疫測定裝置的優(yōu)選固相支持體實(shí)施方案包括微孔膜，例如硝化纖維、尼龍、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚醚砜、聚碳酸酯、聚酯、醋酸纖維素、混合的纖維素酯、或其組合。固相支持體的表面可通過化學(xué)處理以引起試劑(例如，錨定抗體或錨定抗體-類脂抗原配合物)對支持體的共價(jià)連接而活化。然而，任何其它適合的方法都可以用于將試劑(例如，錨定抗體或錨定抗體-類脂抗原配合物)固定于固相支持體，包括但不限于離子相互作用、疏水性相互作用、共價(jià)相互作用等。引起試劑固定在固相上的特定的力對于本文中所述的方法和裝置不是決定性的。可以根據(jù)吸引和固定試劑例如捕獲試劑的固有能力選擇固相。或者，固相可具有能夠吸引和固定試劑例如錨定抗體或錨定抗體-類脂抗原配合物的因子。因子可以包括帶電的物質(zhì)，其帶有與例如錨定抗體或錨定抗體-類脂抗原配合物、或與錨定抗體或錨定抗體-類脂抗原配合物綴合的帶龜物質(zhì)相反的電荷。許多和各種固相支持體為本領(lǐng)域中已知的那些，包括但不限于吸水性膜或者微孔膜(例如，硝化纖維、尼龍或PVDF)、反應(yīng)托盤的孔壁、試管、聚苯乙烯珠、磁珠、和微粒(例如乳膠顆粒)。對于某些膜的實(shí)施方案，硝化纖維的多孔結(jié)構(gòu)對于多種試劑(例如，錨定抗體或錨定抗體-類脂抗原配合物)有優(yōu)異的吸收和吸附性質(zhì)。尼龍具有相似的特征，也是適合的。微孔結(jié)構(gòu)也有用，如在水合狀態(tài)具有凝膠結(jié)構(gòu)的材料。有用的固相支持體的另外的實(shí)例包括天然的聚合物碳水化合物和它們的經(jīng)合成修飾的、交聯(lián)的或取代的衍生物，例如瓊脂、瓊脂糖、交聯(lián)的海藻酸、取代和交聯(lián)的瓜爾膠、纖維素酯(特別是與硝酸和羧酸類的酯)、混合的纖維素酯、和纖維素醚；含氮的天然聚合物，例如蛋白質(zhì)和衍生物，包括交聯(lián)或修飾的明膠；天然的烴類聚合物，例如乳膠和橡膠；可制備為具有適當(dāng)多孔結(jié)構(gòu)的合成聚合物，例如乙烯基聚合物，包括聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙酸乙烯酯及其部分水解的衍生物、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、上述縮聚物的二元共聚物和三元共聚物，例如聚酯、聚酰胺、和其它聚合物，例如聚氨酯或聚環(huán)氧化物；多孔的無機(jī)材料，例如堿土金屬和鎂的硫酸鹽或碳酸鹽，包括硫酸鋇、硫酸鈣、碳酸鈣，堿金屬和堿土金屬、鋁和鎂的硅酸鹽；和鋁或硅的氧化物或水合物，例如粘土、鋁土、滑石、白陶土、沸石、硅膠、或玻璃(這些材料可與上述聚合材料用作過濾器);和上述類別的混合物或共聚物，例如通過使合成的聚合物與之前存在的天然聚合物聚合得到的接枝共聚物。除了在其他方面的物理上的限制之外，固相支持體可以任何適合的形狀使用，例如薄膜、片、條或板，或者可將其涂布或結(jié)合或?qū)訅旱竭m當(dāng)?shù)亩栊暂d體上，例如紙、玻璃、塑料膜、或織物。C.將錨定抗體-類脂抗原配合物固定在一些實(shí)施方案中，通過在溶液中使類脂抗原與對該類脂抗原為特異性的錨定抗體(例如，抗-類脂抗體、抗-膽固醇抗體、抗-卵磷脂抗體、和/或抗-心磷脂抗體、和/或前述任何的抗原結(jié)合片段)接觸以形成類脂抗原-錨定抗體配合物(或配合物)而將類脂抗原固定在固相支持體上。在特別的實(shí)施方案中，在溶液中使類脂抗原接觸對于類脂抗原(例如，從感染有梅毒的人的血清或得自其它梅毒螺旋體感染或接種的主體的血清中的免疫球蛋白分離的Fab片段)為特異性的Fab片段。類脂抗原-錨定抗體配合物具有多肽組分(即，錨定抗體)和脂質(zhì)組分(即，類脂抗原)。與脂質(zhì)相反，本領(lǐng)域中公知多肽(例如，蛋白質(zhì))強(qiáng)烈地粘附(通過未完全表征的相互作用)于許多類型的固相支持體，特別是粘附于膜支持體(如硝化纖維、尼龍或PVDF)(參見，例如，Harvey，OptimizationofNitrocelluloseMembraneBasedImmunoassays,Keene，NH:SchleicherandSchuell,1991;Wallis等人，Ann.Rev.Microbiol"33:413—437,1979;Presswood,MembraneFiltration:ApplicationsandProblems,NewYork,NY:MarcelDekker,1981;Farrah等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78:1229—1232,1981;Batteiger等人，J.Immunol.Meth.,55:297—307，1982;Tijssen，PracticeandTheoryofImmunoassays,8thed,Amsterdam:TheNetherlandsElsevier,1993)。因此，通過其與多肽組分(例如，錨定抗體)的結(jié)合，現(xiàn)在也有可能將類脂抗原強(qiáng)烈地粘附(例如，固定)于固相支持體(例如，硝化纖維、尼龍、或PVDF)。因此，本發(fā)明公開的方法(和生產(chǎn)公開的組合物的方法)考慮了使固相支持體(例如微孔膜)與抗原-抗體配合物的溶液接觸，其中通過這種接觸，抗原-抗體配合物變得實(shí)質(zhì)上固定在固相支持體上。在某些實(shí)例中，在滿足以下條件時(shí)，錨定抗體-類脂抗原配合物實(shí)質(zhì)上固定在固相支持體上在支持體接觸流體樣品足以使流體樣品濕潤固相支持體的時(shí)間(例如，足以使流體樣品沿著膜條移動(dòng)并且接觸其中固定類脂抗原的區(qū)域的時(shí)間)時(shí)，有至多約1%、至多約2%、至多約5%、至多約10%、或至多約25%的抗原-抗體配合物從固相支持體分離。為了使類脂抗原固定于固體表面，還考慮了可以在沒有類脂抗原的存在下使固體表面(例如，硝化纖維、尼龍或PVDF)接觸錨定抗體(例如，在溶液中)。正如以上的討論，多肽錨定抗體強(qiáng)烈地粘附于固體表面，并且被固定。其后，使固定的錨定抗體接觸類脂抗原(例如，在溶液中)。類脂抗原被固定的錨定抗體特異性結(jié)合用以固定抗原。正如以上的討論，這種抗原固定技術(shù)可用于避免在其中錨定抗體是多價(jià)的并且能夠在多價(jià)抗原的存在下介導(dǎo)凝集的情況中的凝集。在其中期望使用固定的類脂抗原檢測類脂-抗原結(jié)合的被分析物(例如抗-類脂抗原)的情況中，固定的抗原具有暴露的被分析物結(jié)合部位是有利的。因此，在前述情況中，使用不會(huì)飽和(例如，封閉)類脂抗原上大多數(shù)(或基本上所有)的被分析物結(jié)合部位的錨定抗體量以形成錨定抗體-類脂抗原配合物。錨定抗體-類脂抗原配合物中錨定抗體的未飽和量是允許被分析物(例如，流動(dòng)相中的抗-類脂抗體)可檢測地結(jié)合配合物的類脂抗原組分的這種抗體的任何量。在某些實(shí)例中，可用的抗-類脂抗體結(jié)合位點(diǎn)的至多約1%、至多約5%、至多約10%、至多約25%、至多約30%被錨定抗體封閉。在其它實(shí)例中，在liil體積中的從10ng到約1000ng的錨定抗體與等體積的如實(shí)施例1中所述制備的類脂抗原反應(yīng)。在具體的實(shí)例中，使用25ng到約750ng、50ng到約600ng、約100ng到約500ng、或約150ng到約400ng的錨定抗體制備錨定抗體-類脂抗原配合物。圖9圖解了類脂抗原(例如，USR抗原)通過錨定抗體(例如，抗-類脂F(xiàn)ab)附著于固相支持體(例如，硝化纖維膜)的一個(gè)特定實(shí)施方案。該圖另外圖解了來自示例性樣品(例如，血清樣品)的抗-類脂抗體被固定的類脂抗原捕獲和檢測劑、被捕獲的抗-類脂抗體、抗原和錨定抗體之間的關(guān)系。特定的實(shí)例排除了使用對于被加入到類脂抗原組分中用作錨定抗體的表位的衍生物基團(tuán)(例如，生物素、6-His、FLAG、或其它表位標(biāo)記)為特異性的錨定抗體使類脂抗原錨定于底物。這種實(shí)例沒有排除包括衍生化的心磷脂、衍生化的卵磷脂和/或衍生化的膽固醇作為類脂抗原組分；然而，在這種實(shí)例中，這種衍生化的組分的衍生基團(tuán)不起到錨定抗體的表位的作用。1.對微孔膜施加錨定抗體-類脂抗原配合物一些公開的方法和組合物考慮了要被連接于微孔膜(例如硝化纖維、尼龍或PVDF)的錨定抗體-類脂抗原配合物(也稱為"捕獲試劑")。膜用于固定捕獲試劑和提供表面供施加的樣品流過或通過。硝化纖維(無論是純的或以本領(lǐng)域已知的任何方式進(jìn)行修飾的)是用于公開的裝置和方法的優(yōu)選的膜。認(rèn)為硝化纖維通過氫鍵、疏水性相互作用、和通過靜電機(jī)制結(jié)合蛋白質(zhì)(參見，例如，MilliporeCorporation,AShortGuideDevelopingImmunochromatographicTestStrips,2ndEdition,pp.1-40,1999，索取電話(800)645-5476)。對于含蛋白的捕獲試劑，例如錨定抗體-類脂抗原配合物，認(rèn)為硝化纖維的硝酸酯的偶極與蛋白的肽鍵的強(qiáng)偶極相互作用。施用溶液中的高濃度鹽、洗滌劑、和水可以削弱硝化纖維膜和對膜施加的蛋白質(zhì)之間的靜電相互作用，或使其不穩(wěn)定化。因此，盡管不需要，但是優(yōu)選使用低摩爾濃度的緩沖液，例如2-10mM的磷酸鹽、硼酸鹽或碳酸鹽緩沖液，用以溶解用于固定在硝化纖維上的含蛋白的捕獲試劑。施用溶液的pH可以(但不必須)進(jìn)行調(diào)節(jié)，以增加捕獲試劑對硝化纖維膜的結(jié)合。例如，在施用溶液的pH為含蛋白的捕獲試劑的pi的約+/-1pH單位范圍內(nèi)時(shí)，施用溶液中的含蛋白的捕獲試劑的溶解度最小。任選地，可以向施用溶液加入1到5%的甲醇、乙醇或異丙醇?？梢允謩?dòng)或自動(dòng)的方式對膜施加施用溶液。例如，可使用試劑分配模件(例如，Matrix1600，KinematicAutomation,TwainHarte，CA)對微孔膜(例如，硝化纖維)施加捕獲試劑。一般地，在公開的方法和裝置中，將微孔膜封閉不是必要的。例如，存在于可以被加入到例如橫向流動(dòng)裝置的樣品襯墊或綴合物襯墊中的樣品和其它封閉試劑中的蛋白質(zhì)通常足以防止被分析物非特異性地結(jié)合在膜上。如果任選的應(yīng)用期望任選地將膜封閉，則有用的封閉試劑包括例如明膠(0.1%-0.5%)、脫脂奶粉(0.5%-2%)、酪蛋白(1%-2%)、BSA(1%-2%)、IgG(1%-2%)、PVP8-10kD(0.5%-1.0%)、和PVA8陽10kD(0.5%-1.0%)。V.免疫測定裝置本文發(fā)現(xiàn)的將類脂抗原(例如，VDRL和/或USR抗原)固定于固相支持體(例如，微孔膜，如硝化纖維、尼龍或PVDF)的方法使得能夠生產(chǎn)用于檢測結(jié)合類脂-抗原的被分析物(例如，得自梅毒螺旋體感染主體的生物樣品中的抗-類脂抗體)的免疫測定裝置。在某些實(shí)例中，公開的免疫測定裝置允許檢測生物樣品中抗-類脂抗體的存在(或不存在)，用以診斷梅毒。A.典型的免疫測定裝置形式和相關(guān)信息免疫測定裝置允許進(jìn)行目測鑒定流體樣品中被分析物的存在(或不存在)的便宜的、一次性的、基于膜的測定法。這種裝置通常布置為獨(dú)立的浸量尺(例如，檢測條)或作為具有某些外殼的裝置。一般地，免疫測定裝置可利用少到約200y1的流體樣品，并且樣品中被分析物的檢測可以(但是不必須)在2-5分鐘內(nèi)完成。在臨床檢驗(yàn)中，樣品可為尿、血、血清、唾液、或其它體液。在非臨床檢驗(yàn)中，樣品可為從土壤、灰塵、植物、或食物制備的少量溶液，并且同樣直接施用于膜檢測條。大多數(shù)情況中，不需要輔助的儀器進(jìn)行這種檢驗(yàn)，并且這種裝置可被容易地用于診所、實(shí)驗(yàn)室、野外場所、和家中，甚至由無經(jīng)驗(yàn)的人使用。已經(jīng)開發(fā)流免疫測定裝置用于使用不同的生物樣品(例如，尿、血清、血漿、血、唾液)常規(guī)鑒定或監(jiān)測生理學(xué)和病理學(xué)狀況(例如，感染性疾病、懷孕、癌癥、內(nèi)分泌病癥)，和用于分析環(huán)境樣品(例如，天然流體和工廠污水)，例如，污染。這些檢驗(yàn)中有許多是基于特異性結(jié)合對之間的非常特異性的相互作用。這種結(jié)合對的實(shí)例包括抗原/抗體、半抗原/抗體、外源凝集素/碳水化合物、脫輔基蛋白/輔因子和生物素/(鏈霉)抗生物素蛋白。此外，許多這些檢驗(yàn)包括如下裝置(例如，固相、橫向流動(dòng)檢測條、流通檢驗(yàn))，其具有附著于移動(dòng)的或固定的固相物質(zhì)例如乳膠珠、玻璃纖維、玻璃珠、纖維素條或硝化纖維膜(美國專利4，703，017、4,743,560、5，073,484)的結(jié)合對的一個(gè)和多個(gè)成員。免疫測定法的一個(gè)要素類別是"夾心"測定法。通常，夾心免疫測定方法要求將可以包含所關(guān)注的被分析物(例如，抗-類脂抗體)的樣品與特異性地識(shí)別被分析物檢測劑試劑(例如金綴合的A蛋白，金綴合的G蛋白)、或?qū)τ诳?類脂抗體為特異性的金綴合的第二抗體(例如，抗-人Ab或抗-人Ab(Fc)第二抗體)混合。檢測劑試劑是移動(dòng)的并且一般地連接于標(biāo)記或另一種信號試劑，例如染色的乳膠、膠態(tài)金屬溶膠、或放射性同位素。然后將這個(gè)混合物施加給包含被所關(guān)注的被分析物識(shí)別的固定抗原的譜帶或區(qū)帶的色譜介質(zhì)(例如微孔性或吸水性膜，如硝化纖維、尼龍或PVDF)。色譜介質(zhì)經(jīng)常為與浸量尺相似的條的形式、或者可被并入例如在橫向流動(dòng)裝置或流通裝置中的外殼中。當(dāng)被檢測的分子與檢測劑試劑的配合物到達(dá)色譜介質(zhì)上固定抗原的區(qū)帶時(shí)發(fā)生結(jié)合并且檢測劑試劑被定位在該區(qū)帶。這表明被檢測分子的存在。這項(xiàng)技術(shù)可用于得到定量或半定量的結(jié)果。在檢測條上進(jìn)行夾心免疫測定法的實(shí)例在例如美國專利4,168,146和4,366,241中描述。在基于膜的免疫測定法的其它常見形式(如由一些家用受孕和排卵檢測試劑盒所代表的)中，將檢測條(或浸量尺)"浸入"懷疑包含被分析物的樣品中。然后同時(shí)或在孵育期之后加入酶標(biāo)記的檢測劑試劑。然后將裝置洗滌，并插入包含該酶的底物的第二溶液中。如果存在，則酶標(biāo)記引起形成彩色產(chǎn)物，其或者作為沉淀物沉淀在固相上，或者在底物溶液中生產(chǎn)可見的變色。EP-AO125118描述了這種夾心型浸量尺免疫測定法。EP-A0282192描述了用于競爭型測定法的浸量尺裝置。流通類型免疫測定裝置被部分地設(shè)計(jì)排除對浸量尺測定法所涉及的孵育和洗滌步驟的需要。流通免疫測定裝置包括捕獲試劑(例如錨定抗體-類脂抗原配合物)，所述捕獲試劑結(jié)合于用于加入流體樣品的多孔膜或過濾器。當(dāng)流體流過該膜時(shí)，目標(biāo)被分析物(例如，抗-類脂抗體)結(jié)合于捕獲試劑。加入樣品之后，加入檢測劑試劑(例如金綴合的A蛋白或金綴合的抗-人IgG(Fc))?；蛘撸梢赃@樣的方式將檢測劑試劑置于膜上，使得允許檢測劑與樣品混合并且從而標(biāo)記被分析物。檢測劑試劑的視覺檢測提供樣品中存在目標(biāo)被分析物的指示。典型的流通免疫測定裝置在美國專利4，246，339、4,277,560、4，632，901、4,812,293、4,920,046、和5,279,935，和美國專利申請20030049857和20040241876中描述。遷移測定裝置通常在它們內(nèi)部并入已經(jīng)附著于彩色標(biāo)記的試劑，從而允許視覺檢測測定結(jié)果，而無需加入另外的物質(zhì)。參見，例如，美國專利4,770,853，PCT申請WO88/08534和歐洲專利EP-AO299428。有許多市售的橫向流動(dòng)型檢驗(yàn)和專利公開的方法用于檢測大的被分析物(MW大于l，OOO道爾頓)。美國專利5，229，073描述了用于測量血漿脂蛋白水平的半定量的競爭性免疫測定橫向流動(dòng)方法。這種方法利用包含固定的抗體的多個(gè)捕獲區(qū)帶或線，用以結(jié)合被標(biāo)記的和自由的脂蛋白，以產(chǎn)生半定量結(jié)果。美國專利5,591,645提供了具有至少兩個(gè)部分的色譜用檢測條。第一個(gè)部分包括可移動(dòng)的示蹤劑，第二部分包括能夠結(jié)合于被分析物的固定的粘合劑。用于大的被分析物的橫向流動(dòng)檢驗(yàn)的另外的實(shí)例在以下專利文獻(xiàn)中公開美國專利4，168，146、4,366,241、4,855,240、4,861,711、禾B5,120,643;歐洲專利0296724;WO97/06439;和WO98/36278。還有用于檢測小的被分析物(MW100-1,000道爾頓)的橫向流動(dòng)型檢驗(yàn)。通常，這些小的被分析物檢驗(yàn)包括"典型的"競爭性抑制以生產(chǎn)否定的或間接的報(bào)告結(jié)果(即，隨著被分析物濃度的增加，信號減小)，如美國專利4,703,017所例證的。然而，已經(jīng)開發(fā)了幾個(gè)方法用于使用產(chǎn)生肯定的或直接的報(bào)告結(jié)果(即，隨著被分析物濃度的增加，信號增加)的橫向流動(dòng)檢驗(yàn)檢測小的被分析物。這些包括例如美國專利5,451,504、5,451,507、5,798,273禾B6,001,658。美國專利5,451,504提供具有三個(gè)特異性區(qū)帶(流通、捕獲和檢測)的方法，每個(gè)區(qū)帶包含不同的乳膠綴合物以得到陽性的信號。移動(dòng)區(qū)帶包含被標(biāo)記的抗體，以結(jié)合樣品中的被分析物。在捕獲區(qū)帶中，未被結(jié)合的標(biāo)記抗體則被固定的被分析物類似物捕獲。檢測區(qū)帶捕獲被標(biāo)記的被分析物-抗體配合物。美國專利5，451，507描述了兩個(gè)區(qū)帶、不相連的免疫測定方法。第一區(qū)帶具有非擴(kuò)散性結(jié)合試劑，其與結(jié)合于、或能夠結(jié)合于信號產(chǎn)生系統(tǒng)的成員的組分(例如被分析物類似物)結(jié)合。第二區(qū)帶只有在待檢驗(yàn)的被分析物存在時(shí)結(jié)合于該組分。該組分移動(dòng)進(jìn)入第二區(qū)帶的距離與被分析物濃度直接相關(guān)。美國專利5,798,273公開了橫向流動(dòng)裝置，其包括具有固定的被分析物類似物的捕獲區(qū)帶和一個(gè)或多個(gè)讀出區(qū)帶，以結(jié)合被標(biāo)記的被分析物類似物。美國專利6,001,658公開了檢測條裝置，其具有結(jié)合被分析物的可擴(kuò)散的、被標(biāo)記的結(jié)合配偶體，固定的被分析物，和包含固定抗體的檢測區(qū)。本文所述的裝置通常包括一條吸收性物質(zhì)(例如微孔膜)，在有些情況下，其由不同的物質(zhì)制成，所述不同的物質(zhì)在區(qū)帶中彼此接合，該接合可為鄰接和/或重疊的。在某些實(shí)例中，吸收劑條可被固定在支持用非反應(yīng)性物質(zhì)(例如無紡的聚酯)上，用于例如為條提供增加的剛性。每個(gè)條內(nèi)部的區(qū)帶可區(qū)別地包含檢測和/或定性被檢測的特定被分析物(例如，抗-類脂抗體)所需的特異性結(jié)合配偶體和/或其它試劑。因此，這些區(qū)帶可以看作是檢驗(yàn)裝置內(nèi)的功能部分或功能區(qū)。通常，通過例如浸漬或點(diǎn)樣在條的近端將流體樣品(或懸浮在流體中的樣品)引入到條中。樣品是使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法收集或獲得的。包含待檢測的抗-類脂抗體的樣品可得自任何生物學(xué)來源。生物學(xué)來源的實(shí)例包括人或動(dòng)物的血清、血漿、尿、脊髓液、唾液、發(fā)酵液、淋巴液、組織培養(yǎng)液和腹水液。在免疫測定以優(yōu)化免疫測定結(jié)果之前可將樣品稀釋、純化、濃縮、過濾、溶解、懸浮或以其它方式處置。流體向遠(yuǎn)側(cè)移動(dòng)通過條的所有功能區(qū)。流體在單獨(dú)的功能區(qū)中的最終分布取決于所用材料的吸附能力和尺寸。在一些實(shí)施方案中，前述的多孔性固相支持體例如硝化纖維優(yōu)選為片或條的形式。這種片或條的厚度可以在寬的范圍內(nèi)變化，例如，從約0.01至U0.5mm、從約0.02至lj0.45mm、從約0.05至ij0.3mm、從約0.075至U0.25mm、/人約0.1至lj0.2mm、或/人約0.11至U0.15mm這種片或條的孔徑大小同樣可在寬的范圍內(nèi)變化，例如從約0.025到15微米、或者更特定地從約O.l到3微米；然而，孔徑大小不是選擇固相支持體時(shí)的限制因素。在適當(dāng)時(shí)，固相支持體的流動(dòng)速率也可在寬的范圍內(nèi)變化，例如，從約12.5到90sec/cm(即，50到300sec/4cm)、約22.5到62.5sec/cm(即，90到250sec/4cm)、約25到62,5sec/cm(即，100到250sec/4cm)、約37.5到62.5sec/cm(即，150到250sec/4cm)或約50到62.5sec/cm(即，200到250sec/4cm)。在本文所述裝置的具體實(shí)施方案中，流速為約62.5sec/cm(即，250sec/4cm)。在本文所述裝置的其它實(shí)施方案中，流速為約37.5sec/cm(即，150sec/4cm)。在使用免疫測定裝置時(shí)要考慮的另一個(gè)普通特點(diǎn)是檢測被分析物(例如，抗-類脂抗體)和捕獲試劑(例如，錨定抗體-類脂抗原配合物)之間形成配合物的方法。將檢測劑(也稱為檢測劑試劑)用于這個(gè)目的。可以將檢測劑整合到免疫測定裝置(例如包括在綴合物襯墊中，如下所述)中，或者可以從外部來源施加給裝置。檢測劑可為單種試劑或共同用于檢測目的的一系列試劑。在有些情況中，檢測劑試劑是對于被分析物為特異性的被標(biāo)記的結(jié)合配偶體(例如，用于抗體被分析物的金綴合的A蛋白、或用于人抗體被分析物的金標(biāo)記的抗-人Ab(Fc))。在其它情況中，檢測劑試劑總起來說包括對于被分析物為特異性的未被標(biāo)記的第一結(jié)合配偶體和對于第一結(jié)合配偶體為特異性的被標(biāo)記的第二結(jié)合配偶體等。在各種情況中，檢測劑試劑特異性地檢測被分析物-捕獲試劑配合物的被結(jié)合的被分析物，并且因此優(yōu)選檢測劑試劑實(shí)質(zhì)上不與捕獲試劑或定位在被分析物捕獲區(qū)域中的其它組分結(jié)合或與之反應(yīng)。檢測劑的這種非特異性結(jié)合或反應(yīng)可能提供假陽性結(jié)果。任選地，檢測劑試劑可以特異性地識(shí)別存在于第二捕獲區(qū)域中的陽性對照分子(例如，用于被標(biāo)記的A蛋白檢測劑、或被標(biāo)記的G蛋白檢測劑的非特異性的人IgG、或被標(biāo)記的抗-人Ab(Fc))。優(yōu)選地，用于公開方法或裝置的檢測劑試劑實(shí)質(zhì)上不與固定的錨定抗體-類脂抗原配合物結(jié)合或與之反應(yīng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定特定的檢測劑試劑和特定的錨定抗體-類脂抗原配合物的組合，用以滿足檢測特定被分析物的這種優(yōu)先選擇。例如，對于檢測人抗-類脂抗體，一些非限制性的示例性組合包括類脂抗原錨定抗體檢測劑試劑<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>B.流通裝置的構(gòu)造和設(shè)計(jì)流通裝置包括固定在固相支持體(一般地為膜，例如硝化纖維、尼龍、或PVDF)上的捕獲試劑(例如，錨定抗體-類脂抗原配合物)。有用的膜的特征在前已有描述；然而，需要指出的是，在流通測定法中，毛細(xì)上升不是膜的特別重要的特點(diǎn)，因?yàn)樵跈M向流動(dòng)檢驗(yàn)中，樣品移動(dòng)垂直通過膜而非橫過。在簡單的代表性形式中，流通裝置的膜被布置為與吸收劑層功能接觸或直接接觸(參見，例如，以下對"吸收劑襯墊"的描述)，所述吸收劑層起到儲(chǔ)庫的作用，用于吸引流體樣品通過膜。任選地，在固定捕獲試劑之后，可以將膜上的任何保留的蛋白結(jié)合部位封閉(在施加樣品之前或同時(shí))，以使非特異性相互作用最小化。流通裝置的示例性物理實(shí)施方案如圖IO所示。在操作流通裝置時(shí)，將流體樣品(例如體液樣品)布置為與膜接觸。一般地，流通裝置還包括樣品施加區(qū)域(或儲(chǔ)庫)，以接受和臨時(shí)保持期望體積的流體樣品。樣品通過膜基質(zhì)。在這個(gè)過程中，樣品中的被分析物(例如抗-類脂抗體)可以特異性結(jié)合于固定的捕獲試劑(例如錨定抗體-類脂抗原配合物)。在期望檢測被分析物-捕獲試劑配合物時(shí)，可以將檢測劑試劑(例如，被標(biāo)記的A蛋白、被標(biāo)記的G蛋白、或被標(biāo)記的抗-人IgG(Fc))隨樣品加入，或者在施加樣品之后加入包含檢測劑試劑的溶液。如果被分析物被捕獲試劑特異性結(jié)合，可以觀察到膜表面上的可歸因于特定的檢測劑試劑的視覺表現(xiàn)。可以在工藝的任何時(shí)候(例如，施加樣品之后、和/或在施加檢測劑試劑之后)增加任選的洗滌步驟。C.橫向流動(dòng)裝置的構(gòu)造和設(shè)計(jì)橫向流動(dòng)裝置通常是本領(lǐng)域中已知的。簡而言之，橫向流動(dòng)裝置是具有檢測條(被懷疑包含所關(guān)注的被分析物的試樣流體流動(dòng)通過該檢測條)作為其要素的分析裝置。檢驗(yàn)流體和任何懸浮的被分析物可以沿著條流動(dòng)到檢測區(qū)帶，在其中被分析物(如果存在)與捕獲試劑和檢測劑相互作用，表明被分析物的存在、不存在和/或數(shù)量。已經(jīng)公開了許多橫向流動(dòng)分析裝置，包括在美國專利4，313，734、4,435,504、4,775,636、4,703,017、4,740,468、4，806，311、4,806,312、4,861,711、4，855，240、4,857,453、4,943,522、4,945,042、4，496，654、5，001，049、5,075,078、5,126,241、5,451,504、5,424,193、5,712,172、6,555,390、和6,368,876，EP0810436、和WO92/12428、WO94/01775、WO95/16207、和WO97/06439中所示的那些，所述專利文獻(xiàn)中的每個(gè)都被并入作為參考。許多橫向流動(dòng)裝置是單步橫向流動(dòng)檢驗(yàn)，其中將生物流體置于吸水性條上的樣品區(qū)域中(但是，可使用非吸水性材料，并且通過對該物質(zhì)施加表面活性劑賦予其吸水性)，并且允許其沿著條移動(dòng)，直到流體接觸到與流體中被分析物相互作用的特異性結(jié)合配偶體。一旦被分析物與結(jié)合配偶體相互作用，有信號(例如熒光或以其它方式可見的染料)表明發(fā)生了相互作用。可以將多種離散的結(jié)合配偶體置于條上(例如，為平行線)，用以檢測流體中的多種被分析物。檢測條也可以結(jié)合對照指示劑，其提供已經(jīng)充分進(jìn)行該檢驗(yàn)的信號，即使在條上沒有看見表明被分析物存在(或不存在)的陽性信號。橫向流動(dòng)裝置的構(gòu)造和設(shè)計(jì)為本領(lǐng)域中公知的，如在例如以下描述的，MilliporeCorporation,AShortGuideDevelopingImmunochromatographicTestStrips,2ndEdition,pp.1-40,1999，索取電話(800)645-5476;和Schleicher&Schuell，EasytoWorkwithBioscience,ProductsandProtocols2003，pp.73-98，2003，2003，索取自，Schleicher&SchuellBioscience,Inc.,10OpticalAvenue,Keene,NH03431，(603)352-3810;二者都被全文并入本文作為參考。橫向流動(dòng)裝置具有本領(lǐng)域中同樣公知的多種物理形式。本公開考慮了以適當(dāng)?shù)墓δ荜P(guān)系支持和/或容納橫向流動(dòng)裝置的基礎(chǔ)組件的任何物理形式。圖7顯示了橫向流動(dòng)裝置的幾個(gè)實(shí)例。這些實(shí)例顯示了可用于構(gòu)造橫向流動(dòng)裝置的一些物理實(shí)施方案。在圖8中說明橫向流動(dòng)裝置的特定實(shí)施方案的基礎(chǔ)組件，其顯示的特定實(shí)施方案為其中延長的外殼10包含實(shí)質(zhì)上在外殼10的整個(gè)長度上延伸的吸水性橫向流動(dòng)條12。橫向流動(dòng)條12分為位于進(jìn)樣口15下的近端點(diǎn)樣襯墊14、中間的檢驗(yàn)結(jié)果膜16、和遠(yuǎn)端的吸收劑襯墊18。流動(dòng)條12被包含被標(biāo)記的綴合物(例如金綴合的A蛋白、金綴合的G蛋白、金綴合的抗-人Ab)的綴合物襯墊20中斷。沿著條12的流動(dòng)通道從近端襯墊14通過、通過綴合物襯墊20、進(jìn)入檢驗(yàn)結(jié)果膜16，最終在吸收劑襯墊18中收集。選擇性的結(jié)合試劑(例如錨定抗體-類脂抗原配合物)被布置在檢驗(yàn)結(jié)果膜16中的近端檢驗(yàn)線22上。在檢驗(yàn)結(jié)果膜16中檢驗(yàn)線22的略遠(yuǎn)端提供對照線24。在操作圖8中說明的橫向流動(dòng)裝置的特定實(shí)施方案時(shí)，通過樣品引入口15將包含所關(guān)注的被分析物(例如抗-類脂抗體)的流體樣品施用于樣品襯墊。在某些實(shí)例中，可通過滴加將樣品施用于樣品引入口15，或者，較不優(yōu)選地，通過將包含樣品引入口15的裝置的末端浸入樣品中施加樣品。在其中樣品是全血的其它實(shí)例中，向血液樣品加入任選的展開劑流體，以引起紅細(xì)胞溶解，并且在一些情況中對全血樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂?。對于樣品襯墊14，樣品通過例如毛細(xì)管作用流到綴合物襯墊20。在綴合物襯墊20中，所關(guān)注的被分析物可以與被移動(dòng)的或可移動(dòng)的檢測劑試劑結(jié)合(或被其結(jié)合)。例如，抗-類脂抗體被分析物可以結(jié)合于包含在綴合物襯墊中的金綴合的A蛋白檢測劑試劑與檢測劑試劑配合的被分析物可隨后流向檢驗(yàn)結(jié)果膜16，在其中配合物可以進(jìn)一步與被固定近端檢驗(yàn)線22的被分析物特異性結(jié)合配偶體(例如錨定抗體-類脂抗原配合物)相互作用。在某些實(shí)例中，與檢測劑試劑(例如金綴合的A蛋白、金綴合的G蛋白、或金綴合的抗-人Ab)配合的抗-類脂抗體可以進(jìn)一步結(jié)合于未被標(biāo)記、固定在近端檢驗(yàn)線22的錨定抗體-類脂抗原配合物。在抗-類脂抗體、被標(biāo)記的(例如，金綴合的)檢測劑試劑、和固定的錨定抗體-類脂抗原配合物之間形成免疫配合物可以通過在近端檢驗(yàn)線22出現(xiàn)的可見譜線而檢測到，所述譜線是由標(biāo)記(例如，金)積聚在近端檢驗(yàn)線22的定位區(qū)域中產(chǎn)生的。對照線24可以包含固定的、檢測劑試劑特異性的結(jié)合配偶體，其可以在有或沒有被分析物的存在下結(jié)合檢測劑試劑。在對照線24的這種結(jié)合表明檢驗(yàn)的特有性能，甚至在沒有所關(guān)注的被分析物的存在下。在橫向流動(dòng)裝置的另一個(gè)實(shí)施方案中，在檢驗(yàn)結(jié)果膜16中有與檢驗(yàn)線22平行或垂直(或以任何其它空間關(guān)系)設(shè)置的第二檢驗(yàn)線。這種特定的實(shí)施方案的操作與剛剛前段所述的實(shí)施方案相似，需要另外考慮以下(i)在綴合物襯墊中還可包含對第二被分析物為特異性的第二檢測劑試劑，例如抗-梅毒螺旋體抗體，和(ii)第二檢驗(yàn)線包含對樣品中的第二被分析物有親和力的第二特異性結(jié)合配偶體。例如，第二檢驗(yàn)線可以包含特異性地結(jié)合存在于樣品中的抗-梅毒螺旋體抗體的固定的密螺旋體抗原?？捎糜跈M向流動(dòng)裝置的組件的一些材料如表1中所示。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該認(rèn)識(shí)到用于特定的橫向流動(dòng)裝置的特定材料取決于許多變量，包括例如待檢測的被分析物、樣品體積、期望的流速和其它變量，因此可以例行選擇有用的材料。表l.<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>紙1.樣品襯墊樣品襯墊(例如，圖8中的樣品襯墊14)是橫向流動(dòng)裝置用于最初接受樣品的任選的構(gòu)件，并且可以用于從樣品除去微粒。在可用于構(gòu)造樣品襯墊(參見表1)的各種材料中，如果大的床體積(例如，250ixl/cm2)是特定應(yīng)用中的要素，則纖維素樣品襯墊可能是有益的。樣品襯墊可用一種或多種脫模劑處理，例如緩沖劑、鹽、蛋白質(zhì)、洗滌劑、和表面活性劑。這種脫模劑可用于例如促進(jìn)綴合物襯組分的再溶解，和用于封閉橫向流動(dòng)裝置的其它組件例如硝化纖維膜中的非特異性結(jié)合部位。代表性的脫模劑包括例如海藻糖或葡萄糖(1%-5%)、PVP或PVA(0.5%-2%)、Tween-20或Triton-X-lOO(0.1%-1%)、酪蛋白(1%-2%)、SDS(0.02%-5%)、和PEG(0.02%-5%)。2.膜和施用溶液可用于橫向流動(dòng)裝置的膜的類型(例如硝化纖維、尼龍和PVDF)以及對這種膜施加捕獲試劑需要考慮的事項(xiàng)已經(jīng)在前面有所論述。3.綴合物襯墊綴合物襯墊(例如圖8中的綴合物襯墊20)尤其是用于容納檢測劑試劑。在一些實(shí)施方案中，可從外部施加檢測劑試劑，例如，從展開劑瓶，在這種情況中，橫向流動(dòng)裝置無須包含綴合物襯墊(參見，例如美國專利4,740,468)。在施加檢驗(yàn)樣品時(shí)，包含于綴合物襯墊中的檢測劑試劑被釋放到溶液中。綴合物襯墊可用各種物質(zhì)處理，以影響檢測劑試劑釋放到溶液中。例如，綴合物襯墊可用PVA或PVP(0.5%到2%)和/或TritonX-100(0.5%)處理。其它脫模劑包括但不限于羥丙基甲基纖維素、SDS、Brij和e-乳糖。在任何給定應(yīng)用中，可使用兩種或多種脫模劑的混合物。在公開的特定實(shí)施方案中，綴合物襯墊20中的檢測劑試劑為被標(biāo)記的A蛋白、G蛋白、或抗-人IgG(Fc)。4.吸收劑襯墊在橫向流動(dòng)裝置中使用吸收劑襯墊18是任選的。吸收劑襯墊起到增加進(jìn)入裝置的樣品總量的作用。這種增加的體積可用于例如從膜洗掉未結(jié)合的被分析物。多種材料的任一種都可用于制備吸收劑襯墊，參見例如表1。在一些裝置實(shí)施方案中，吸收劑襯墊可以是紙(g卩，纖維素纖維)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可基于例如厚度、可壓縮性、可制造性、和床體積的均勻性選擇紙吸收劑襯墊?？赏ㄟ^改變吸收劑襯墊的尺寸(通常為長度)調(diào)節(jié)生產(chǎn)的吸收劑的體積吸收量(vohimeuptake)。D.聯(lián)合裝置在一些實(shí)施方案中，上述討論到的每一免疫測定裝置(例如，浸量尺、流通裝置或橫向流動(dòng)裝置)可通過增加包含對所關(guān)注的其它被分析物為特異性的捕獲試劑的第二、第三或更多捕獲區(qū)域而制成用于檢測多種被分析物的形式。具體地，本公開考慮了同時(shí)檢測流體樣品(例如，人血清)中的抗-類脂抗體和密螺旋體或抗-密螺旋體抗體的免疫測定裝置。這種聯(lián)合裝置另外包括密螺旋體捕獲區(qū)域，其包括(a)能夠被抗-梅毒螺旋體抗體特異性結(jié)合的固定的密螺旋體抗原，或(b)特異性地結(jié)合移動(dòng)的密螺旋體抗原的固定的抗-梅毒螺旋體抗體。如本文中使用的，"密螺旋體抗原"是包含至少一個(gè)特異性地結(jié)合抗-梅毒螺旋體抗體的抗原決定簇的抗原。本領(lǐng)域中已經(jīng)描述了許多密螺旋體抗原；參見，例如，美國專利6,479,248、6，248，331、5,681,934、5，578，456、4,868,118和4,740,467。例如，已經(jīng)描述了至少以下表觀分子量的多肽作為梅毒螺旋體抗原16-20kDa、18kDa、18-23kDa、25kDa、35kDa、37kDa、37-46kDa、38kDa、39kDa、41kDa、43kDa、44kDa、46kDa、47kDa、58kDa、150kDa、和180kDa(關(guān)于更具體的細(xì)節(jié)，參見美國專利4,846,118)。密螺旋體抗原和抗-梅毒螺旋體抗體是多肽；因此，在用作捕獲試劑時(shí)，這些分子可以直接地附著于固相支持體(例如，硝化纖維、尼龍或PVDF)。盡管如此，考慮到密螺旋體抗原或抗-梅毒螺旋體抗體可以通過任何可用的方法(直接或間接地)固定在固相支持體上。檢測劑試劑可用于檢測密螺旋體捕獲試劑和密螺旋體特異性被分析物(例如，密螺旋體、密螺旋體抗原、或抗-密螺旋體抗體)之間形成配合物。在一些實(shí)施方案中，檢測劑試劑(例如抗-人Ab(Fc》可以特異性地結(jié)合密螺旋體特異性被分析物(例如，人抗-密螺旋體抗體)和結(jié)合的抗-類脂抗體被分析物(例如，人抗-類脂抗體)。在其它情況中，考慮了用于特異性檢測密螺旋體特異性被分析物(例如，抗-密螺旋體抗體或密螺旋體抗原)或結(jié)合的抗-類脂抗體被分析物的兩種單獨(dú)的檢測劑試劑。用于進(jìn)行同時(shí)的密螺旋體和非密螺旋體檢驗(yàn)的免疫測定裝置的操作實(shí)質(zhì)上與本說明書中其它地方所述的裝置相似。聯(lián)合裝置的一個(gè)特別的特點(diǎn)在于施加于樣品施加區(qū)域的流體樣品能夠接觸(例如，流向或流過)抗-類脂抗體捕獲區(qū)域和密螺旋體捕獲區(qū)域中的每一個(gè)。VI.試劑盒本文中公開的是用于檢測樣品(例如，生物樣品)中的抗-類脂抗體的試劑盒。這種試劑盒也可用于例如診斷其中存在抗-類脂抗體的存在是該疾病的征兆的疾病(例如，梅毒或狼瘡)。公開的試劑盒的某些實(shí)施方案通常是便攜的，并且提供簡單的、快速的、和/或成本有效的檢測抗-類脂抗體和/或診斷疾病(例如梅毒)的方法，而無需例如床邊設(shè)備中的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備。試劑盒包括一個(gè)或多個(gè)本文中公開的免疫測定裝置和攜帶設(shè)備，例如箱、袋、罩、塑料紙板箱(例如模制塑料或其它透明包裝)、封套(例如，密封的或可密封的塑料、紙、或金屬封套)、或其它容器。在某些實(shí)例中，試劑盒組件被裝入單個(gè)包裝單元中，例如箱或其它容器，該包裝單元可具有其中可放置試劑盒的一個(gè)或多個(gè)組件的隔室。在其它實(shí)例中，試劑盒包括一個(gè)或多個(gè)容器，例如小瓶、管等，其可以保持例如一種或多種待檢測的生物樣品、陽性和/或陰性對照樣品或溶液(例如，包含抗-類脂或密螺旋體抗體的陽性對照血清)、稀釋劑(例如，磷酸鹽緩沖劑、或鹽水緩沖劑)、檢測劑試劑(例如，用于外部施加給試劑盒裝置)、用于使檢測劑試劑酶可視的底物試劑(例如，5-溴-4-氯-3』引哚基磷酸酯、二甲基甲酰胺中的氮藍(lán)四唑)、和/或洗液(例如Tris緩沖液、鹽水緩沖液、或蒸餾水)。其它試劑盒實(shí)施方案包括注射器、手指剌破裝置、乙醇藥簽、紗布塊、棉球、繃帶、乳膠手套、具有不同數(shù)量槽的孵育托盤、粘合板密封物(adhesiveplatesealer)、數(shù)據(jù)報(bào)告片(可用于處理、收集和/或處理生物樣品)。試劑盒還可以任選包含可用于將樣品引入到免疫測定裝置的樣品室的工具，包括例如滴管、一次性移液管、毛細(xì)管、橡膠吸球(例如，用于毛細(xì)管)、等等。其它試劑盒實(shí)施方案可以包括用于拋棄用過的免疫測定裝置的一次性設(shè)備和/或與該裝置使用的其它物品(例如，患者樣品等)。這種一次性設(shè)備可以包括但不限于能夠包含從所拋棄的材料的漏出物的容器，例如塑料、金屬或其它不可滲透的袋、箱或容器。在某些實(shí)例中，公開的試劑盒包括檢驗(yàn)該免疫測定裝置的說明書。該說明書可以提供關(guān)于如何向檢驗(yàn)裝置施加樣品、等待形成結(jié)果所需或合理的時(shí)間量的指導(dǎo)，和關(guān)于如何讀取和解釋檢驗(yàn)結(jié)果的詳述。這種說明書還可以包含標(biāo)準(zhǔn)，例如用于比較檢驗(yàn)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)表格、圖表、或圖。這些標(biāo)準(zhǔn)樣品可以任選地包括使用檢驗(yàn)裝置定性被分析物所需的信息，例如使信號強(qiáng)度或信號線數(shù)與存在于樣品中的被分析物的量相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)施例提供以下實(shí)施例用以說明某些具體特點(diǎn)和/或?qū)嵤┓桨?。不?yīng)理解這些實(shí)施例將本發(fā)明限制于所述的具體特點(diǎn)或?qū)嵤┓桨?。?shí)施例1USR類脂抗原的制備本實(shí)施例描述了使用公開的方法制備示例的類脂抗原，USR抗原，其可以連接于固相支持體例如硝化纖維。如本實(shí)施例中所述，可以制約備100ml的USR抗原；然而本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，所述的流程可以放大或縮小，以產(chǎn)生分別為更多或更少的USR抗原。此外，除非明確表明，本實(shí)施例和以下實(shí)施例中的所有方法步驟、反應(yīng)等在室溫下進(jìn)行(例如，從約20。C到約25。C)。將八(8)ml的VDRL緩沖鹽水(10克NaCl、0.5ml甲醛、0.093克磷酸氫二鈉、和0.170克磷酸二氫鉀，在1升蒸餾水中)加入到250ml的圓形玻璃塞瓶中。在40到60秒的時(shí)間內(nèi)，在連續(xù)轉(zhuǎn)動(dòng)瓶子的情況下將10mlVDRL抗原(0.9。/。膽固醇、0.03。/。牛的心臟心磷月旨、和約0.210/0卵磷脂，在乙醇中)直接加在緩沖鹽水上。在加入VDRL抗原之后繼續(xù)旋轉(zhuǎn)瓶子約10秒。然后，向反應(yīng)混合物加入82mlVDRL緩沖鹽水。在瓶子帶有蓋子的情況下，在10秒內(nèi)將瓶顛倒搖動(dòng)約30次。將經(jīng)搖動(dòng)的混合物的約19ml等分在室溫下在斜角離心機(jī)(Sorva11SS-3)的不銹鋼管中以約2000xg的相對離心力離心15分鐘(從離心機(jī)達(dá)到期望速度時(shí)計(jì)時(shí))。通過將管反轉(zhuǎn)離開包含沉淀物質(zhì)的側(cè)面而小心地傾析上清液。在除去上清液之后，將離心管反轉(zhuǎn)并且用棉紗布擦拭，而不擾動(dòng)沉淀。然后在溫和的搖動(dòng)下將沉淀再懸浮在與離心的抗原懸浮液相等體積(在這種情況中為19ml)的再懸浮溶液(3.72。/。EDTA、40。/。氯化膽堿(v/v)、磷酸鹽緩沖鹽水pH6.9±O.l)中。將所有再懸浮的沉淀在玻璃塞的瓶子中重組并且溫和地渦旋混合，以形成抗原制備物。然后將抗原制備物置于冷藏箱(從約2匸到約8。C)約一周，以使其穩(wěn)定。實(shí)施例2梅毒螺旋體感染的人血清的硫酸銨分級分離這個(gè)實(shí)施例描述了用于從血清分離包含免疫球蛋白的一個(gè)方法。這個(gè)實(shí)施例的方法(以及本領(lǐng)域通常通常已知的其它免疫球蛋白分離方法)可用于從任何來源的血清(包括得自非人主體，例如兔，的血清)部分純化免疫球蛋白。得自感染梅毒螺旋體的人類患者的血清(在本實(shí)施例和以下實(shí)施例中稱為"超免疫抗血清，，)得自BiomedicalResources(Hatboro，PA)。將期望量的超免疫抗血清置于容納超過兩倍血清量的容器中。在攪拌下，向血清緩慢滴加等于血清量的70%飽和硫酸銨。將這個(gè)混合物在室溫?cái)嚢杓s4小時(shí)，然后在約3000rcf離心30分鐘。在離心之后，將上清液拋棄并將沉淀的包含免疫球蛋白的級分再懸浮在等于原始血清血清量的蒸餾水中。然后，在攪拌下向再懸浮的包含免疫球蛋白的級分滴加等量的70%飽和硫酸銨溶液，將混合物離心，將上清液傾析掉，并將沉淀物如上所述再懸浮。然后再一次重復(fù)這個(gè)過程。將最終的包含免疫球蛋白的沉淀物用蒸餾水再懸浮為原來血清量的十分之一。在2-8。C下將再懸浮的包含免疫球蛋白的級分相對三個(gè)100x量的0.85%氯化鈉pH8.0透析過夜。根據(jù)生產(chǎn)商的說明書說明書通過Bio-RadBradford蛋白測定法測定透析保留物中的總蛋白濃度。實(shí)施例3使用A蛋白親和柱純化IgG使用A蛋白瓊脂糖色譜分離法從包含免疫球蛋白的級分分離IgG。如本領(lǐng)域中己知的已知的，A蛋白特異性地結(jié)合于得自各種哺乳動(dòng)物種類的IgG的Fc區(qū)域。將包含1000ml的20mM磷酸鈉緩沖液，pH7.4("磷酸鹽緩沖液")的緩沖液儲(chǔ)庫連接于10ml的A蛋白SepharoseCL-4B柱(Pharmacia)。將柱用200ml的磷酸鹽緩沖液洗滌，并且測量洗脫液的pH。直到洗脫液的pH為7.3±0.2的范圍內(nèi)之后，向柱加載包含免疫球蛋白的樣品。在從緩沖液儲(chǔ)庫斷開之后，對柱施加得自實(shí)施例2的包含免疫球蛋白的透析保留物，小心不要擾動(dòng)柱基質(zhì)的表面。然后，向柱加入20ml磷酸鹽緩沖液，將緩沖液儲(chǔ)庫再連接于柱，并且使用裝有80-12x125mm直徑管的級分收集器收集級分。在280nm監(jiān)測柱洗脫液的吸光度。當(dāng)洗脫液在280nm的吸光度回到基線(表明實(shí)質(zhì)上完成了非特異性蛋白的洗脫)時(shí)，將包含500ml的100mM甘氨酸pH2.7的第二緩沖液儲(chǔ)庫與柱連接。再次，收集級分，同時(shí)在280nm監(jiān)測洗脫液的吸光度。將具有0.1或更大的280nm吸光度的甘氨酸緩沖液中洗脫的所有級分合并。這種級分包括被A蛋白特異性結(jié)合的蛋白，S卩，存在于梅毒螺旋體感染的人血清中的IgG。使用2.0MTris緩沖液調(diào)節(jié)合并的溶液的pH至7.2士0.2，并且如前所述測定總蛋白濃度。實(shí)施例4A蛋白-純化的IgG到溶液中USR抗原的特異性結(jié)合測定如實(shí)施例3中所述得到的A蛋白純化的IgG的終點(diǎn)滴度。制備lgG樣品在0.9。/。鹽水中的系列稀釋物(從l:2到1:512)。將每種稀釋物的五十(50)!U置于2x3英寸玻璃載片上的10個(gè)圈(14mm)的每一個(gè)中。將如實(shí)施例1中所述制備的USR抗原溫和地再懸浮并且吸入處于垂直位置的分配針和注射器中。分配幾滴并且拋棄，以清除針中的空氣。然后，將1滴(自由落下的)(約22"l)抗原懸浮液加入到包含IgG的每個(gè)圈中。將玻片置于180±2rpm的機(jī)械旋轉(zhuǎn)器上4分鐘。當(dāng)在其中蒸發(fā)可能是問題的干燥氣候中進(jìn)行這個(gè)試驗(yàn)時(shí)，有利的是在旋轉(zhuǎn)步驟過程中將玻片置于潮濕的濕潤蓋罩下。在旋轉(zhuǎn)之后立即將玻片在顯微鏡下觀察，使用10x目鏡和10x物鏡，以決定其中存在反應(yīng)絮結(jié)物。測定IgG滴度為產(chǎn)生弱的陽性反應(yīng)的最高稀釋度。將A蛋白純化的IgG樣品的原始量在第一稀釋物量的磷酸鹽緩沖鹽水pH7.2±0.2("PBS")中稀釋到1:2048的有效抗體滴度。因此，在其中樣品的終點(diǎn)滴度為1:32的一種情況中，將一個(gè)量的樣品用64倍的磷酸鹽緩沖鹽水pH7.2±0.2("PBS")稀釋(在其它實(shí)施例中，1:16終點(diǎn)滴度的血清用128倍的PBS稀釋，1:64終點(diǎn)滴度的血清用32倍PBS稀釋，等等)。然后，在溫和的混合下，向稀釋的IgG樣品中加入等于純化的IgG的原始量的USR膠束(如實(shí)施例1所述制備)。允許混合物在2-8'C澄清幾天，直到上清液澄清。然后，除去上清液并且用等于第一稀釋物量的PBS代替(例如，在前述情況中為64倍PBS)。重復(fù)前述步驟，直到上清液澄清。在除去最終的上清液之后，使用量筒測量沉淀物質(zhì)的量(包含USR膠束-抗體(IgG)配合物，也稱為IgG-涂覆的膠束)，并且通過Bradford方法測定IgG-涂覆的膠束的蛋白濃度。實(shí)施例5Fab片段的制備和分離使用CentriconTM離心過濾器(Millipore)將A蛋白-純化的IgG(如實(shí)施例3所述制備)濃縮到約20mg/ml，并且相對2x1000ml樣品緩沖液(20mM磷酸鈉、lOmMEDTA,pH7,0)透析。通過反轉(zhuǎn)或溫和的搖動(dòng)將固定在6%交聯(lián)的珠狀瓊脂糖上的木瓜蛋白酶在50%甘油、0.1M乙酸鈉(pH4.4)和0.05。/。疊氮化鈉(Pierce)中的50%漿狀物中混合，以得到均勻的懸浮液。然后向玻璃試管或其它適合的反應(yīng)容器中加入2.5ml的漿狀物。為了使凝膠平衡，向漿狀物加入20ml新制備的消化緩沖液(20mM磷酸鈉、10mMEDTA、20mM半胱氨酸-HCl,pH7.0)。然后，通過離心從緩沖液分離凝膠，并且用另外的20ml消化緩沖液重復(fù)這個(gè)過程。將經(jīng)過平衡的凝膠再懸浮在2.5ml消化緩沖液中。將A蛋白純化的IgG(2.5ml的10mg/ml溶液)用2.5ml消化緩沖液稀釋。將IgG溶液加入到包含固定的木瓜蛋白酶的試管或容器中，并將混合物在37t:水浴中在高速的振蕩器中孵育五小時(shí)到過夜。在孵育過程中保持凝膠的穩(wěn)定混合。在孵育之后，向反應(yīng)混合物中加入7.5ml的10mMTris-HCl，pH7.5，并通過在300rpm離心25分鐘分離混合物。從沉淀的被固定的木瓜蛋白酶除去上清液(其包含免疫球蛋白片段)。將上清液如實(shí)施例3中所述過A蛋白柱。如圖1所示，回收了兩個(gè)蛋白峰。沒有特異性地結(jié)合A蛋白的峰I是免疫球蛋白片段的Fab級分，特異性地結(jié)合A蛋白的峰II是Fc級分。如前所述測定Fab和Fc級分的蛋白濃度。實(shí)施例6對包含免疫球蛋白的樣品的聚丙烯酰胺SDS梯度凝膠分析本實(shí)施例顯示了在實(shí)施例2、3和5中產(chǎn)生的各個(gè)樣品的蛋白質(zhì)含量。使用具有4%積層凝膠的Bio-RadTM預(yù)澆鑄的10-20%線性聚丙烯酰胺梯度凝膠按大小分離存在于硫酸銨免疫球蛋白級分(參見實(shí)施例2)、.A蛋白峰I和II(參見實(shí)施例3)、在木瓜蛋白酶消化前后用A蛋白純化的IgG(參見實(shí)施例5)、和在木瓜蛋白酶消化之后的IgG峰I(Fab級分)和II(Fc級分)(參見實(shí)施例5)中的蛋白質(zhì)譜帶。將樣品(2.5ug/u1)在Laemmli樣品緩沖液(62.5mMTris-HCl、2%SDS,pH6.8、2。/oSDS禾B25%甘油(不含e巰基乙醇))中1:1稀釋。將樣品加熱并且加載在各自的孔中。槽緩沖液是Tris-甘氨酸-SDS(25mMTris-HCl,pH8.3、192mM甘氨酸、0.1%SDS)。凝膠在200伏特下運(yùn)行45分鐘。在用1120洗滌三次之后，將凝膠用PierceGelCodeBlue染色30分鐘，然后通過用水重復(fù)洗滌洗凈。如圖2所示，人超免疫(梅毒)血清(泳道2)的硫酸銨沉淀級分包含顯著高分子量的蛋白譜帶的混合物。如圖2所示，泳道4為相對純的IgG級分，被A蛋白柱結(jié)合并且從柱洗脫。對A蛋白純化的IgG進(jìn)行木瓜蛋白酶消化產(chǎn)生蛋白質(zhì)的混合物(泳道6)，其可通過在A蛋白柱上的分級分離分為兩個(gè)蛋白質(zhì)群。圖2的泳道7表明，約54kD的一個(gè)主要的木瓜蛋白酶消化的IgG片段沒有被A蛋白柱保留。這個(gè)表觀分子量是期望的Fab片段大小。在泳道7中實(shí)質(zhì)上沒有觀察到更高分子量的蛋白質(zhì)譜帶(代表例如Fab2或Fc片段或未消化的IgG)。具有期望的Fc片段和未消化的IgG的分子量的蛋白質(zhì)被A蛋白柱保留(泳道8)。實(shí)施例7A蛋白膠態(tài)金綴合物不檢測Fab片段將IgG的一(l)y1的木瓜蛋白酶消化級分(如實(shí)施例5中所述制備)在5mmx4cm硝化纖維膜上點(diǎn)樣并且干燥過夜。將在具有0.25M氯化鈉的10mM磷酸鹽緩沖液，pH7.4中的一百(100)y1的1%酪蛋白置于微量滴定板的相應(yīng)孔中。將與膠態(tài)金綴合的二(2)"1的A蛋白混合到各個(gè)孔中并將相應(yīng)的條置于各個(gè)孔中。如圖3所示，膠態(tài)金A蛋白綴合物檢測IgG和Fc級分而不檢測Fab級分。實(shí)施例8測定用于連接于USR膠束的Fab的有用量將實(shí)施例5中所述制備的Fab片段在PBS中稀釋到1000ug/u1、100ug/ul、10ug/ul、1ug/ul、lOOng/ul禾卩10ng/ii1。將各個(gè)Fab級分稀釋物與等量的如實(shí)施例1中所述制備的USR膠束溶液混合。將一(l)y1的這種Fab-USR膠束混合物點(diǎn)樣在5mmx4cm硝化纖維膜上并且在室溫干燥過夜。將人抗血清(其1:64稀釋物在RPR檢驗(yàn)中有反應(yīng)性)在由1%酪蛋白、lOmM磷酸鹽、0.25m氯化鈉pH7.4組成的緩沖液中1:400稀釋。將類似稀釋的RPR-非反應(yīng)性人血清用作陰性對照。將一百(IOO)yl抗血清(或非反應(yīng)性血清)和2u1膠態(tài)金A蛋白在微量滴定板的幾個(gè)孔的每一個(gè)中合并。在室溫下，將包含與干燥Fab-反應(yīng)的類脂抗原的單個(gè)硝化纖維條置于各個(gè)孔中足以使置于孔中的組分沿著膜移動(dòng)到其中點(diǎn)樣Fab-USR膠束混合物的位置的時(shí)間。如圖4所示，具有結(jié)合于USR抗原的1000、IO或O.IugFab的硝化纖維條與具有RPR-反應(yīng)性(R)人血清產(chǎn)生陽性反應(yīng)。對于包含RPR-不反應(yīng)性(NR)血清的任何樣品都沒有觀察到反應(yīng)。這個(gè)實(shí)施例證明，至少約100ng到約1mg的Fab片段(例如，約100ng到約450ng)可以與USR抗原制備物反應(yīng)(參見實(shí)施例1)，以促進(jìn)類脂抗原對硝化纖維膜的連接而對免疫測定試驗(yàn)(例如，檢測條、和流通和/或橫向流動(dòng)裝置)中USR抗原與血清抗-類脂抗體的反應(yīng)性沒有實(shí)質(zhì)的不利影響。如這個(gè)實(shí)施例中所述的一個(gè)非限制性的有用的Fab片段量為約10ug。實(shí)施例9測定用于經(jīng)親和力純化的兔抗-人IgG(Fc)結(jié)合膠態(tài)金的有用的pH這個(gè)實(shí)施例說明了代表性方法，用于確定使經(jīng)親和力純化的兔抗-人IgG(Fc)(Rockland，Gilbertsville，Pa.)與膠態(tài)金綴合的有用的pH。兔抗-人IgG(Fc)僅僅特異性地結(jié)合人IgG的Fc部分，而不結(jié)合于人IgG的Fab或其它非Fc區(qū)域。具有這種特異性的抗體也稱為"抗-人Fc"。膠態(tài)金制備物(例如，在這個(gè)和其它實(shí)施例中描述的那些)可用作公開的免疫測定法(包括，例如，檢測條、和流通和/或橫向流動(dòng)裝置)中的檢測劑試劑。將約25ml的lOmM磷酸鹽緩沖液置于50ml燒杯中，并且用0.2M磷酸調(diào)節(jié)pH5.0。將pH5.0的兩個(gè)0.5ml等分轉(zhuǎn)移到兩個(gè)12x75mm試管中，一個(gè)標(biāo)記為"檢驗(yàn)"，另一個(gè)標(biāo)記為"對照"。然后，繼續(xù)使用0.2M碳酸鉀調(diào)節(jié)保留在燒杯中的磷酸鹽緩沖液的pH到5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、和10.0。在每個(gè)pH下，如對于pH5.0樣品所述，將兩個(gè)0.5ml等分轉(zhuǎn)移到"檢驗(yàn)"和"對照"試管中。然后，向每個(gè)"檢驗(yàn)"和"對照"管中加入30ug的經(jīng)親和力純化的兔抗-人IgG(Fc)，并將管的內(nèi)容物充分混合。將約25ml的40nm膠態(tài)金(1%溶液)(BritishBiocellInternational,London,England)置于單獨(dú)的50ml燒杯中，并且如上所述在pH5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、和10.0生產(chǎn)一系列"對照"和"檢驗(yàn)"膠態(tài)金樣品。將各個(gè)pH的膠態(tài)金的一(l)ml膠態(tài)金加入到具有相應(yīng)pH的"檢驗(yàn)"和"對照"溶液中。將金/兔抗-人IgG(Fc)溶液充分混合，并且在室溫孵育20分鐘。然后，向標(biāo)記"檢驗(yàn)"的試管組加入200iU的2MNaCl，而向標(biāo)記"對照"的試管組加入200!U的蒸餾水。將兩組試管的內(nèi)容物在室溫孵育30分鐘。相對于相應(yīng)的"對照"樣品在580nm(0058。)讀取各個(gè)"檢驗(yàn)"樣品的光密度。測定具有最低OD58Q的樣品的pH為用于形成金綴合制備物的有利的pH。由于在制造工藝過程中吸附在金顆粒表面上的負(fù)離子層，膠態(tài)金顆粒具有帶負(fù)電荷的表面。蛋白質(zhì)，例如IgG會(huì)通過離子性、疏水性、和配價(jià)相互作用被吸引向帶負(fù)電荷的金顆粒。這些相互作用被認(rèn)為是形成膠態(tài)金-蛋白質(zhì)綴合物的基礎(chǔ)。在綴合于金顆粒的蛋白質(zhì)的pl(即，其中蛋白質(zhì)具有零凈電荷時(shí)的pH)，綴合物是最穩(wěn)定的。NaCl對未綴合的膠態(tài)金顆粒的加成會(huì)破壞被吸附在金表面上的負(fù)電荷離子層。結(jié)果，金顆粒離解并且最終將金離子(即，Au+)釋放到溶液中?？梢栽贠Ds8o測量游離的金離子。相反，蛋白-金綴合物在綴合物的蛋白質(zhì)組分的pI時(shí)耐受被NaCl破壞。因此，具有最低0058()的樣品pH是進(jìn)行金綴合反應(yīng)以得到穩(wěn)定的金綴合物的有用的pH。如圖5所示，用于使30ug兔抗-人IgG(Fc)與10yg膠態(tài)金(即，1ml的1%溶液)綴合的有用的pH為約pH9.5。在這個(gè)實(shí)施例中描述的方法廣泛地適用于可與金綴合用于公開的免疫測定法的許多其它蛋白質(zhì)(例如A蛋白或G蛋白)。另外，認(rèn)為所述反應(yīng)可根據(jù)蛋白質(zhì)和金綴合物的其它量而改變。實(shí)施例10測定用于膠態(tài)金綴合的有用的蛋白質(zhì)濃度這個(gè)實(shí)施例說明用于測定用于與膠態(tài)金的綴合反應(yīng)的有用的蛋白質(zhì)濃度的示例性方法。膠態(tài)金制備物(例如，在這個(gè)和其它實(shí)施例中描述的那些)可用作公開的免疫測定法(包括，例如，檢測條、和流通和/或橫向流動(dòng)裝置)中的檢測劑試劑。將0.5ml的10mM磷酸鹽緩沖液(調(diào)節(jié)到如實(shí)施例9中所述產(chǎn)生最低OD5so的pH)加入到各5個(gè)試管的2個(gè)組中。一組試管標(biāo)記為"檢驗(yàn)"，另一組標(biāo)記為"對照"。將30ug、20"g、10ug、5ug、或2.5tig的兔抗-人IgG(Fc)加入到一系列試管的每一個(gè)中，并且充分混合。向每個(gè)試管加入lml的40nm膠態(tài)金(l。/。溶液，調(diào)節(jié)到與磷酸鹽緩沖液相同的pH)。將樣品在室溫孵育20分鐘。然后向標(biāo)記"檢驗(yàn)"的樣品加入200yl的2MNaCl，而向標(biāo)記"對照"的樣品加入200yl的蒸餾水。在室溫孵育30分鐘之后，相對相應(yīng)的對照樣品讀取檢驗(yàn)樣品的OD58Q。生產(chǎn)最低OD58Q的兔抗-人IgG(Fc)的最低濃度表示用于形成蛋白質(zhì)-金綴合物制備物的有用的濃度(或濃度范圍)。在這個(gè)實(shí)施例中，生產(chǎn)最低OD58。的兔抗-人IgG(Fc)的最低濃度表示其中有用量的兔抗-人IgG(Fc)與金顆粒結(jié)合的濃度。兔抗-人IgG(Fc)的濃度越高，盡管有用，但是較不優(yōu)選，因?yàn)檫^量的兔抗-人IgG(Fc)可以通過例如在之前已經(jīng)與金顆粒結(jié)合的兔抗-人IgG(Fc)分子層上分層(layering)而與金顆粒形成較弱的結(jié)合。如圖6中所示，約30Ug是用于與lOyg膠態(tài)金綴合的兔抗-人IgG(Fc)的有用量(即，1ml的1%溶液)。這個(gè)實(shí)施例中所述的方法廣泛地適用于可用于公開的免疫測定法中與金綴合的許多其它蛋白質(zhì)(例如A蛋白或G蛋白)。另外，認(rèn)為所述反應(yīng)可根據(jù)蛋白質(zhì)和金綴合物的其它量而改變。A.金綴合物"小型制備物"的制備通過將5ml的10mM硼酸鹽緩沖液加入到得到如上所述的有用蛋白質(zhì)濃度(例如，30"g)所需量的兔抗-人IgG(Fc)中制備兔抗-人Fc金綴合物小型制備物。然后，再如上所述將這個(gè)蛋白質(zhì)溶液調(diào)節(jié)到有用的pH(例如，pH9.5)。在充分混合下將10ml的40nm膠態(tài)金(P/。溶液，調(diào)節(jié)到有用的pH)加入到pH得到調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)溶液中。將混合物在室溫孵育20分鐘。然后，加入1.6ml的10%酪蛋白到1%酪蛋白的最終濃度，并且在室溫繼續(xù)孵育另外的20分鐘。將反應(yīng)混合物在6500xg離心10分鐘，并將上清液除去并且拋棄。將團(tuán)粒(pdlet)再懸浮在0.5ml的重懸浮緩沖液(150mMNaCl、20mMTrizma堿、10%蔗糖、5%海藻糖、0.1%酪蛋白、0.05%疊氮化鈉)中。包含金綴合的兔抗-人IgG(Fc)的再懸浮團(tuán)粒可用于多種目的，包括但不限于在橫向流動(dòng)裝置中作為用于人抗-類脂抗體的檢測劑試劑。實(shí)施例11檢測人血清中的抗-類脂抗體這個(gè)實(shí)施例證明，可通過使用硝化纖維固定的Fab-USR抗原配合物捕獲試劑與移動(dòng)的兔抗-人IgG(Fc)或A蛋白金綴合物檢測劑試劑合作檢測梅毒血清中的抗-類脂抗體。如實(shí)施例8所述將lul的Fab-USR抗原配合物施用于單獨(dú)的硝化纖維膜并允許其在室溫干燥過夜。如實(shí)施例IO所述重復(fù)制備膠態(tài)金綴合物。將反應(yīng)性的人梅毒血清和非反應(yīng)性(無梅毒的)人血清在1%酪蛋白、10mM磷酸鹽、0.5M氯化鈉pH7.4中稀釋1:100、1:200或1:400。將100"1的每種血清稀釋物置于微量滴定板的適當(dāng)數(shù)量的孔中。然后將2ul的金綴合的A蛋白(以類似于實(shí)施例IO的方式制備)加入到各個(gè)孔。然后將包含固定的Fab-USR抗原配合物捕獲試劑的一個(gè)硝化纖維條置于包含抗體和檢測劑試劑溶液的各個(gè)孔中?？字械娜芤和ㄟ^毛細(xì)管作用沿著條向上流動(dòng)。如表2所示，六十個(gè)反應(yīng)性人梅毒血清中有許多與固定的Fab-USR抗原制備物反應(yīng)。陽性反應(yīng)反應(yīng)的特征在于不同色調(diào)強(qiáng)度的可見斑點(diǎn)，從非常微弱(VF)、微弱(F)、弱(W)和強(qiáng)(S)。沒有可見反應(yīng)表示為"N"。對于非反應(yīng)性(無梅毒)人血清，在任何檢驗(yàn)的血清稀釋度中都沒有觀察到反應(yīng)。表2.固定的類脂抗體與人梅毒血清的反應(yīng)性<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>清編號RPR滴度a血清稀釋度10020040020R256SSs21R8VFVFF22R1024SSS23NRNNN24R32WSS25R16VFFW26R8WWw27R32wws28R4NNVF29NRNNN30R1024SSS31R32sss32R16VFww33NRNNN34NRNNN35R32WWS36R64FWw37R8VFFw38NRNNN39R4NNVF40R32WSS41R8FWw42R128Wss43R2NNN44R512Sss45R16VFww46R1024Sss47NRNNN<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>aRPR滴度是在標(biāo)準(zhǔn)的快速血漿反應(yīng)素(RPR)檢驗(yàn)中產(chǎn)生可見反應(yīng)的反應(yīng)性梅毒血清的最高稀釋度。實(shí)施例12人血清或血漿中的非密螺旋體和密螺旋體抗體的同時(shí)檢測這個(gè)實(shí)施例說明流通檢驗(yàn)裝置，其允許同時(shí)檢測生物樣品(例如，人血清或血漿)中對于密螺旋體或非密螺旋體(類脂)抗原為特異性的抗體。這種裝置可用于例如診斷主體中的梅毒。用于這個(gè)實(shí)施例的流通檢驗(yàn)裝置包括點(diǎn)樣有重組密螺旋體抗原、VDRL抗原(如上述實(shí)施例中所述固定的)和對照的膜。原型裝置由SpanDiagnosticsLtd.(173-B,NewIndustrialEstate,Udhna，Surat-394210，Indm)提供。將重組的密螺旋體抗原、固定的VDRL抗原、和對照沿著膜的邊緣以三角形結(jié)構(gòu)布置(參見，例如，圖10)。進(jìn)行該研究時(shí)使檢驗(yàn)裝置布置在水平表面上，以確保檢驗(yàn)過程中試劑的平均分配。將100Ul的洗滌緩沖液加到檢驗(yàn)裝置的中心并且允許吸收至少30秒。洗滌緩沖液不含有機(jī)溶劑和洗滌劑。然后將100!il的人血清或血漿加到檢驗(yàn)裝置膜的中心并且允許其與表面反應(yīng)至少30秒。如果要將樣品短期保留，將樣品儲(chǔ)存在2-8'C。對于較久的儲(chǔ)存，將樣品儲(chǔ)存在-2(TC或更低溫度。在分析凍結(jié)樣品之前，將樣品完全解凍，溫和地混合和經(jīng)過2，000xg的離心作用10分鐘。然后檢驗(yàn)得到的澄清的上清液。然后將檢驗(yàn)裝置經(jīng)洗滌緩沖液洗滌(150ul，至少30秒，以允許溶液吸收)。為了測定是否有對密螺旋體和/或非密螺旋體(類脂)抗原為特異性的抗體存在于樣品中，加入200u1的SIGNALREAGENT(膠態(tài)金A蛋白試劑)并且允許吸入。對于最早的判讀，在約2分鐘之后讀取結(jié)果。對于最終的判讀，在約IO分鐘之后讀取結(jié)果。如果僅在對照區(qū)域出現(xiàn)色斑，則認(rèn)為樣品對于密螺旋體或非密螺旋體(類脂)抗原特異性的抗體是非反應(yīng)性的。僅在對照區(qū)域出現(xiàn)的反應(yīng)性表明該裝置適當(dāng)?shù)剡\(yùn)行，并且另外表示得到樣品的主體為梅毒(或梅毒螺旋體感染)陰性診斷。如果對照點(diǎn)和密螺旋體和/或非密螺旋體抗原斑點(diǎn)二者都是反應(yīng)性的(g卩，變色)，則進(jìn)一步考慮主體的梅毒(或梅毒螺旋體感染)的陽性診斷(如以下更詳細(xì)論述的)。如果，在完成檢驗(yàn)時(shí)，對照、密螺旋體抗原或非密螺旋體抗原斑點(diǎn)都未表現(xiàn)出反應(yīng)性，則認(rèn)為檢驗(yàn)無效。表3說明了處理得自以前從未感染梅毒螺旋體的健康供體的150個(gè)樣品所得到的結(jié)果。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>VDRL和TPHA檢驗(yàn)為基于溶液的檢驗(yàn)，分別用于檢測主體樣品中對于非密螺旋體抗原和密螺旋體抗原為特異性的抗體。如表3中所示，用于檢測患者樣品中每種抗體類型的基于膜的(流通)檢驗(yàn)提供了與用于相應(yīng)抗體的基于溶液的檢驗(yàn)相同的結(jié)果。有利的是，雙重檢測的流通檢驗(yàn)允許在單次試驗(yàn)中既檢測抗-密螺旋體又檢測抗-非密螺旋體(抗-類脂)抗體。只有兩個(gè)得自健康主體的樣品(1.3%)表現(xiàn)出與VDRL檢驗(yàn)和流通裝置的非密螺旋體(類脂)抗原的顯示陽性反應(yīng)。因此，當(dāng)檢驗(yàn)得自未感染的梅毒螺旋體的主體的血清時(shí)，兩種檢驗(yàn)都具有相同的和低的假陽性結(jié)果發(fā)生率、和相同的和為零的假陰性結(jié)果發(fā)生率。然后將檢驗(yàn)裝置分析得自已知(或已經(jīng))感染梅毒螺旋體的九名患者的血清(得自這種患者的血清也稱為梅毒血清)。如表4A中說明的，對于每個(gè)樣品，基于膜的(流通)試驗(yàn)提供與基于溶液的檢驗(yàn)相同的結(jié)果；也就是，在基于溶液的VDRL檢驗(yàn)與在膜結(jié)合的非密螺旋體抗原中、和在基于溶液的TPHA檢驗(yàn)與膜結(jié)合的密螺旋體抗原中，每個(gè)樣品都有相同的反應(yīng)性。如上對于"健康"主體血清樣品所述，流通檢驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)是能夠使用單個(gè)試驗(yàn)同時(shí)檢驗(yàn)患者血清對于密螺旋體和非密螺旋體(類脂)抗原分反應(yīng)性。表4A.<table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table>為了比較基于溶液的VDRL和TPHA試驗(yàn)與流通檢驗(yàn)裝置的靈敏度，選擇得自上述實(shí)施例6的血清，系列稀釋，并且如上檢驗(yàn)每個(gè)稀釋度。如表4B中說明的，用于同時(shí)檢測梅毒血清中的抗-非-密螺旋體(抗-類脂)和抗-密螺旋體抗體的流通裝置的靈敏度與用于每種類型抗體的單獨(dú)檢測溶液測定法相似。表4B.<table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table>使用雙重檢測的流通裝置和基于溶液的TPHA和RPR測定法對42個(gè)患者樣品篩選抗-密螺旋體和抗-非-密螺旋體(抗-類脂)抗體。在梅毒的常規(guī)檢驗(yàn)中，經(jīng)常首先篩選患者血清與非-密螺旋體(類脂抗原)抗原的反應(yīng)性，例如使用RPR檢驗(yàn)。RPR檢驗(yàn)一般地在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，并且可需要幾天來完成；其間，被檢驗(yàn)的患者離開檢驗(yàn)設(shè)備。如果RPR檢驗(yàn)是陽性的，則推薦隨后的用于測定患者血清與密螺旋體抗原的反應(yīng)性的檢驗(yàn)(例如，TPHA檢驗(yàn))，以確定梅毒的陽性診斷。經(jīng)常難以召回患者進(jìn)行隨后的TPHA檢驗(yàn)，該檢驗(yàn)還一般地在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行并且可能需要幾天來完成。只檢驗(yàn)患者樣品對密螺旋體抗原的反應(yīng)性(例如，使用TPHA檢驗(yàn))也是有局限的，因?yàn)橐坏┗颊咭呀?jīng)感染梅毒螺旋體(即，已經(jīng)患有梅毒)，其抗-密螺旋體抗體的滴度一般地保持較高，即使在成功治療之后。因此，僅僅密螺旋體抗原的陽性檢驗(yàn)不能提供充分的信息。在檢驗(yàn)42名患者的群體時(shí)，與TPHA或RPR基于溶液試驗(yàn)法相比的流通裝置的性能特征分別提供在表5A和5B中。表5A密螺旋體斑點(diǎn)TPHA+-總+20424-11718212142用于檢測抗-密螺旋體抗體的流通裝置的靈敏度為95%，特異性為81%。<table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table>流通裝置檢測抗-非-密螺旋體(抗-類脂)抗體的靈敏度為93%,特異性為100%。對于篩選的42名患者，發(fā)現(xiàn)13名患者同時(shí)具有RPR和非-密螺旋體斑點(diǎn)-陽性(表5B，左上角的數(shù)字)，20名患者同時(shí)具有TPHA和密螺旋體斑點(diǎn)-陽性(表5A，左上角的數(shù)字)。同時(shí)具有RPR和非-密螺旋體斑點(diǎn)-陽性的所有的13名患者也都是TPHA和密螺旋體斑點(diǎn)-陽性。因此，單獨(dú)根據(jù)流通裝置的結(jié)果，這13名患者需要立即進(jìn)行梅毒治療，而無需隨后的檢驗(yàn)。在使用本實(shí)施例中所述的流通檢驗(yàn)裝置時(shí)，非限制性的一組臨床管理建議為<table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table>雖然已經(jīng)通過強(qiáng)調(diào)具體的實(shí)施方案對本公開進(jìn)行描述，但是對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，可使用具體實(shí)施方案的變體并且意在可以與本文具體描述不同的方式實(shí)踐本公開。因此，本公開包括在以下權(quán)利要求限定的本公開的精神實(shí)質(zhì)和范圍內(nèi)的所有改進(jìn)。權(quán)利要求1.包括具有抗-類脂抗體捕獲區(qū)域的微孔性基底的免疫測定裝置，包括(a)固定在基底上的錨定抗體；和(b)類脂抗原，包括心磷脂、卵磷脂、和膽固醇，其中固定的錨定抗體特異性結(jié)合于類脂抗原的心磷脂、卵磷脂或膽固醇組分中的一種或多種，從而形成固定的錨定抗體-類脂抗原配合物。2.權(quán)利要求1的免疫測定裝置，其中的基質(zhì)是微孔膜。3.權(quán)利要求1的免疫測定裝置，其中錨定抗體不特異性地結(jié)合類脂抗原的心磷脂、卵磷脂或膽固醇組分中的一種或多種的外源表位。4.權(quán)利要求1的免疫測定裝置，其中類脂抗原包括膠束而非脂質(zhì)體。5.權(quán)利要求1的免疫測定裝置，其中錨定抗體特異性地結(jié)合于類脂抗原的心磷脂組分。6.權(quán)利要求1的免疫測定裝置，用于測定流體樣品中抗-類脂抗體的存在或量中的至少之一，其另外包括樣品施加區(qū)域和從樣品施加區(qū)域到抗-類脂抗體捕獲區(qū)域的流動(dòng)通道；其中流體樣品中抗-類脂抗體的存在或量中的至少之一可以通過流體樣品中的抗-類脂抗體與固定的類脂抗原-錨定抗體配合物之間形成配合物進(jìn)行檢測。7.權(quán)利要求1的免疫測定裝置，另外包括密螺旋體捕獲區(qū)域，包括(a)能夠被抗-梅毒螺旋體抗體特異性結(jié)合的固定的密螺旋體抗原，或(b)特異性地結(jié)合移動(dòng)的密螺旋體抗原的固定的抗-梅毒螺旋體抗體。8.權(quán)利要求1的免疫測定裝置，其中的基底包括硝化纖維、尼龍、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚醚砜、聚碳酸酯、聚酯、醋酸纖維素、混合的纖維素酯、或其組合。9.權(quán)利要求1的免疫測定裝置，其中錨定抗體是對心磷脂具有特異性的Fab片段。10.權(quán)利要求1的免疫測定裝置，其中錨定抗體是由感染梅毒螺旋體的主體的免疫球蛋白級分產(chǎn)生的多個(gè)Fab片段。11.權(quán)利要求1的免疫測定裝置，其中類脂抗原為USR抗原、VDRL抗原、或合成的VDRL抗原。12.權(quán)利要求1的免疫測定裝置，其中抗-類脂抗體捕獲區(qū)域包括一個(gè)或多個(gè)線。13.權(quán)利要求12的免疫測定裝置，其中一個(gè)或多個(gè)線具有約8mm到約15mm的寬度。14.權(quán)利要求1或7的免疫測定裝置，其中該裝置為流通裝置。15.權(quán)利要求14的免疫測定裝置，另外包括與基底接觸的吸收劑襯墊。16.權(quán)利要求14的免疫測定裝置，其中基底具有約0.2nm到約8um的孔徑大小。17.權(quán)利要求1或7的免疫測定裝置，其中該裝置為橫向流動(dòng)裝置。18.權(quán)利要求17的免疫測定裝置，其中基底具有高達(dá)約12um的孔徑大小。19.權(quán)利要求17的免疫測定裝置，其中橫向流動(dòng)裝置另外包括位于流動(dòng)通道中的綴合物襯墊，其中綴合物襯墊包括對于抗-類脂抗體具有特異性的移動(dòng)的或可移動(dòng)的檢觀iJ劑試劑。20.權(quán)利要求19的免疫測定裝置，其中檢測劑試劑包括金綴合的A蛋白、金綴合的Fc特異性G蛋白、或金綴合的抗-人抗體(Fc部分)。21.權(quán)利要求19的免疫測定裝置，其中綴合物襯墊另外包括對于抗-梅毒螺旋體抗體或移動(dòng)的密螺旋體抗原具有特異性的移動(dòng)的或可移動(dòng)的檢測劑試劑。22.權(quán)利要求21的免疫測定裝置，其中對于抗-梅毒螺旋體抗體具有特異性的檢測劑試劑包括金綴合的A蛋白、金綴合的Fc-特異性G蛋白、或金綴合的抗-人抗體(Fc部分)、或用于移動(dòng)的密螺旋體抗原的檢測劑試劑包括金標(biāo)記的抗-密螺旋體抗原抗體。23.權(quán)利要求1的免疫測定裝置，其中類脂抗原-錨定抗體配合物通過包括以下步驟的方法固定在基底上使類脂抗原接觸一種或多種對于心磷脂、卵磷脂、或膽固醇中的至少一種具有特異性的錨定抗體，以形成類脂抗原-錨定抗體配合物；禾口對基底施加類脂抗原-錨定抗體配合物。24.權(quán)利要求1的免疫測定裝置，其中類脂抗原-錨定抗體配合物通過包括以下步驟的方法固定在基底上將對于心磷脂、卵磷脂、或膽固醉中的至少一種具有特異性的錨定抗體固定在基底上；將基底上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)封閉-,使固定的錨定抗體接觸類脂抗原，以形成類脂抗原-錨定抗體配合物；和洗滌基底，以除去沒有被錨定抗體特異性結(jié)合的任何類脂抗原。25.用于檢測主體中抗-類脂抗體的方法，包括對權(quán)利要求1的免疫測定裝置施加得自主體的生物樣品；和檢測存在于生物樣品中的抗-類脂抗體與固定的類脂抗原-錨定抗體配合物之間配合物的形成，其中檢測配合物的形成檢測了主體中的抗-類脂抗體。26.權(quán)利要求25的方法，其中抗-類脂抗體的檢測用于診斷主體的梅毒。27.權(quán)利要求25的方法，其中生物樣品為血液、血清、皮膚潰瘍滲出液、尿、唾液、唾沫、或腦脊髓液。28.權(quán)利要求25的方法，另外包括對免疫測定裝置施加對抗-類脂抗體具有特異性的檢測劑試劑。29.權(quán)利要求25的方法，另外包括在對免疫測定裝置施加樣品之前或同時(shí)向生物樣品加入對抗-類脂抗體具有特異性的檢測劑試劑。30.權(quán)利要求27或28的方法，其中檢測劑試劑是被標(biāo)記的A蛋白、Fc-特異性G蛋白、或抗-人抗體。31.權(quán)利要求30的方法，其中標(biāo)記是酶、膠態(tài)金顆粒、彩色乳膠粒子、化學(xué)發(fā)光試劑或熒光劑。32.用于診斷主體中梅毒的方法，包括對權(quán)利要求7的裝置施加生物樣品；在抗-類脂抗體捕獲區(qū)域中檢測在存在于生物樣品中的抗-類脂抗體與固定的類脂抗原-錨定抗體配合物之間第一配合物的形成；和在密螺旋體捕獲區(qū)域檢測如下第二配合物的形成(a)存在于生物樣品中的抗-梅毒螺旋體抗體與固定的密螺旋體抗原之間，或(b)存在于生物樣品中的密螺旋體抗原和固定的抗-梅毒螺旋體抗體之間，其中檢測第一配合物和第二配合物的形成用于診斷主體中的梅毒。33.權(quán)利要求32的方法，其中生物樣品為人血液樣品。34.權(quán)利要求33的方法，其中人血液樣品為全血或血清。35.用于確定流體樣品中抗-類脂抗體的存在或量中的至少之一的免疫測定裝置，包括微孔膜；樣品施加區(qū)域；抗-類脂抗體捕獲區(qū)域，包括類脂抗原-錨定抗體配合物，該配合物包括錨定抗體和被錨定抗體特異性結(jié)合的類脂抗原，并且該配合物通過錨定抗體固定在膜上；其中類脂抗原包括心磷脂、卵磷脂、和膽固醇；和從樣品施加區(qū)域到抗-類脂抗體捕獲區(qū)域的流動(dòng)通道；其中可以通過抗-類脂抗體和固定的類脂抗原-錨定抗體配合物之間配合物的形成而檢測施加到樣品施加區(qū)域的流體樣品中抗-類脂抗體的存在和/或量。36.將免疫活性的心磷脂固定在基底上的方法，該方法包括使包括免疫活性心磷脂的類脂抗原接觸一種或多種對類脂抗原的至少一個(gè)組分具有特異性的抗體，以形成類脂抗原-抗體配合物；和對基底施加類脂抗原-抗體配合物，其中對基底施加類脂抗原-抗體配合物使免疫活性的心磷脂固定在基底上。37.權(quán)利要求36的方法，其中類脂抗原為USR抗原、VDRL抗原、或合成的VDRL抗原。38.權(quán)利要求36的方法，其中抗體是不與A蛋白、Fc-特異性的G蛋白、或抗-人抗體(Fc部分)顯著反應(yīng)的抗體片段。39.權(quán)利要求38的方法，其中的抗體是Fab片段。40.權(quán)利要求36的方法，其中的抗體分離自梅毒螺旋體感染的或梅毒螺旋體接種的主體的血清。41.權(quán)利要求36的方法，其中基底包括硝化纖維。42.權(quán)利要求36的方法，包括使包括免疫活性的心磷脂卵磷脂和膽固醇的類脂抗原接觸對于心磷脂、卵磷脂、或膽固醇具有特異性的抗體片段，以形成類脂抗原-抗體配合物；其中抗體片段不與A蛋白、Fc-特異性的G蛋白、或抗-人抗體(Fc部分)顯著反應(yīng)；和對基底施加類脂抗原-抗體配合物，使免疫活性的心磷脂固定在基底上。43.權(quán)利要求42的方法，包括使包括免疫活性心磷脂的類脂抗原接觸對于心磷脂、卵磷脂、或膽固醇具有特異性的Fab片段，以形成類脂抗原-Fab配合物；其中類脂抗原為USR抗原、VDRL抗原、或合成的VDRL抗原；和對硝化纖維施加類脂抗原-Fab配合物，使免疫活性的心磷脂固定在硝化纖維上。44.將免疫活性的心磷脂固定在基底上的方法，該方法包括將對于心磷脂、卵磷脂、或膽固醇中的至少一種具有特異性的一種或者多種抗體固定在基底上；將基底上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)封閉；對基底施加包括至少一種免疫活性的心磷脂、卵磷脂或膽固醇的類脂抗原，以形成類脂抗原-固定的抗體配合物；和洗滌基底，以除去沒有被一種或多種固定抗體特異性結(jié)合的任何類脂抗原。全文摘要本申請描述了用于檢測抗-類脂抗體和診斷疾病(例如梅毒)的組合物、方法和裝置。尤其是，描述了用于將類脂抗原(包括心磷脂、卵磷脂、和膽固醇)固定在固相支持體(例如，硝化纖維膜)上的方法。將類脂抗原固定在膜上的能力滿足了對用于檢測抗-類脂抗體的基于膜的試驗(yàn)法的長久已知的需要。還描述了用于同時(shí)進(jìn)行梅毒密螺旋體和非密螺旋體檢驗(yàn)的免疫測定裝置。文檔編號G01N33/571GK101243321SQ200680030262公開日2008年8月13日申請日期2006年6月20日優(yōu)先權(quán)日2005年6月21日發(fā)明者維多利亞·波普,羅伯特·W·格爾格,阿諾德·R·卡斯特羅申請人:美國政府健康及人類服務(wù)部，疾病控制和預(yù)防中心