專利名稱：妊娠特異性β的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種診斷血球、單向免疫擴(kuò)散板，具體地說是涉及妊娠特異性β1糖蛋白的診斷血球、單向免疫擴(kuò)散板的制備方法和應(yīng)用。
妊娠特異性β1糖蛋白(SP1)是由胎盤合體滋養(yǎng)層細(xì)胞分泌的，測定孕婦血中SP1的含量，能反映胎盤體積和功能的變化，目前多采用放射免疫法，雖測值可信，但由于放射性衰變和需要貴重的醫(yī)療設(shè)備，不易普及基層醫(yī)院。
本發(fā)明的目的是提供一種在孕晚期、足月或過期妊娠情況下，測定SP1值的診斷血球、單向免疫擴(kuò)散板的制備方法和應(yīng)用。
本發(fā)明中妊娠特異性β1糖蛋白(SP1)診斷血球、單向免疫擴(kuò)散板的制備方法采用如下步驟1SP1的提純1.1飽和硫酸銨鹽析正常足月分娩產(chǎn)婦胎盤5-10個(gè)，應(yīng)用組織搗碎機(jī)勻漿，加2倍體積生理鹽水?dāng)嚢?0-40分鐘，離心3000-6000r/min20分鐘，去沉淀，上清用50％飽和硫酸銨鹽析，4000-10000r/min20分鐘，棄上清，沉淀用生理鹽水溶解，以生理鹽水透析至無NH+。
1.2 sephadex G200柱層析取sephadex G20010克，按常規(guī)處理裝柱(2.5×100cm)用0.1-0.3mol/LNaCl和0.05mol/Ltris-HCl緩沖液(PH8.0)平衡，取鹽析濃縮樣品10ml，流速10-80ml/h以每管2-10ml分別收集洗脫液，應(yīng)用SP1血球試劑檢查各管濃度，收集SP1高濃度管合并，用50％飽和硫酸銨沉淀，透析至無NH+。
1.3SP1偶聯(lián)sepharose4B親和層析取瑞典pharmacia公司生產(chǎn)的sepharose4B10-40ml，經(jīng)0.5mol/LNaCl和冷蒸餾水淋洗后冰浴，加入新配制的溴化氰3.0g/10ml，用0.2mol/LNaOH調(diào)PH值，使之維持在5-12左右，反應(yīng)5-20分鐘，用布氏漏斗抽干，加入經(jīng)0.1mol/LNaHCO3(PH7-11)透析的SP1抗體攪拌4℃過夜，次日裝柱，用0.01mol/L(0.5mol/LNaCI)磷酸鹽緩沖液洗至280nmOD值＜0.01為止，收集全部洗脫液，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測定280nmOD值，計(jì)算其偶聯(lián)率為78.2％。將合并的高濃度樣品5ml加入SP1抗體親和層析柱中(1.5×20cm)0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PH6-8)洗脫，流速10-60ml/h洗至280nmOD值＜0.02時(shí)，改用0.1mol/L甘氨酸-HCl緩沖液(PH2.4)解吸附，流速10-80ml/h，收集SP1高濃度區(qū)，用50％飽和硫酸銨濃縮除鹽。
1.4抗人全血抗體偶聯(lián)sepharose4B親和層析柱制備與SP1抗體偶聯(lián)sepharose4B相同，其偶聯(lián)率為7.28％。將濃縮除鹽SP1樣品5ml加入抗人全血抗體親和層析柱中，(1.5×20cm)0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PH7.0)洗脫，洗速為30ml/h，收集第一蛋白吸收峰，合并各管濃縮，凍干為SP1純品。
2 SP1抗血清的制備選擇2kg雄性家兔，于雙后足掌注射活卡介苗5-40mg,5-20天后向淋巴結(jié)周圍多點(diǎn)注射，SP1抗原加福氏完全佐劑0.5-4ml,(每千克體重50-400μgSP1抗原)。以后每間隔一周免疫一次，經(jīng)5次免疫后，試血效價(jià)達(dá)到1∶64倍時(shí)(雙向瓊脂擴(kuò)散法)，頸動(dòng)脈放血分離血清。
3人“O”型紅細(xì)胞的醛化取健康男性“O”型紅細(xì)胞，經(jīng)戊二醛、甲醛、丙酮醛處理后，配成10％醛化血球懸液。
4SP1抗血清致敏醛化血球取10％醛化血球離心后用0.1mol/L醋酸鈉配成1-10％血球，將SP1IgG稀釋成1-20μg/ml濃度與等量醛化血球混合，在20-60℃恒溫振蕩水浴下反應(yīng)0.5-3小時(shí)，經(jīng)含有0.1-3％兔血清的磷酸鹽緩沖液洗去未結(jié)合IgG，配成1％血球懸液，生產(chǎn)出SP1凍干診斷血球。
5將SP1抗血清1ml用0.05molNaCl、0.05％NaN3稀釋成100、200、400倍，于56℃滅活30分鐘，分別加入等體積的2.4％瓊脂液中，瓊脂液需煮沸10-40分鐘后，冷卻至40-70℃時(shí)方可混合均勻鋪板。瓊脂厚度3.0mm，打孔直徑2.5mm，孔距1.2cm。
本發(fā)明制備的SP1的鑒定1．非特異性檢查應(yīng)用非孕婦女血清6份，男性血清6份，分別加入SP1單向免疫板瓊脂孔內(nèi)各5μl，放置37℃恒溫24小時(shí)判定結(jié)果，均無沉淀環(huán)出現(xiàn)，說明SP1單向免疫板無非特異性反應(yīng)。
2．穩(wěn)定性檢查將SP1單向免疫板存放4℃不同月份進(jìn)行比較，每批均加入相同樣品各5μl，放置37℃恒溫24小時(shí)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)放置6個(gè)月以內(nèi)的免疫板，其沉淀環(huán)大小和清晰度無差別，而放置7個(gè)月的免疫板，沉淀環(huán)清晰度略差，8個(gè)月放置的免疫板，沉淀環(huán)不清楚。由于免疫板放置時(shí)間過長，導(dǎo)致SP1抗血清失活。經(jīng)觀察比較，免疫板使用期限應(yīng)在6個(gè)月以內(nèi)為宜，每批使用前，均用SP1標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行質(zhì)量檢查。通過對211例28-41孕周正常妊娠婦女血清測定，結(jié)果表明正常孕婦血清SP1值隨孕周增加，41孕周達(dá)到高峰并維持到分娩。本方法以各孕周平均值正負(fù)兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差為各孕周正常范圍的下限值(警界值)。確定36-41孕周血清SP1≤100μg/ml為警界值，＞100μg/ml為正常值，以此對高危妊娠婦女進(jìn)行觀察。
下面結(jié)合實(shí)施例詳細(xì)敘述本發(fā)明。
1 SP1的提純1.1飽和硫酸銨鹽析正常足月分娩產(chǎn)婦胎盤10個(gè)，應(yīng)用組織搗碎機(jī)勻漿，加2倍體積生理鹽水?dāng)嚢?0分鐘，離心4000r/min20分鐘，去沉淀，上清用50％飽和硫酸銨鹽析，5000r/min20分鐘，棄上清，沉淀用生理鹽水溶解，以生理鹽水透析至無NH+。
1.2sephadex G200柱層析取sephadex G20010克，按常規(guī)處理裝柱(2.5×100cm)用0.2mol/LNaCl和0.05mol/Ltris-HCl緩沖液(PH8.0)平衡，取鹽析濃縮樣品10ml，流速60ml/h以每管5ml分別收集洗脫液，應(yīng)用SP1血球試劑檢查各管濃度，收集SP1高濃度管合并，用50％飽和硫酸銨沉淀，透析至無NH+。
1.3SP1偶聯(lián)sepharose4B親和層析取瑞典pharmacia公司生產(chǎn)的sepharose 4B30ml，經(jīng)0.5mol/LNaCl和冷蒸餾水淋洗后冰浴，加入新配制的溴化氰3.0g/10ml，用0.2mol/LNaOH調(diào)PH值，使之維持在11左右，反應(yīng)10分鐘，用布氏漏斗抽干，加入經(jīng)0.1mol/LNaHCO3(PH9.0)透析的SP1抗體攪拌4℃過夜，次日裝柱，用0.01mol/L(0.5mol/LNaCI)磷酸鹽緩沖液洗至280nmOD值＜0.01為止，收集全部洗脫液，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測定280nmOD值，計(jì)算其偶聯(lián)率為78.2％。將合并的高濃度樣品5ml加入SP1抗體親和層析柱中(1.5×20cm)0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PH7.4)洗脫，流速30ml/h洗至280nmOD值＜0.02時(shí)，改用0.1mol/L甘氨酸-HCl緩沖液(PH2.4)解吸附，流速60ml/h，收集SP1高濃度區(qū)，用50％飽和硫酸銨濃縮除鹽。
1.4抗人全血抗體偶聯(lián)sepharose4B親和層析柱制備與SP1抗體偶聯(lián)sepharose4B相同，其偶聯(lián)率為7.28％。將濃縮除鹽SP1樣品5ml加入抗人全血抗體親和層析柱中，(1.5×20cm)0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PH7.0)洗脫，洗速為30ml/h，收集第一蛋白吸收峰，合并各管濃縮，凍干為SP1純品。
2 SP1抗血清的制備選擇2kg雄性家兔，于雙后足掌注射活卡介苗20mg,10天后向淋巴結(jié)周圍多點(diǎn)注射，SP1抗原加福氏完全佐劑2ml，(每千克體重150μgSP1抗原)。以后每間隔一周免疫一次，經(jīng)5次免疫后，試血效價(jià)達(dá)到1∶64倍時(shí)(雙向瓊脂擴(kuò)散法)，頸動(dòng)脈放血分離血清。
3人“O”型紅細(xì)胞的醛化取健康男性“O”型紅細(xì)胞，經(jīng)戊二醛、甲醛、丙酮醛處理后，配成10％醛化血球懸液。
4 SP1抗血清致敏醛化血球取10％醛化血球離心后用0.1mol/L醋酸鈉配成5％血球，將SP1IgG稀釋成10μg/ml濃度與等量醛化血球混合，在45℃恒溫振蕩水浴下反應(yīng)1.5小時(shí)，經(jīng)含有1％兔血清的磷酸鹽緩沖液洗去未結(jié)合IgG，配成1％血球懸液，生產(chǎn)出SP1凍干診斷血球。
5將SP1抗血清1ml用0.05molNaCl、0.05％NaN3稀釋成100、200、400倍，于56℃滅活30分鐘，分別加入等體積的2.4％瓊脂液中，瓊脂液需煮沸30分鐘后，冷卻至56℃時(shí)方可混合均勻鋪板。瓊脂厚度3.0mm，打孔直徑2.5mm，孔距1.2cm。
本發(fā)明應(yīng)用實(shí)施例如下取10μl孕婦血清用1ml鹽水稀釋成100倍等待檢測用，在V型微量血凝板上，從第1孔到第5孔各加樣品稀釋水25μl，取100倍稀釋的血清25μl加到第1孔，用微量加樣器從第1孔起依次做2倍稀釋到第4孔，第5孔為空白對照，凍干SP1診斷血球用血球稀釋水2ml溶解并搖勻，4℃過夜放置后應(yīng)用，取25μl稀釋血球從第1孔到第5孔各加25μl，震勻后放37℃,1小時(shí)取出判定結(jié)果。
判定標(biāo)準(zhǔn)孕婦血清中SP1能與SP1抗體致敏血球出現(xiàn)凝集反應(yīng)(陽性)，反之，如血清中不含有或濃度較低，則不出現(xiàn)凝集(陰性)，依據(jù)出現(xiàn)血球凝集的血清最大稀釋倍數(shù)乘以致敏血球的敏感度(0.125μg/ml)，便可確定血清中SP1的濃度。
判定方法血球全部沉入孔底為陰性，根據(jù)凝集程度分為1-4各階段，凝集在2以上可判定為陽性。
計(jì)算公式血清中SP1含量(μg/ml)=血球凝集孔的血清稀釋倍數(shù)×診斷血球的敏感度(μg/ml)。
用毛細(xì)玻璃管取孕婦耳垂血0.1ml，分離出血清，用微量加樣器吸取5微升加入瓊脂孔內(nèi)(注意不要溢出孔外)，加樣完畢后，蓋好塑料板，水平放人溫盒內(nèi)，在37℃條件下擴(kuò)散24小時(shí)觀察結(jié)果，分別記錄所測樣品的免疫沉淀環(huán)直徑(mm)，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上可查出SP1值，即得該樣品的SP1含量。通過對211例28-41孕周正常妊娠婦女血清測定，結(jié)果表明正常孕婦血清SP1值隨孕周增加，41孕周達(dá)到高峰并維持到分娩。本方法以各孕周平均值正負(fù)兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差為各孕周正常范圍的下限值(警界值)。確定36-41孕周血清SP1≤100μg/ml為警界值，＞100μg/ml為正常值，以此對高危妊娠婦女進(jìn)行觀察。其中標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法是在瓊脂板孔內(nèi)分別加入3個(gè)不同濃度的SP1標(biāo)準(zhǔn)液，每孔加樣5μl，放入37℃恒溫24小時(shí)后觀察沉淀環(huán)直徑，發(fā)現(xiàn)SP1抗血清200倍稀釋后所做的瓊脂板，免疫沉淀環(huán)直徑比較清晰，其擴(kuò)散環(huán)直徑分別為8.1mm、6.2mm、5.0mm，以標(biāo)準(zhǔn)含量為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)液免疫沉淀環(huán)直徑為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。(參考德國Benring研究所的SP1標(biāo)準(zhǔn))
權(quán)利要求
1.一種妊娠特異性β1糖蛋白診斷血球、單向免疫擴(kuò)散板的制備方法，該方法包括以下步驟(1)SP1的提純(1.1)飽和硫酸銨鹽析正常足月分娩產(chǎn)婦胎盤5-10個(gè)，應(yīng)用組織搗碎機(jī)勻漿，加2倍體積生理鹽水?dāng)嚢?0-40分鐘，離心3000-6000r/min20分鐘，去沉淀，上清用50％飽和硫酸銨鹽析，4000-10000r/min20分鐘，棄上清，沉淀用生理鹽水溶解，以生理鹽水透析至無NH+。(1.2)sephadex G200柱層析取sephadex G20010克，按常規(guī)處理裝柱(2.5×100cm)用0.1-0.3mol/LNaCl和0.05mol/Ltris-HCl緩沖液(PH8.0)平衡，取鹽析濃縮樣品10ml，流速10-80ml/h以每管2-10m1分別收集洗脫液，應(yīng)用SP1血球試劑檢查各管濃度，收集SP1高濃度管合并，用50％飽和硫酸銨沉淀，透析至無NH+。(1.3)SP1偶聯(lián)sepharose 4B親和層析取瑞典pharmacia公司生產(chǎn)的sepharose4B10-40ml，經(jīng)0.5mol/LNaCl和冷蒸餾水淋洗后冰浴，加入新配制的溴化氰3.0g/10ml，用0.2mol/LNaOH調(diào)PH值，使之維持在5-12左右，反應(yīng)5-20分鐘，用布氏漏斗抽干，加入經(jīng)0.1mol/LNaHCO3(PH7-11)透析的SP1抗體攪拌4℃過夜，次日裝柱，用0.01mol/L(0.5mol/LNaCI)磷酸鹽緩沖液洗至280nmOD值＜0.01為止，收集全部洗脫液，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測定280nmOD值，計(jì)算其偶聯(lián)率為78.2％。將合并的高濃度樣品5ml加入SP1抗體親和層析柱中(1.5×20cm)0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PH6-8)洗脫，流速10-60ml/h洗至280nmOD值＜0.02時(shí)，改用0.1mol/L甘氨酸-HCl緩沖液(PH2.4)解吸附，流速10-80ml/h，收集SP1高濃度區(qū)，用50％飽和硫酸銨濃縮除鹽。(1.4)抗人全血抗體偶聯(lián)sepharose4B親和層析柱制備與SP1抗體偶聯(lián)sepharose4B相同，其偶聯(lián)率為7.28％。將濃縮除鹽SP1樣品5ml加人抗人全血抗體親和層析柱中，(1.5×20cm)0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PH7.0)洗脫，洗速為30ml/h，收集第一蛋白吸收峰，合并各管濃縮，凍干為SP1純品。(2)SP1抗血清的制備選擇2kg雄性家兔，于雙后足掌注射活卡介苗5-40mg，5-20天后向淋巴結(jié)周圍多點(diǎn)注射，SP1抗原加福氏完全佐劑0.5-4ml，(每千克體重50-400μgSP1抗原)。以后每間隔一周免疫一次，經(jīng)5次免疫后，試血效價(jià)達(dá)到1∶64倍時(shí)(雙向瓊脂擴(kuò)散法)，頸動(dòng)脈放血分離血清。(3)人“O”型紅細(xì)胞的醛化取健康男性“O”型紅細(xì)胞，經(jīng)戊二醛、甲醛、丙酮醛處理后，配成10％醛化血球懸液。(4)SP1抗血清致敏醛化血球取10％醛化血球離心后用0.1mol/L醋酸鈉配成1-10％血球，將SP1IgG稀釋成1-20μg/ml濃度與等量醛化血球混合，在20-60℃恒溫振蕩水浴下反應(yīng)0.5-3小時(shí)，經(jīng)含有0.1-3％兔血清的磷酸鹽緩沖液洗去未結(jié)合IgG，配成1％血球懸液，生產(chǎn)出SP1凍干診斷血球。(5)將SP1抗血清1ml用0.05molNaCl、0.05％NaN3稀釋成100、200、400倍，于56℃滅活30分鐘，分別加入等體積的2.4％瓊脂液中，瓊脂液需煮沸10-40分鐘后，冷卻至40-70℃時(shí)方可混合均勻鋪板。瓊脂厚度3.0mm，打孔直徑2.5mm，孔距1.2cm。
2.一種妊娠特異性β1糖蛋白診斷血球、單向免疫擴(kuò)散板在判定胎盤功能方面的應(yīng)用。
全文摘要
一種妊娠特異性β
文檔編號G01N33/53GK1289925SQ99113259
公開日2001年4月4日 申請日期1999年9月24日 優(yōu)先權(quán)日1999年9月24日
發(fā)明者王曉東 申請人:吉林省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究所