豬瘟病毒和/或豬繁殖與呼吸綜合征病毒的可視化基因芯片以及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測豬瘟病毒和/或豬繁殖與呼吸綜合征病毒的可視化基因芯 片以及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 多病原混合感染是當(dāng)前豬場疫病的普遍現(xiàn)象，豬繁殖與呼吸綜合征、豬瘟、豬流行 性乙型腦炎這三種豬病毒引起的疾病癥狀相似且常常呈混合感染，是當(dāng)前危害養(yǎng)豬業(yè)的3 種重要病毒性疾病，因此早期鑒別診斷并及時了解流行狀況對控制這3種病的流行顯得尤 其重要。目前對這3種病的診斷多采用病原的分離及常規(guī)的血清學(xué)方法，但需時間較長。最 近國外和國內(nèi)均建立了病原的分離鑒定、免疫膠體金技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、血清中和實(shí) 驗(yàn)、聚合酶鏈反應(yīng)等，但是還不能更加快速的檢測多種病原的混合感染。
[0003] 基因芯片技術(shù)是近年來新興起的一種生物高新技術(shù)，該技術(shù)可以同時定量或定性 的檢測成千上萬個基因信息，具有無選擇性、客觀、高通量的特點(diǎn)?；蛐酒?jì)劃開展后， 許多部門、大學(xué)、重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室及制藥公司參與了該項(xiàng)目的研發(fā)，我國相繼也成立了一大批 基因芯片公司。隨著基因組數(shù)據(jù)的增長以及分子生物學(xué)相關(guān)學(xué)科的快速發(fā)展，基因芯片技 術(shù)得到迅猛發(fā)展和廣泛應(yīng)用。但生物芯片技術(shù)發(fā)展時間較短，很多技術(shù)還處于初級研發(fā)階 段，要成為實(shí)驗(yàn)室研究或臨床可以普遍采用的技術(shù)仍有諸多關(guān)鍵問題亟待解決。（1)基因芯 片的特異性的提高；（2)增加信號檢測的靈敏度；(3)簡化樣品制備和標(biāo)記操作；(4)設(shè)備 與操作人員的要求較高；（5)應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的統(tǒng)一。
[0004]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種新的特異性強(qiáng)、靈敏度高的檢測豬瘟病毒 和/或豬繁殖與呼吸綜合征病毒的可視化基因芯片和試劑盒。
[0006] 本發(fā)明檢測豬瘟病毒和/或豬繁殖與呼吸綜合征病毒的可視化基因芯片，其特征 在于：它包括固相載體以及固定在固相載體上的探針；所述探針包括SEQ ID N0 :1所示寡 核苷酸片段，SEQ ID N0 :2所示寡核苷酸片段，以及SEQ ID N0 :3所示寡核苷酸片段，豬流 行性乙型腦炎病毒、豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒。
[0007] 其中，所述基因芯片按照如下方法制備：
[0008] (1)制備探針溶液：取探針，用點(diǎn)樣緩沖液將探針稀釋至200ng/ul，得探針溶液；
[0009] ⑵采用微噴頭噴點(diǎn)方式，在壓力為lOKPa的情況下，將探針溶液點(diǎn)樣于氨基玻片 上，重復(fù)兩次，即可。
[0010] 微噴頭噴點(diǎn)方式：通過微噴頭將樣品點(diǎn)到基片上的方式。
[0011] 其中，它還包括定位探針，定位探針是SEQ ID N0 :4所示的基因片段。
[0012] 本發(fā)明還提供了制備前述可視化基因芯片的方法，其特征在于：步驟如下：
[0013] (1)制備探針溶液：取探針，用稀釋至200ng/ul，得探針溶液；
[0014] ⑵采用微噴頭噴點(diǎn)方式，在壓力為lOKPa的情況下，將探針溶液點(diǎn)樣于氨基玻片 上，重復(fù)兩次，即可。
[0015] 本發(fā)明檢測豬瘟病毒和/或豬繁殖與呼吸綜合征病毒的試劑盒，其特征在于：它 包括前述的可視化基因芯片、擴(kuò)增試劑以及顯色試劑；
[0016] 其中，擴(kuò)增試劑包括SEQ ID N0 :4~5和/或6~7所示引物對，用于分別擴(kuò)增豬 瘟病毒和/或豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因；
[0017] 顯色試劑包括金標(biāo)鏈霉親和素以及銀染試劑。
[0018] 其中，所述擴(kuò)增試劑還包括SEQ ID N0 :8~9所示引物對。
[0019] 所述金標(biāo)鏈霉親和素是Nanogold-Streptavidin稀釋10~40倍后的溶液。優(yōu)選 地，所述金標(biāo)鏈霉親和素的是Nanogold-Streptavidin稀釋40倍后的溶液。
[0020] 本發(fā)明特定方法制備的可視化基因芯片能夠準(zhǔn)確檢測豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸 綜合征病毒，可以用肉眼直觀地看到檢測結(jié)果，不需要價格昂貴的激光共聚掃描儀，成本低 廉，同時，靈敏度較高，與現(xiàn)有熒光標(biāo)記方法的靈敏度相當(dāng)，特異性強(qiáng)，耗時短，檢測快速，臨 床應(yīng)用前景良好。
[0021] 以下通過實(shí)施例形式的【具體實(shí)施方式】，對本發(fā)明的上述內(nèi)容作進(jìn)一步的詳細(xì)說 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例。凡基于本發(fā)明權(quán)利要 求書記載的內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
【附圖說明】
[0022] 圖1點(diǎn)樣儀的位置標(biāo)定
[0023] 圖2點(diǎn)樣儀的噴樣參數(shù)
[0024] 圖3因芯片陣列點(diǎn)樣模式圖
[0025] 圖4圖2-4基因芯片點(diǎn)制的基本參數(shù)設(shè)置。A:玻片設(shè)置B:點(diǎn)陣設(shè)置C:陣列設(shè)置 D:清洗設(shè)置E:樣品設(shè)置
[0026] 圖5質(zhì)粒菌的復(fù)蘇與鑒定結(jié)果。M:100bp DNA Ladder ;1 :Y11基因；2 :PS8基因。 M:100bp DNA Ladder ；1 ： ADNA
[0027] 圖6基因芯片的有效性檢測結(jié)果。A :陽性質(zhì)控單獨(dú)雜交結(jié)果；B :全部探針雜交結(jié) 果
[0028] 圖7基因芯片的特異性檢測結(jié)果。A豬繁殖與呼吸綜合征病毒質(zhì)粒雜交結(jié)果；B: 豬瘟病毒質(zhì)粒雜交結(jié)果
[0029] 圖8基因芯片靈敏性檢測結(jié)果
[0030] 圖9基因芯片的穩(wěn)定性檢測結(jié)果
[0031] 圖10點(diǎn)樣緩沖液的選擇結(jié)果。A:無菌超純水；B:3XSSC ;C:博奧點(diǎn)樣緩沖液 [0032]圖11點(diǎn)樣次數(shù)的優(yōu)化結(jié)果
[0033] 圖12基因芯片雜交溫度的優(yōu)化結(jié)果
[0034] 圖13雜交時間的優(yōu)化結(jié)果
[0035] 圖14Nanogold-Streptavidin稀釋倍數(shù)的優(yōu)化結(jié)果
【具體實(shí)施方式】
[0036] 一、實(shí)驗(yàn)材料和儀器
[0037] 1. 1生物材料
[0038] 豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV)毒株、豬瘟病毒（CSFV)毒株和豬流行性乙型腦 炎病毒（JEV)毒株，購自中國獸藥監(jiān)察所。
[0039] 1. 2主要試劑
[0040]氨基基片：Baio?氨基載玻片，購自上海百傲生物科技股份有限公司；點(diǎn)樣緩沖 液：Baio?點(diǎn)樣緩沖液，購自上海百傲生物科技股份有限公司，晶芯芯片點(diǎn)樣液，購自北京博 奧生物有限公司；雜交緩沖液：BA#雜交緩沖液，購自上海百傲生物科技股份有限公司； 銀染試劑：Silver buffer A，Silver buffer B，購自美國Sigma公司；金標(biāo)鏈霉親和素： Nanogold-Streptavidin，購自美國Nanogold公司；陽性質(zhì)控（A DNA)為寶生物工程（大 連）有限公司產(chǎn)品；小量質(zhì)粒抽提試劑盒購自O(shè)mega公司。
[0041] 1.3主要儀器設(shè)備
[0042] 空氣恒溫?fù)u床，美國Thermo公司；AllegraTM64R高速冷凍離心機(jī)，美國Thermo公 司；POWER PacTM電泳儀及水平電泳槽，美國BI0-RAD公司；UNIVERSAL H00D凝膠成像系 統(tǒng)，美國 BI0-RAD 公司；MyCyclerTMPCR 儀，美國 BI0-RAD 公司；SmartSpecTMPlus 核酸蛋白 儀，美國BI0-RAD公司；超純水儀，Milli Qplus，法國產(chǎn)；梯度PCR儀，美國BI0-RAD公司； 分子雜交儀，美國Thermo公司；晶芯? SmartArrayer?16,微陣列芯片點(diǎn)樣系統(tǒng)：Capitalbio Corporation，北京博奧生物公司；'晶.芯? LuxScan?10K微陣列芯片掃描儀：Capitalbio Corporation，北京博奧生物有限公司；多樣品圍欄、多樣品圍欄粘貼工具、多樣品圍欄蓋 片，芯片雜交盒均為北京博奧生物有限公司。
[0043] 實(shí)施例1本發(fā)明可視化基因芯片的制備及用其檢測的方法
[0044] 1、材料和儀器
[0045] 同前述實(shí)驗(yàn)材料和儀器。
[0046] 2本發(fā)明基因芯片的制備及性能檢測
[0047] 2.1引物與探針的制備
[0048] 本研究將固定到氨基基片上的病毒特異DNA片段稱作探針，而用生物素標(biāo)記的待 檢樣品稱為革G基因。
[0049]2. 1.1引物的合成
[0050]引物由上海生工生物工程有限公司合成，其中反向引物合成兩條