專利名稱：腎綜合征出血熱檢測方法及檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及傳染病學(xué)、分子生物學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及腎綜合征出血熱的檢測方法和檢測試劑盒。
腎綜合征出血熱(HFRS)是由肯尼亞病毒科漢坦病毒屬(Hanta Virus)中某些病毒引起的人類急性傳染病。發(fā)病后死亡率很高，因此早期的正確診斷非常必要。在我國，腎綜合癥出血熱(HFRS)是除病毒性肝炎外危害最大的一種傳染病，本病的疫區(qū)范圍涉及歐亞非等世界各地，我國的發(fā)病人數(shù)亦無減少趨勢。在上海浦東地區(qū)，由于外來人口的增多，HFRS的發(fā)病居多不下。因此，對該病的早期快速診斷和及時治療，對人民的生命健康具有現(xiàn)實意義。
漢坦病毒是HFRS的病原體，該病毒血清學(xué)診斷國內(nèi)常用的免疫熒光技術(shù)和酶聯(lián)免疫試驗(ELISA)檢測特異性抗體IgG與IgM，都存在一定的局限性，檢測時間至少也要4小時，國外開發(fā)的高密度顆粒凝集試驗(HDPA)能在1小時內(nèi)完成檢測，但尚未在國內(nèi)普遍推廣。
斑點金免疫滲濾試驗(滴金法)是最新的先進、快速技術(shù)，曾成功地用于多種傳染病的檢測，但尚未見用于HFRS檢測的試劑盒面市。滴金法具有操作簡便、快速(可在幾分鐘內(nèi)完成)及特異性高等特點，因此是一種HFRS的早期快速診斷提新的有實用價值的候選檢測方法，特別適于在基層醫(yī)療單位推廣應(yīng)用。
盡管，某些文獻描述了一些用金標法檢測腎綜合征出血熱的方法，但是完全按照這些文獻所公開的方法和程序重復(fù)進行實驗時，卻無法獲得令人滿意的結(jié)果，甚至根本無法檢測。在《中國醫(yī)學(xué)檢驗雜志)》1998年3月第21卷第2期中，公開了一種滴金法檢測腎綜合征出血熱血清特異性IgM的方法，但是完全按照該法卻無法重復(fù)實驗結(jié)果。其原因可能是抗原的制備方法有問題。
目前，在開發(fā)腎綜合征出血熱滴金法檢測和試劑盒時，因為IgM抗體產(chǎn)生的時間最早，所以為了早期檢測都把注意力集中在檢測IgM上。沒有公開過任何針對IgG的滴金法和試劑盒。
因此，迫切需要一種能快速、正確和簡便的診斷腎綜合征出血熱的方法和試劑盒。
本發(fā)明的目的就是提供一種快速、正確和簡便的檢測腎綜合征出血熱的方法及相應(yīng)的檢測試劑盒。
一方面，本發(fā)明提供了一種檢測樣品中是否含有抗?jié)h坦病毒的IgG抗體的方法，它包括步驟(a)將純化的漢坦病毒核蛋白包被在硝酸纖維素膜上，形成在點樣區(qū)中包被有漢坦病毒核蛋白的硝酸纖維素檢測膜；(b)以非人的抗人IgG抗體和膠體金為原料，制備膠體金-抗人IgG抗體的結(jié)合物；(c)將待檢測的血清樣品滴加在步驟(a)中獲得的檢測膜的點樣區(qū)上；(d)洗滌步驟(c)的檢測膜的點樣區(qū)；(e)將步驟(b)的膠體金-抗人IgG抗體的結(jié)合物滴加在點樣區(qū)上；(f)洗滌步驟(e)的檢測膜的點樣區(qū)；點樣區(qū)出現(xiàn)紅色斑點表示樣品中存在抗?jié)h坦病毒的IgG抗體，不出現(xiàn)紅色斑點表示樣品中不存在抗?jié)h坦病毒的IgG抗體。
另一方面，本發(fā)明提供了一種檢測腎綜合征出血熱的檢測試劑盒，該試劑盒包含硝酸纖維素膜，在該膜的點樣區(qū)包被有純化的漢坦病毒抗原，膠體金-非人抗IgG抗體結(jié)合物溶液，和可選的洗滌緩沖液。
本發(fā)明還提供了一種檢測樣品中是否含有抗?jié)h坦病毒的IgM抗體的方法，它包括步驟(a)將純化的漢坦病毒抗原包被在硝酸纖維素膜上，形成在點樣區(qū)中包被有漢坦病毒核蛋白的硝酸纖維素檢測膜，其中該純化的抗原是如下制備的收集培養(yǎng)的接種過漢坦病毒的宿主細胞，經(jīng)2800-3200rpm 20-40分鐘粗離心后，取上清液在35000-45000rpm離心1-4小時，棄去上清液，沉淀即為純化的漢坦病毒抗原；(b)以非人的抗人IgM抗體和膠體金為原料，制備膠體金-抗人IgM抗體的結(jié)合物；(c)將待檢測的血清樣品滴加在步驟(a)中獲得的檢測膜的點樣區(qū)上；(d)洗滌步驟(c)的檢測膜的點樣區(qū)；(e)將步驟(b)的膠體金-抗人IgM抗體的結(jié)合物滴加在點樣區(qū)上；(f)洗滌步驟(e)的檢測膜的點樣區(qū)；
點樣區(qū)出現(xiàn)紅色斑點表示樣品中存在抗?jié)h坦病毒的IgM抗體，不出現(xiàn)紅色斑點表示樣品中不存在抗?jié)h坦病毒的IgM抗體。
本發(fā)明是基于如下意外發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)上完成的在受到漢坦病毒感染后，IgG會很快產(chǎn)生，因而可作為檢測對象。眾所周知，在受到感染后，通常IgM抗體最早產(chǎn)生。而IgG抗體的產(chǎn)生則較慢，而且IgG的滴度較低，因此通常不適宜作為滴金法的檢測對象。然而，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在受到漢坦病毒感染后，IgG會很快產(chǎn)生(約1-2天內(nèi))，而且滴度水平可以達到滴金法的檢測靈敏度。并在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
無論是選擇IgG還是IgM作為檢測對象，為了成功地進行滴金法檢測，漢坦病毒抗原的制備很關(guān)鍵。通常要求純度高，與IgG和IgM結(jié)合特異的抗原，在本發(fā)明的一個實施例中，采用分步離心的方法來制備抗原，即收集培養(yǎng)的接種過漢坦病毒的宿主細胞，經(jīng)2800-3200rpm 20-40分鐘粗離心后，取上清液在35000-45000rpm離心1-4小時，棄去上清液，沉淀即為純化的漢坦病毒抗原(核蛋白)。
為了獲得漢坦病毒，可以將其接種于一些采用的宿主細胞，如Vero-E6細胞和沙鼠腎細胞。較佳地，可接種于沙鼠腎細胞。
接種后，在35-37℃按常規(guī)方法傳導(dǎo)培養(yǎng)7-10天后，可收獲病毒。培養(yǎng)方法可參見例如《現(xiàn)代微生物學(xué)實驗技術(shù)及其應(yīng)用)》，人民衛(wèi)生出版社，1997年10月；《醫(yī)學(xué)病毒學(xué)及實驗技術(shù)》1990年，科學(xué)出版社；和《醫(yī)學(xué)實驗病毒學(xué)》人民軍醫(yī)出版社，1985年等文獻。
在獲得了純化的漢坦病毒抗原之后，可用常規(guī)方法將其包被在檢測膜的點樣區(qū)上。
為了消除非特異性結(jié)合，獲得的在點樣區(qū)中包被有漢坦病毒核蛋白的硝酸纖維素檢測膜還經(jīng)過預(yù)結(jié)合處理，例如用0.75-1.5％BSA溶液封閉2-24小時。封閉時間也可進一步延長。但通常2小時就足夠了。
在本發(fā)明中，可供使用的與IgG抗體結(jié)合的雙抗可以是任何非人的抗人IgG抗體，它們包括(但并不限于)羊抗人IgG抗體，小鼠抗人IgG抗體和兔抗人IgG抗體較佳地，是羊抗人IgG抗體，上述非人的抗人IgM抗體可用常規(guī)方法制備，或購買得到；在本發(fā)明中，可供使用的檢測膜可以是平均孔徑在0.3-1.2微米之間的各種材質(zhì)膜。較佳地，所用的是硝酸纖維素膜。各種規(guī)格的膜的平均孔徑不同，因此，在制備檢測膜時，應(yīng)根據(jù)孔徑大小來確定膠體金的顆粒大小(粒徑)。這可通過控制膠體金制備過程中檸檬酸鈉與水的重量比。研究表明，檸檬酸鈉用量增加，膠體金粒徑下降。具體用量可通過常規(guī)實驗確定。例如當該硝酸纖維素膜的平均孔徑為0.65微米時，在用檸檬酸還原法制備的并且在制備時檸檬酸鈉與水的重量比為0.035-0.045∶100，較佳地0.038-0.042∶100，最佳地約0.04∶100。用這樣的膠體金所制備的膠體金-抗人IgM或IgG抗體結(jié)合物可以有效地滲透入0.65微米的膜中。
通常，在檸檬酸還原法制備膠體金的常規(guī)方法中氯金酸與水的重量比0.0075-0.03∶100，較佳地約0.01-0.02∶100。
在獲得了膠體金和抗人IgG抗體(或抗人IgM抗體)后，兩者的偶聯(lián)可根據(jù)常規(guī)方法進行。例如如下進行制備以10毫升膠體金溶液為基準，加入8-30微克的非人抗人IgG抗體，靜置后加BSA，使BSA終濃度為1％，再靜置后，加入聚乙二醇(PEG)0.8-0.12克(防止膠體金自聚沉淀)，混勻，加入適量防腐劑。制得膠體金-抗人IgG抗體(或抗人IgM抗體)結(jié)合物溶液。其中，偶聯(lián)時，抗人IgG抗體(或抗人IgM抗體)的用量上限也可進一步提高，這樣做雖對檢測結(jié)果無影響，但是出于減低成本，用量宜為8-30微克/10毫升膠體金溶液，較佳地9-20毫克/10毫升膠體金溶液，更佳地10-15毫克/10毫升膠體金溶液。
在檢測時，通常包括如下步驟A、取包被了漢坦病毒抗原的檢測膜，在下方墊一次性吸水材料。
B、在點樣區(qū)上滴加適量(通常1滴即足夠)洗滌緩沖液(如PBS-Tween 20緩沖液)，以活化膜表面。待滲入即可(該活化步驟可省略)。
C、在點樣區(qū)滴加適量血清樣品，待滲入即可。
D、在點樣區(qū)滴加適量洗滌緩沖液，以洗滌點樣區(qū)?？芍貜?fù)洗滌2-5次，通常共3次。
E、在點樣區(qū)滴加適量(通常1滴即可)本發(fā)明的膠體金-羊抗人IgG抗體結(jié)合物(或膠體金-羊抗人IgG抗體結(jié)合物溶液)。
F、在點樣區(qū)滴加適量洗滌緩沖液，以洗滌點樣區(qū)。可重復(fù)洗滌2-5次，通常共3次。觀察結(jié)果，在點樣區(qū)出現(xiàn)紅色斑點為陽性，無紅色斑點為陰性。
為了更準確地檢測，可同時檢測IgM和/或使用陽性和陰性對照。在試劑盒中，也可包含選自下組的物質(zhì)膠體金-非人抗IgM抗體結(jié)合物溶液，陽性和陰性對照。
本發(fā)明方法制備的漢坦病毒抗原非常適合作為金標法檢測腎綜合征出血熱的抗原蛋白。選用該核蛋白制作的金標檢測試紙，在檢測樣品中是否存在抗?jié)h坦病毒的抗體時，靈敏度大大提高，可以快速和正確地得出受檢對象是否被漢坦病毒所感染，從而十分有利于降低腎綜合征出血熱的死亡率。
此外，由于被檢測的IgG抗體的特異性遠高于IgM抗體，所以可有效地降低假陽性，并且有利于臨床確診腎綜合征出血熱。
此外，本發(fā)明的檢測方法簡便，使用極其簡單，不需要特殊的培訓(xùn)就可掌握，因此非常適合檢測腎綜合征出血熱這一在經(jīng)濟較不發(fā)達地區(qū)(尤其是半開墾地，城鄉(xiāng)結(jié)合區(qū))發(fā)病率較高的疾病。
下面結(jié)合實施例進一步闡述本發(fā)明，這些實施例僅用于說明目的而不用于限定本發(fā)明范圍。
實施例1漢坦病毒抗原的制備將野鼠型漢坦病毒株76-118接種于沙鼠腎細胞，按常規(guī)方法在35-37℃?zhèn)鲗?dǎo)培養(yǎng)7-10天后，收集細胞培養(yǎng)物。
超聲波破細胞處理之后，于3000rpm粗離心30分鐘，以去除細胞膜碎片等雜質(zhì)。取上清液，在40000rpm離心2小時以便使?jié)h坦病毒抗原沉淀。棄去上清液，取沉淀。沉淀溶解后，測定溶液中蛋白含量。如蛋白含量較低，可再離心濃縮，使?jié)h坦病毒抗原的終濃度為1-2MG/ML。
實施例2膠體金的制備在250毫升三角燒瓶中加入100毫升去離子雙蒸水，加1％檸檬酸鈉4毫升，煮沸后迅速加入1％氯金酸1毫升。繼續(xù)煮沸15分鐘，冷卻后用0.1M碳酸鉀將pH調(diào)至8.5。
實施例3膠體金-羊抗IgG抗體結(jié)合物的制備(a)羊抗IgG抗體的制備將購自上海市生物制品研究所的羊抗IgG抗體，經(jīng)硫酸銨純化處理后備用。
(b)穩(wěn)定性試驗由于購買的(或用常規(guī)方法制備的)各種生物制品的效價存在波動，因此，為了提高重復(fù)性，宜對各批抗體繼續(xù)穩(wěn)定性試驗，以確定最佳的抗體添加量。
以一批抗體濃度約為1毫克/毫升的羊抗IgG抗體溶液為例。在1毫升在實施例2中制備的膠體金溶液中，分別加入0微升、2微升、4微升、6微升、8微升、10微升、12微升的，在室溫下混合均勻后，在室溫下靜置10分鐘。在每管中加入10％氯化鈉0.1毫升，混合均勻后，在室溫下靜置2小時。保持紅色不變且加入量最少(為了節(jié)約成本，減少浪費)的一管，即為穩(wěn)定1毫升膠體金溶液所需的最佳蛋白量。通常，可在該最佳蛋白量的基礎(chǔ)上再加10％，作為標記抗體的實際用量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在加人6微升時可產(chǎn)生紅色，且紅色變化不大。在加入8微升和10微升時，產(chǎn)生的紅色保持不變。因此，將該批抗體實際添加量定為11微升。
(c)制備膠體金-羊抗IgG抗體結(jié)合物溶液取10毫升實施例2中新鮮制備膠體金溶液，加入11微升羊抗人IgG抗體，10分鐘后加5％BSA，使BSA終濃度為1％。室溫下靜置10分鐘后，加入聚乙二醇(PEG)0.1克(防止膠體金自聚沉淀)，混勻，加10％疊氮化鈉(NaN3)75微升(起防腐作用)。
實施例4檢測膜的制備1.將0.65微米硝酸纖維素膜用軟鉛劃成1厘米×1厘米的小格。
2.在每小格的中央(點樣區(qū))滴加1微升實施例1中的漢坦病毒抗原(核蛋白)溶液。
3.膜在室溫中干燥后，用1％BSA封閉2小時，以便去除非特異性結(jié)合，從而進一步降低假陽性機率。
實施例5膠體金-羊抗IgM抗體結(jié)合物的制備重復(fù)實施例3，不同點僅在于，用羊抗IgM抗體(購自上海市生物制品研究所)代替羊抗IgG抗體。
實施例6樣品的檢測A、取實施例4中制備的檢測膜，在下方墊一次性吸水材料。
B、在點樣區(qū)上滴加PBS-Tween 20緩沖液1滴，以活化膜表面。待滲入即可。
C、在點樣區(qū)滴加10微升血清樣品。待滲入即可。
D、在點樣區(qū)滴加PBS-Tween 20緩沖液1滴，以洗滌點樣區(qū)。重復(fù)洗滌2次。
E、在點樣區(qū)滴加實施例3中制備的膠體金-羊抗人IgG抗體結(jié)合物(或?qū)嵤├?中制備的膠體金-羊抗人IgG抗體結(jié)合物溶液)1-2滴。
F、在點樣區(qū)滴加PBS-Tween 20緩沖液1滴，以洗滌點樣區(qū)。重復(fù)洗滌2次。
觀察結(jié)果，在點樣區(qū)出現(xiàn)紅色斑點為陽性，無紅色斑點為陰性。
通過對2組ELISA法檢測為陽性的血清樣品(分別30個樣品和20個樣品)，20例陰性樣品，和15例正常人樣品的檢測，可以在3-8分鐘內(nèi)即獲得檢測結(jié)果。對于50例陽性樣品，有46例檢測為陽性(這是因為滴金法的靈敏度稍低于ELISA法所導(dǎo)致的結(jié)果)且所有陰性或正常樣品都為陰性。由于受漢坦病毒感染后很短時間內(nèi)受感染者體內(nèi)相應(yīng)的IgM和IgG抗體就迅速上升(達到或大大超過滴金法的檢測靈敏度)，因此在實際臨床檢測時的準確性預(yù)計將更高。
實施例7-8重復(fù)實施例6，不同點僅在于實施例7中省略步驟B；實施例8中用蒸餾水代替PBS-Tween 20緩沖液。
結(jié)果，對檢測結(jié)果無影響。
實施例9試劑盒的制備將實施例4制備的檢測膜劃成1厘米×1厘米的小片(具有一個點樣區(qū)，檢測IgG或IgM)，或1厘米×2厘米的小片(具有2個點樣區(qū)，在一片上檢測IgG和IgM)，或2厘米×2厘米的小片(具有4個點樣區(qū)，在一片上檢測IgG和IgM并且具有陽性和陰性對照)。
將各小片膜(點樣區(qū)朝上)分別裝在相應(yīng)大小的塑料盒中，在點樣區(qū)上方開有直徑約0.6厘米的小孔，在膜下方墊入一次性吸水材料。
在各塑料盒中，再放置每管0.5毫升的實施例3中制備的膠體金-羊抗人IgG抗體結(jié)合物和/或?qū)嵤├?中制備的膠體金-羊抗人IgG抗體結(jié)合物溶液。
此外，試劑盒可同時裝有洗滌液，如PBS-Tween 20緩沖液。
權(quán)利要求
1.一種檢測樣品中是否含有抗?jié)h坦病毒的IgG抗體的方法，其特征在于，它包括步驟(a)將純化的漢坦病毒核蛋白包被在硝酸纖維素膜上，形成在點樣區(qū)中包被有漢坦病毒核蛋白的硝酸纖維素檢測膜；(b)以非人的抗人IgG抗體和膠體金為原料，制備膠體金-抗人IgG抗體的結(jié)合物；(c)將待檢測的血清樣品滴加在步驟(a)中獲得的檢測膜的點樣區(qū)上；(d)洗滌步驟(c)的檢測膜的點樣區(qū)；(e)將步驟(b)的膠體金-抗人IgG抗體的結(jié)合物滴加在點樣區(qū)上；(f)洗滌步驟(e)的檢測膜的點樣區(qū)；點樣區(qū)出現(xiàn)紅色斑點表示樣品中存在抗?jié)h坦病毒的IgG抗體，不出現(xiàn)紅色斑點表示樣品中不存在抗?jié)h坦病毒的IgG抗體。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該純化的漢坦病毒核蛋白是如下制備的收集培養(yǎng)的接種過漢坦病毒的宿主細胞，經(jīng)2800-3200rpm 20-40分鐘粗離心后，取上清液在35000-45000rpm離心1-4小時，棄去上清液，沉淀即為純化的漢坦病毒核蛋白。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，該宿主細胞選自下組沙鼠腎細胞和Vero-E6細胞。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該非人的抗人IgG抗體選自下組羊抗人IgG抗體，小鼠抗人IgG抗體，小鼠抗人IgG抗體和兔抗人IgG抗體。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該硝酸纖維素膜的平均孔徑為0.65微米，而且該膠體金是用檸檬酸還原法制備的并且在制備時檸檬酸鈉與水的重量比為0.035-0.045∶100，而氯金酸與水的重量比0.0075-0.03∶100。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(a)中獲得的在點樣區(qū)中包被有漢坦病毒核蛋白的硝酸纖維素檢測膜還經(jīng)過如下處理用0.75-1.5％BSA溶液封閉2-24小時。
7.如權(quán)利要求1所述方法，其持征在于，步驟(b)中，膠體金-抗人IgG抗體的結(jié)合物是如下進行制備的以10毫升膠體金溶液為基準，加入8-30微克的非人抗人IgG抗體，靜置后加BSA，使BSA終濃度為1％，再靜置后，加入聚乙二醇0.8-0.12克，混勻，加入適量防腐劑。
8.一種檢測腎綜合征出血熱的檢測試劑盒，其特征在于，該試劑盒包含硝酸纖維素膜，在該膜的點樣區(qū)包被有純化的漢坦病毒抗原，膠體金-非人抗IgG抗體結(jié)合物溶液，和可選的洗滌緩沖液。
9.如權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，還包含選自下組的物質(zhì)膠體金-非人抗IgM抗體結(jié)合物溶液，陽性和陰性對照。
10.如權(quán)利要求8和9所述的試劑盒，其特征在于，硝酸纖維素膜的平均孔徑為0.65微米，該非人抗IgG抗本是羊抗人IgG抗體，而且該漢坦病毒抗原如下得到的收集培養(yǎng)的接種過漢坦病毒的宿主細胞，經(jīng)2800-3200rpm 20-40分鐘粗離心后，取上清液在35000-45000rpm離心1-4小時，棄去上清液，沉淀即為純化的漢坦病毒核蛋白，溶解后使終濃度為1毫克/毫升。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種滴金法檢測腎綜合征出血熱檢測方法及檢測試劑盒。在該方法中,將血清中抗?jié)h坦病毒的IgG抗體作為檢測對象,它包括步驟:(a)將純化的漢坦病毒核蛋白包被在硝酸纖維素膜上,形成在點樣區(qū)中包被有漢坦病毒核蛋白的硝酸纖維素檢測膜;(b)以非人的抗人IgG抗體和膠體金為原料,制備膠體金－抗人IgG抗體的結(jié)合物;(c)將待檢測的血清樣品滴加在步驟(a)中獲得的檢測膜的點樣區(qū)上;(d)洗滌步驟(c)的檢測膜的點樣區(qū);(e)將步驟(b)的膠體金－抗人IgG抗體的結(jié)合物滴加在點樣區(qū)上;(f)洗滌步驟(e)的檢測膜的點樣區(qū)。該方法和試劑盒可快速、正確和簡便的檢測腎綜合征出血熱。
文檔編號G01N33/53GK1267831SQ9911354
公開日2000年9月27日 申請日期1999年3月18日 優(yōu)先權(quán)日1999年3月18日
發(fā)明者儲峰, 季青, 嚴潤民, 王霞明 申請人:上海市南匯縣南華醫(yī)院