專利名稱：雙特異性抗體融合物的制作方法
雙特異性抗體融合物本發(fā)明涉及新的雙特異性抗體融合蛋白。此類抗體包含針對(duì)目的抗原的第一特異性，和對(duì)于第二目的抗原的第二特異性，所述第二目的抗原例如為血清載體蛋白，其用于在 延長抗體的體內(nèi)血清半衰期中使用。還提供了用于產(chǎn)生此類分子的方法和包含它們的藥物 組合物?？贵w的高特異性和親和力使得它們成為理想的診斷和治療劑，特別是用于調(diào)節(jié) 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用。在重組抗體技術(shù)領(lǐng)域中的進(jìn)展已導(dǎo)致產(chǎn)生出抗體片段例如Fv、 Fab、Fab’和F(ab’ )2片段及其他抗體片段。這些更小的分子保留了完整抗體的抗原結(jié)合 活性，并且還可以展示出相比于完整免疫球蛋白分子而言經(jīng)改善的組織滲透和藥物代謝 動(dòng)力學(xué)特性。事實(shí)上，抗體片段被證明是多用途的治療劑，如通過產(chǎn)品例如ReoPro 和 Lucent is 的近期成功而可見的。盡管此類片段看起來展示出超過完整免疫球蛋白的 許多優(yōu)點(diǎn)，但它們還遭受了增加的從血清中的清除率，因?yàn)樗鼈內(nèi)狈x予長的體內(nèi)壽命的 Fc 結(jié)構(gòu)域(Medasan 等人，1997，J. Immunol. 158 :2211-2217)。先前已描述了具有雙特異性即與兩種不同的抗原相結(jié)合的抗體(關(guān)于綜述， 參見 Segal 等 A,1999, Curr. Opin. Immunol. 11 558-562 ；Plukthun & Pack，1997， Immunotechnology, 3 83~105 ；Fischer 禾口 Leger,2007, Pathobiology,74,3-14)。 在 W002/02773、US2007065440、US2006257406、US2006106203 和 US2006280734 中也描述了雙 特異性抗體。用于制備基于異雙特異性抗體的分子的先前方法一般采用化學(xué)交聯(lián)或者蛋白 質(zhì)改造技術(shù)?；瘜W(xué)交聯(lián)遭受了異和同二聚體形成的產(chǎn)率差以及要求進(jìn)行其后續(xù)的色譜法分 離。蛋白質(zhì)改造方法已高度地進(jìn)行了詳細(xì)闡述(例如，杵-臼(knobs-into-holes)改造； Ridgway等人，1996，Protein Eng. 9 (7) =617-621)或已使用了具有不合適的穩(wěn)定性特征的 分子(例如，雙抗體，scFv) 0在某些情況下，雙特異性抗體還可以遭受位阻問題，從而使得 兩種抗原無法同時(shí)與每條抗體臂相結(jié)合。單可變結(jié)構(gòu)域抗體也稱為單結(jié)構(gòu)域抗體或dAbs，其相應(yīng)于抗體的重鏈可變區(qū) (VH)或輕鏈可變區(qū)(VL)。Ward等人，1989，Nature，341，544-546描述了鼠類單結(jié)構(gòu)域抗 體。人單結(jié)構(gòu)域抗體和‘駱駝化的(camelised)’人單結(jié)構(gòu)域抗體也已得到描述(Holt等 人，2003，Trends in Biotechnology，21，484-490)。還已從駱駝科動(dòng)物(駱駝和美洲駝) 和軟骨魚(須鯊和鉸口鯊)中獲得了單結(jié)構(gòu)域抗體。這些生物已進(jìn)化出了安裝在Fc-等價(jià) 恒定結(jié)構(gòu)域構(gòu)架上的高親和力單V-樣結(jié)構(gòu)域(在駱駝科動(dòng)物中稱為VhH，和在鯊魚中稱為 V-NAR)，以作為其免疫系統(tǒng)的完整且至關(guān)重要的組分(關(guān)于綜述，參見Holliger &Hudson ； 2005, Nature Biotechnology,23(9) :1126_1136)。在EP0368684中描述了單結(jié)構(gòu)域抗體-酶融合物。在W02004/058820中還描述了 單結(jié)構(gòu)域-效應(yīng)子基團(tuán)融合物，其包含單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域。在W02007/024715中描述了雙重 可變結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白。在EP1517921中描述了包含兩個(gè)具有不同特異性的單結(jié)構(gòu)域抗體 的雙特異性配體。用于改善抗體片段例如Fv、Fab、Fab\ F(ab' )2和其他抗體片段的半衰期的手 段是已知的。一種方法使所述片段與聚合物分子相綴合。因此，已通過綴合至聚乙二醇(PEG)而改善了 Fab，、F(ab，)2片段在動(dòng)物中的短的循環(huán)半衰期(參見例如，W098/25791、 W099/64460和W098/37200)。另一種方法通過綴合至與FcRn受體相互作用的試劑來修 飾所述抗體片段(參見例如，W097/34631)。延長半衰期的另外一種方法使用結(jié)合血清白 蛋白的多肽(參見例如，Smith 等人，2001，Bioconjugate Chem. 12 :750_756 ；EP0486525 ； US6267964 ；W004/001064 ；W002/076489 ；和 W001/45746)。然而，仍然需要產(chǎn)生具有長的體 內(nèi)半衰期的抗原結(jié)合性免疫球蛋白蛋白質(zhì)，以作為因?yàn)榕cFcRn受體相互作用而具有長的 半衰期的那些的備選方案，其中沒有通過綴合至PEG來進(jìn)行化學(xué)修飾或者綴合至人血清白 蛋白。各種蛋白質(zhì)存在于血漿中，并且包括甲狀腺素結(jié)合蛋白、運(yùn)甲狀腺素蛋白、a 1-酸 性糖蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、纖維蛋白原和白蛋白，或者它們中的任何的片段。血清載體蛋白在機(jī) 體內(nèi)循環(huán)，具有以天測(cè)量的半衰期，例如對(duì)于甲狀腺素結(jié)合蛋白來說為5天或者對(duì)于運(yùn)甲 狀腺素蛋白來說為 2 天(Bartalena & Robbins，1993，Clinics in Lab. Med. 13 :583_598)， 或者在碘化的a 1-酸性糖蛋白的周轉(zhuǎn)的第二個(gè)階段中為65小時(shí)(Bree等人，1986，Clin. Pharmacokin. 11 :336_342)。來自 Gitlin 等人(1964，J. Clin. Invest. 10 :1938_1951)的數(shù) 據(jù)暗示，在孕婦中，a 1-酸性糖蛋白的半衰期為3. 8天，對(duì)于轉(zhuǎn)鐵蛋白為12天，和對(duì)于纖維 蛋白原為2. 5天。血清白蛋白是在血管和血管外區(qū)室中都豐富的蛋白質(zhì)，其在人中的半衰 期為大約 19 天(Peters, 1985, Adv Protein Chem. 37 161-245)。這與為大約 21 天的 IgGl 的半衰期相似(Waldeman & Strober，1969，Progr. Allergy，13 :1_110)。本發(fā)明提供了經(jīng)改善的雙特異性抗體融合蛋白，其可以重組地產(chǎn)生并且能夠同時(shí) 結(jié)合兩種抗原。因此，本發(fā)明提供了雙特異性抗體融合蛋白，其包含具有對(duì)于目的抗原的第一特 異性的免疫球蛋白部分，并且進(jìn)一步包含具有對(duì)于第二目的抗原的特異性的單結(jié)構(gòu)域抗體 (dAb)。本發(fā)明還提供了雙特異性抗體融合蛋白，其包含具有對(duì)于目的抗原的第一特異性 的免疫球蛋白部分，并且進(jìn)一步包含至少一個(gè)具有對(duì)于第二目的抗原的特異性的單結(jié)構(gòu)域 抗體。本發(fā)明的雙特異性抗體融合物將能夠與兩種目的抗原選擇性地相結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，由所述Fab或Fab，片段所結(jié)合的目的抗原可以是細(xì)胞關(guān)聯(lián)蛋 白，例如在細(xì)胞例如細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、T-細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞上的細(xì)胞表面蛋白， 或者它可以是可溶性蛋白。目的抗原還可以是任何在醫(yī)學(xué)上相關(guān)的蛋白質(zhì)，例如在疾病或 感染期間上調(diào)的那些蛋白質(zhì)，例如受體和/或其相應(yīng)的配體。細(xì)胞表面蛋白的具體例子包 括粘附分子，例如整聯(lián)蛋白例如0 1整聯(lián)蛋白例如VLA-4，E-選擇蛋白，P選擇蛋白或L-選 擇蛋白，CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CDlla, CDllb, CD18, CD19, CD20, CD23, CD25, CD33, CD38, CD40, CD45, CDW52, CD69, CD 134 (0X40), I COS, BCMP7, CD137, CD27L, CDCP1, DPCR1, DPCR1, dudulin2, FLJ20584, FLJ40787, HEK2, KIAA0634, KIAA0659, KIAA1246, KIAA1455, LTBP2, LTK, MAL2, MRP2，柄蛋白-樣 2，NKCC1, PTK7, RAIG1, TCAM1, SC6, BCMP101, BCMP84, BCMP11，DTD,癌胚抗原(CEA)，人乳脂球蛋白(HMFG1和2)，I類MHC和II類MHC抗原，和 VEGF，以及適當(dāng)時(shí)，它們的受體?？扇苄钥乖ò捉樗乩鏘L-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12、IL-16或IL-17，病毒抗原例如呼吸道合胞病毒或巨細(xì)胞病毒抗原，免疫球蛋白例如IgE，干 擾素例如干擾素α、干擾素β或干擾素Y，腫瘤壞死因子-α、腫瘤壞死因子-β，集落刺 激因子例如G-CSF或GM-CSF，和血小板衍生生長因子例如PDGF-α和PDGF-β，以及適當(dāng) 時(shí)，它們的受體。其他抗原包括細(xì)菌細(xì)胞表面抗原，細(xì)菌毒素，病毒例如流感、EBV, HepA, B 和C，生物恐怖主義試劑，放射性核素和重金屬，以及蛇和蜘蛛毒液和毒素。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體融合蛋白可以用于在功能上改變目的抗原的活 性。例如，所述抗體融合蛋白可以直接地或間接地中和、拮抗或激動(dòng)所述抗原的活性。 在一個(gè)實(shí)施方案中，由本發(fā)明的雙特異性抗體融合蛋白中的所述單結(jié)構(gòu)域抗體所 結(jié)合的第二目的抗原可以是細(xì)胞關(guān)聯(lián)蛋白，例如在細(xì)胞例如細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、T-細(xì)胞、 內(nèi)皮細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞上的細(xì)胞表面蛋白，或者它可以是可溶性蛋白。目的抗原還可以是任 何在醫(yī)學(xué)上相關(guān)的蛋白質(zhì)，例如在疾病或感染期間上調(diào)的那些蛋白質(zhì)，例如受體和/或其 相應(yīng)的配體。細(xì)胞表面蛋白的具體例子包括粘附分子，例如整聯(lián)蛋白例如β 1整聯(lián)蛋白例 如 VLA-4, E-選擇蛋白，P 選擇蛋白或 L-選擇蛋白，CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CDlla, CDllb, CD18, CD19, CD20, CD23, CD25, CD33, CD38, CD40, CD45, CDW52, CD69, CD134(0X40)， I COS, BCMP7, CD137, CD27L, CDCP1, DPCRl, DPCRl, dudulin2, FLJ20584, FLJ40787, HEK2, KIAA0634, KIAA0659, KIAA1246, KIAA1455, LTBP2, LTK, MAL2, MRP2，柄蛋白-樣 2，NKCCl, ΡΤΚ7, RAIG1, TCAMl, SC6, BCMP101, BCMP84, BCMPl 1, DTD，癌胚抗原(CEA)，人乳脂球蛋白 (HMFG1和2)，I類MHC和II類MHC抗原，和VEGF，以及適當(dāng)時(shí)，它們的受體。可溶性抗原包括白介素例如IL-I、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12、 IL-16或IL-17，病毒抗原例如呼吸道合胞病毒或巨細(xì)胞病毒抗原，免疫球蛋白例如IgE，干 擾素例如干擾素α、干擾素β或干擾素Y，腫瘤壞死因子-α、腫瘤壞死因子-β，集落刺 激因子例如G-CSF或GM-CSF，和血小板衍生生長因子例如PDGF-α和PDGF-β，以及適當(dāng) 時(shí)，它們的受體。其他抗原包括細(xì)菌細(xì)胞表面抗原，細(xì)菌毒素，病毒例如流感、EBV, HepA, B 和C，生物恐怖主義試劑，放射性核素和重金屬，以及蛇和蜘蛛毒液和毒素?？梢杂伤鰡谓Y(jié)構(gòu)域抗體所結(jié)合的其他抗原包括血清載體蛋白、使得能夠進(jìn)行細(xì) 胞介導(dǎo)的效應(yīng)子功能募集的多肽以及核素螯合劑蛋白質(zhì)。因此，在一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明提供了雙特異性抗體融合蛋白，其包含具有對(duì)于目的 抗原的第一特異性的免疫球蛋白部分，并且進(jìn)一步包含具有對(duì)于第二種蛋白質(zhì)的特異性的 單結(jié)構(gòu)域抗體，后者提供了募集效應(yīng)子功能(例如補(bǔ)體途徑激活和/或效應(yīng)細(xì)胞募集)的 能力。此外，由于與核素螯合劑蛋白質(zhì)相結(jié)合的單結(jié)構(gòu)域抗體，本發(fā)明的融合蛋白可以用于 螯合放射性核素。此類融合蛋白可在成像或放射性核素靶向方法(以進(jìn)行治療)中使用。因此，在一個(gè)實(shí)例中，提供了分離的雙特異性抗體融合蛋白，其包含具有對(duì)于目的 抗原的特異性的抗體Fab或Fab’片段，所述片段與至少一個(gè)具有對(duì)于募集多肽的特異性的 dAb相融合，所述dAb通過與所述募集多肽相結(jié)合而提供了直接地或間接地募集細(xì)胞介導(dǎo) 的效應(yīng)子功能的能力。效應(yīng)子功能的募集可以是直接的，因?yàn)樾?yīng)子功能與細(xì)胞相關(guān)聯(lián)，所述細(xì)胞在其 表面上攜帶有募集分子。當(dāng)dAb與募集分子的結(jié)合引起例如下述因子的釋放時(shí)，可以發(fā)生 間接募集所述因子可以直接地或間接地募集效應(yīng)子功能，或者可以經(jīng)由信號(hào)傳導(dǎo)途徑的 激活。例子包括TNFa、IL2、IL6、IL8、IL17、IFN γ、組胺、Clq、調(diào)理素以及經(jīng)典和旁路補(bǔ)體激活級(jí)聯(lián)的其他成員，例如C2、C4、C3-轉(zhuǎn)變酶和C5至C9。如本文所使用的，“募集多肽”包括FcyR例如Fc y RI、Fc yRII ^P Fey RIII，補(bǔ)體 途徑蛋白例如但不限于Clq和C3，CD標(biāo)志蛋白(分化群(Cluster of Differentiation) 標(biāo)志物)例如但不限于 CD68、CD115、CD16、CD80、CD83、CD86、CD56、CD64、CD3、CD4、CD8、 ⑶28、⑶45、⑶19、⑶20和⑶22。為⑶標(biāo)志蛋白的進(jìn)一步的募集多肽包括⑶1、⑶Id、⑶2、 CD5、CD8、CD9、CD10、CDll、CDlla、CDllb、CDllc、CD13、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、 CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD32、CD33、CD34、CD35、 CD36、CD37、CD38、CD40、CD43、CD44、CD45、CD46、CD49、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD52、 CD53、CD54、CD55、CD56、CD58、CD59、CD61、CD62、D62E、CD62L、CD62P、CD63、CD64、CD66e、 CD68、CD70、CD71、CD72、CD79、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD86、CD88、CD89、CD90、 CD94、CD95、CD98、CD106、CD114、CD116、CD117、CD118、CD120、CD122、CD130、CD131、CD132、 CD133、CD134、CD135、CD137、CD138、CD141、CD142、CD143、CD146、CD147、CD151、CD152、 CD153、CD154、CD155、CD162、CD164、CD169、CD184、CD206、CD209、CD257、CD278、CD281、 ⑶282、⑶283和⑶3o4，或它們中的任何的片段，所述片段保留了直接地或間接地募集細(xì)胞 介導(dǎo)的效應(yīng)子功能的能力。募集多肽還包括具有效應(yīng)子功能的免疫球蛋白分子，例如IgGl、 IgG2、IgG3、IgG4、IgE 和 IgA。在一個(gè)實(shí)施方案中，dAb對(duì)于其具有特異性的第二種蛋白質(zhì)是補(bǔ)體途徑蛋白，其中 Clq是特別優(yōu)選的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，dAb對(duì)于其具有特異性的第二種蛋白質(zhì)是CD標(biāo)志蛋白，其 中 CD68、CD80、CD86、CD64、CD3、CD4、CD8、CD45、CD16 和 CD35 是特別優(yōu)選的。因此，還提供了分離的雙特異性抗體融合蛋白，其包含具有對(duì)于目的抗原的特異 性的抗體片段，所述片段與至少一個(gè)dAb相融合，所述dAb具有對(duì)于選自下列的CD分子的 特異性CD68、CD80、CD86、CD64、CD3、CD4、CD8、CD45、CD16 和 CD35。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述單結(jié)構(gòu)域抗體為具有第一特異性的免疫球蛋白部分提供 了延長的半衰期。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了雙特異性抗體融合蛋白，其包含具有對(duì)于目的抗 原的特異性的抗體Fab或Fab’片段，所述片段與至少一個(gè)具有對(duì)于血清載體蛋白、循環(huán)免 疫球蛋白分子或CD35/CR1的特異性的單結(jié)構(gòu)域抗體相融合，所述單結(jié)構(gòu)域抗體通過與所 述血清載體蛋白、循環(huán)免疫球蛋白分子或CD35/CR1相結(jié)合而為具有對(duì)于所述目的抗原的 特異性的所述抗體片段提供了延長的半衰期。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了分離的雙特異性抗體融合蛋白，其包含具有對(duì)于目的 抗原的特異性的抗體Fab或Fab’片段，所述片段與至少一個(gè)具有對(duì)于血清載體蛋白、循環(huán) 免疫球蛋白分子或CD35/CR1的特異性的單結(jié)構(gòu)域抗體相融合，所述單結(jié)構(gòu)域抗體通過與 所述血清載體蛋白、循環(huán)免疫球蛋白分子或CD35/CR1相結(jié)合而為具有對(duì)于所述目的抗原 的特異性的所述抗體片段提供了延長的半衰期。如本文所使用的，“血清載體蛋白”包括甲狀腺素結(jié)合蛋白、運(yùn)甲狀腺素蛋白、 a 1-酸性糖蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、纖維蛋白原和白蛋白，或它們中的任何的片段。如本文所使用的，“循環(huán)免疫球蛋白分子”包括IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、slgA、IgM 和IgD、或它們中的任何的片段。
⑶35/CR1是存在于紅細(xì)胞上的蛋白質(zhì)，其具有36天的半衰期(正常范圍為28至 47 天；Lanaro 等人，1971，Cancer, 28 (3) :658_661)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，dAb對(duì)于其具有特異性的第二種蛋白質(zhì)是血清載體蛋白，其 中人血清載體蛋白是特別優(yōu)選的。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述血清載體蛋白是人血清白 蛋白。 因此，提供了雙特異性抗體融合蛋白，其包含具有對(duì)于目的抗原的特異性的抗體 Fab或Fab’片段，所述片段與至少一個(gè)具有對(duì)于人血清白蛋白的特異性的單結(jié)構(gòu)域抗體相融合。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的雙特異性抗體融合蛋白，其包含具有對(duì) 于目的抗原的特異性的抗體Fab或Fab’片段，所述片段與至少一個(gè)具有對(duì)于人血清白蛋白 的特異性的單結(jié)構(gòu)域抗體相融合。在一個(gè)實(shí)施方案中，具有對(duì)于目的抗原的特異性的所述抗體片段是Fab片段。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，具有對(duì)于目的抗原的特異性的所述抗體片段是Fab’片段。因此，在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體融合蛋白是翻譯融合蛋白，即基 因融合物，其各自的序列由表達(dá)載體編碼。備選地，所述抗體融合蛋白組分通過使用化學(xué)手 段，即通過化學(xué)綴合或化學(xué)交聯(lián)進(jìn)行融合。此類化學(xué)手段是本領(lǐng)域已知的。在一個(gè)實(shí)例中，所述抗體片段是Fab’片段，其具有天然的或經(jīng)修飾的鉸鏈區(qū)。當(dāng) 用于在制備本發(fā)明的雙特異性抗體融合蛋白中使用的抗體片段是Fab’片段時(shí)，所述片段一 般在重鏈的C-末端處延長一個(gè)或多個(gè)氨基酸。因此，本發(fā)明的抗體融合物可以包含直接地 或經(jīng)由接頭與dAb相翻譯融合(或化學(xué)融合)的Fab’片段。此外，合適的抗體Fab’片段 的例子包括在W02005003170和W02005003171中描述的那些。在另一個(gè)實(shí)例中，所述抗體片段是Fab片段。因此，本發(fā)明的抗體融合物可以包含 與接頭序列相翻譯融合(或化學(xué)融合)的Fab片段，而所述接頭序列與dAb相翻譯融合(或 化學(xué)融合)。優(yōu)選地，所述Fab片段是在鏈間半胱氨酸處終止的Fab片段，如W02005/003169 中所描述的。在本發(fā)明中有用的抗體Fab或Fab’片段可以來自任何物種，但優(yōu)選地源自單克隆 抗體、人抗體，或者是人源化的片段。用于在本發(fā)明中使用的抗體片段可以源自免疫球蛋白 分子的任何類別(例如IgG、IgE、IgM、IgD或IgA)或亞類，并且可以獲自任何物種，包括例 如小鼠、大鼠、鯊魚、兔、豬、倉鼠、駱駝、美洲駝、山羊或人。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體Fab或Fab’片段是單克隆的、完全人的、人源化的或 嵌合的抗體片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體Fab或Fab’片段是完全人的或人源化的。單克隆抗體可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法來制備，例如雜交瘤技術(shù)(Kohler & Milstein, Nature，1975，256，495-497)、三源雜交瘤技術(shù)、人B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor 等人，Immunology Today, 1983,4,72)和 EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole 等人，“Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy，，,第 77-96 頁，Alan R. Liss, Inc. , 1985)。用于在本發(fā)明中使用的抗體還可以使用單淋巴細(xì)胞抗體方法來產(chǎn)生，所述單淋 巴細(xì)胞抗體方法通過克隆且表達(dá)從被選擇用于產(chǎn)生特異性抗體的單個(gè)淋巴細(xì)胞中產(chǎn)生的 免疫球蛋白可變區(qū)cDNAs，其中通過例如由Babcook，J.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996,93(15) ,7843-7848 ；WO 92/02551 ；W02004/051268 ；和 W02004/106377 所描述的方法來進(jìn)行。人源化抗體是來自非人物種的抗體分子，其具有一個(gè)或多個(gè)來自非人物種的互補(bǔ) 性決定區(qū)(⑶Rs)和來自人免疫球蛋白分子的構(gòu)架區(qū)(參見例如US 5，585，089)。用于在本發(fā)明中使用的抗體還可以使用本領(lǐng)域已知的各種噬菌體展示方法來 產(chǎn)生，并且包括由下列文獻(xiàn)所公開的那些Brinkman等人，J. Immunol. Methods, 1995, 182，41-50 ；Ames 等人，J. Immunol. Methods, 1995，184，177-186 ；Kettleborough 等人， Eur. J. Immunol.，1994，24，952-958 ；Persic 等人，Gene，1997187，9-18 ；和 Burton 等人， Advances in Immunology,1994,57,191-280 ；W090/02809 ；W0 91/10737；W0 92/01047 ； W0 92/18619 ；W0 93/11236 ；W0 95/15982 ；和 W0 95/20401 ；和 US 5，698，426 ；5，223，409 ； 5，403，484 ；5，580，717 ；5，427，908 ；5，750，753 ；5，821，047 ；5，571，698 ；5，427，908 ； 5，516，637 ；5，780，225 ；5，658，727 ；5，733，743 ；和 5，969，108。此外，轉(zhuǎn)基因小鼠或其他生 物(包括其他哺乳動(dòng)物)可以用于產(chǎn)生人源化抗體。完全人的抗體是這樣的那些抗體，在所述抗體中重鏈和輕鏈的可變區(qū)和恒定區(qū) (當(dāng)存在時(shí))都是人起源的，或者基本上等同于人起源的序列，不必來自相同的抗體。完全 人的抗體的例子可以包括例如通過上文所描述的噬菌體展示方法而產(chǎn)生的抗體，和由其中 鼠類免疫球蛋白可變區(qū)和恒定區(qū)基因已被其人對(duì)應(yīng)物替代的小鼠所產(chǎn)生的抗體，例如如在 EP0546073BUUS 5, 545, 806,US 5, 569, 825,US 5, 625, 126,US 5, 633, 425,US 5,661,016、 US 5, 770, 429, EP 0438474B1 和 EP0463151B1 中所概括性地描述的。用于在本發(fā)明中使用的抗體Fab或Fab，片段起始材料可以獲自任何完整的抗體， 尤其是完整的單克隆抗體，其中使用任何合適的酶促切割和/或消化技術(shù)，例如通過用胃 蛋白酶進(jìn)行處理。備選地或者另外地，抗體起始材料可以通過使用重組DNA技術(shù)來制備，其 中牽涉編碼抗體可變區(qū)和/或恒定區(qū)的DNA的操作和再表達(dá)。標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)可以用 于修飾、添加或刪除氨基酸或結(jié)構(gòu)域，如所希望的。對(duì)于可變區(qū)或恒定區(qū)的任何改變?nèi)匀话?括在本文所使用的術(shù)語“可變區(qū)”和“恒定區(qū)”的范圍內(nèi)。所述抗體片段起始材料可以獲自任何物種，包括例如小鼠、大鼠、兔、倉鼠、駱駝、 美洲駝、山羊或人。所述抗體片段的部分可以獲自超過一個(gè)物種，例如所述抗體片段可以 是嵌合的。在一個(gè)實(shí)例中，恒定區(qū)來自一個(gè)物種，而可變區(qū)來自另一個(gè)物種。所述抗體片 段起始材料也可以是經(jīng)修飾的。在另一個(gè)實(shí)例中，所述抗體片段的可變區(qū)通過使用重組 DNA改造技術(shù)來形成。此類經(jīng)改造的變化形式包括例如通過對(duì)于天然抗體的氨基酸序列 進(jìn)行插入、缺失或改變而從天然抗體可變區(qū)形成的那些。這種類型的具體例子包括這樣的 那些經(jīng)改造的可變區(qū)結(jié)構(gòu)域，其包含來自一種抗體的至少一個(gè)CDR和任選地一個(gè)或多個(gè)構(gòu) 架氨基酸，以及來自第二種抗體的該可變區(qū)結(jié)構(gòu)域的其余部分。用于形成和制備這些抗體 片段的方法是本領(lǐng)域眾所周知的(參見例如，Boss等人，US 4，816，397 ；Cabilly等人，US 6，331，415 ；Shrader 等人，W0 92/02551 ；Ward 等人，1989，Nature，341，544 ；Orlandi 等人， 1989，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86，3833 ；Riechmann 等人，1988，Nature, 322，323 ；Bird 等人，1988，Science, 242,423 ；Queen 等人，US 5，585，089 ；Adair, W091/09967 ；Mountain 禾口 Adair，1992，Biotechnol. Genet. Eng. Rev,10，1—142 ；Verma 等人，1998，Journalof Immunological Methods,216,165-181)。在本發(fā)明中，與Fab或Fab’片段相融合的每個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體可以直接地或經(jīng)由接頭進(jìn)行連接。用于使dAb與Fab或Fab’相連接的合適的接頭區(qū)的例子包括但不限于，柔性接 頭序列和剛性接頭序列。柔性接頭序列包括在下列文獻(xiàn)中所描述的那些=Huston等人， 1988，PNAS 85 :5879_5883 ；Wright &Deonarain, Mol.Immunol. ,2007,44(11) 2860-2869 ； Alfthan 等人，Prot. Eng. , 1995,8(7) :725_731 ；Luo 等人，J. Biochem.，1995，118 (4) 825-831 ；Tang 等人，1996，J. Biol. Chem. 271 (26) 15682-15686 ；和 Turner 等人，1997， JIMM 205，42-54 (關(guān)于代表性的例子參見表1)。表1.柔性接頭序列 剛性接頭的例子包括肽序列GAPAPAAPAPA(SEQ ID NO 34)、PPPP (SEQ ID NO 35) 禾口 PPPo在一個(gè)實(shí)施方案中，將抗體鉸鏈序列或其部分用作接頭，例如上部鉸鏈序列。通 常，用于在本發(fā)明中使用的抗體Fab，片段具有天然的或經(jīng)修飾的鉸鏈區(qū)。將此類鉸鏈區(qū)用 作關(guān)于所述dAb部分的天然接頭。所述天然鉸鏈區(qū)是通常與抗體分子的ChI結(jié)構(gòu)域相關(guān)聯(lián) 的鉸鏈區(qū)。經(jīng)修飾的鉸鏈區(qū)是在長度和/或組成方面與天然鉸鏈區(qū)不同的任何鉸鏈。此類 鉸鏈可以包括來自任何其他物種的鉸鏈區(qū)，例如人、小鼠、大鼠、兔、倉鼠、駱駝、美洲駝或山 羊鉸鏈區(qū)。其他經(jīng)修飾的鉸鏈區(qū)可以包括源自具有與所述ChI結(jié)構(gòu)域不同的類別或亞類的 抗體的完整的鉸鏈區(qū)。因此，例如，Yl類別的ChI結(jié)構(gòu)域可以附著至類別的鉸鏈區(qū)。 備選地，經(jīng)修飾的鉸鏈區(qū)可以包括天然鉸鏈的部分或重復(fù)單元(其中在所述重復(fù)中的每個(gè) 單元源自天然鉸鏈區(qū))。在進(jìn)一步的備選方案中，通過將一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸或其他殘基轉(zhuǎn) 變成中性殘基例如丙氨酸，或者通過將處于合適位置的殘基轉(zhuǎn)變成半胱氨酸殘基，可以改 變天然鉸鏈區(qū)。通過此類手段，可以增加或減少鉸鏈區(qū)中的半胱氨酸殘基的數(shù)目。此外，可 以控制鉸鏈的其他特征，例如鉸鏈半胱氨酸與輕鏈鏈間半胱氨酸的距離、鉸鏈半胱氨酸之 間的距離、以及鉸鏈中可能影響鉸鏈的特性(例如柔韌性)的其他氨基酸的組成，例如可以 將甘氨酸摻入到鉸鏈中以增加旋轉(zhuǎn)柔韌性，或者可以摻入脯氨酸以減少柔韌性。備選地，可 以將帶電荷的或疏水性的殘基的組合摻入到鉸鏈中以賦予多聚化(multimerisation)特 性，關(guān)于帶電荷的或離子性的尾(例如酸性尾)作為接頭的使用，參見例如Richter等人， 2001，Prot. Eng. 14(10) =775-783 ；和關(guān)于亮氨酸拉鏈序列，參見例如Kostelny等人，1992， J. Immunol. 5(1) :1547_1553。其他經(jīng)修飾的鉸鏈區(qū)可以是完全合成的，并且可以被設(shè)計(jì)為 具有所希望的特性例如長度、組成和柔韌性。許多經(jīng)修飾的鉸鏈區(qū)已例如描述在US5, 677，425、US6642356、W09915549、 W02005003170、W02005003169、W02005003170、W09825971 和 W02005003171 中，并且這些專
利文獻(xiàn)通過提及而合并入本文。此類鉸鏈一般緊跟在所述CHl區(qū)之后，但也可以摻入至輕 鏈κ或λ片段的恒定區(qū)的末端處；關(guān)于例子參見表2。
表2.鉸鏈接頭序列 用于在本發(fā)明中使用的單可變結(jié)構(gòu)域(也稱為單結(jié)構(gòu)域抗體或dAbs)可以使 用本領(lǐng)域已知的方法來產(chǎn)生，并且包括在W02005118642 ；Ward等人，1989，Nature, 341, 544-546 ；和 Holt 等人，2003，Trendsin Biotechnology，21，484-490 中所公開的那些。在 一個(gè)實(shí)施方案中，用于在本發(fā)明中使用的單結(jié)構(gòu)域抗體是重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)或輕鏈結(jié) 構(gòu)域(VL)。每個(gè)輕鏈結(jié)構(gòu)域可以是k或\亞組的。用于分離VH和VL結(jié)構(gòu)域的方法已在 本領(lǐng)域中進(jìn)行了描述，參見例如EP0368684和Ward等人(同上)。此類結(jié)構(gòu)域可以源自任 何合適的物種或抗體起始材料。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述單結(jié)構(gòu)域抗體可以源自嚙齒動(dòng)物、 人或其他物種。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述單結(jié)構(gòu)域抗體是人源化的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述單結(jié)構(gòu)域抗體源自噬菌體展示文庫，其中使用在例如 W02005/118642 Jespers 等人，2004，NatureBiotechnology, 22,1161-1165 ；和 Holt 等人， 2003，Trends inBiotechnology，21，484-490中所描述的方法。優(yōu)選地，此類單結(jié)構(gòu)域抗體 是完全人的，但也可以源自其他物種。將會(huì)意識(shí)到，所述單結(jié)構(gòu)域抗體的序列在分離后可以 進(jìn)行修飾，以改善單結(jié)構(gòu)域抗體的特征例如可溶性，如Holt等人(同上)中所描述的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述dAb是獲自scFv噬菌體展示或者獲自轉(zhuǎn)基因的Humouse 或Velocimouse 或者人源化的嚙齒動(dòng)物的人序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述dAb獲自人或人源化的嚙齒動(dòng)物、駱駝科動(dòng)物或鯊魚。此 類dAb將優(yōu)選地是人源化的。在一個(gè)實(shí)例中，所述單結(jié)構(gòu)域抗體是基于駱駝科動(dòng)物免疫球 蛋白的VHH結(jié)構(gòu)域，如EP0656946中所描述的。在一個(gè)實(shí)例中，用目的抗原對(duì)駱駝或美洲駝 進(jìn)行免疫接種，并且在滴度合適時(shí)收集血液?？梢酝ㄟ^單細(xì)胞PCR來克隆編碼所述dAb的基因，或者可以通過EBV轉(zhuǎn)化或通過與無限增殖細(xì)胞系相融合來使編碼所述dAb的B細(xì)胞 永生化。如本文上面所描述的，本發(fā)明提供了雙特異性抗體融合蛋白，其包含具有對(duì)于目 的抗原的特異性的抗體Fab或Fab’片段，所述片段直接地或經(jīng)由接頭與至少一個(gè)具有對(duì)于 第二目的抗原的特異性的單結(jié)構(gòu)域抗體相融合。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體片段例如Fab或Fab’片段直接地或經(jīng)由接頭 在重鏈或輕鏈可變區(qū)的N-末端處與dAb相融合。備選地，所述抗體Fab或Fab’片段直接地 或經(jīng)由接頭在重鏈或輕鏈的C-末端處與dAb相融合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體Fab 或Fab’片段的重鏈和輕鏈各自直接地或經(jīng)由接頭在C-末端處與dAb相融合。所述連接可 以是化學(xué)綴合，但最優(yōu)選地是翻譯融合，即其中各自的序列順次由表達(dá)載體進(jìn)行編碼的基 因融合。通常，所述單結(jié)構(gòu)域抗體的N-末端將直接地或經(jīng)由接頭與所述Fab或Fab’片段 的重鏈或輕鏈的C-末端相融合，并且當(dāng)所述單結(jié)構(gòu)域抗體與所述Fab或Fab’的N-末端相 融合時(shí)，它將經(jīng)其C-末端(任選地經(jīng)由接頭)進(jìn)行融合。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了雙特異性抗體融合蛋白，其包含具有對(duì)于目的 抗原的特異性的抗體Fab或Fab’片段，或者由具有對(duì)于目的抗原的特異性的抗體Fab或 Fab'片段組成，所述片段在重鏈或輕鏈的N-末端處與具有對(duì)于第二目的抗原的特異性的 單結(jié)構(gòu)域抗體相融合。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了雙特異性抗體融合蛋白，其包含具有對(duì)于目的 抗原的特異性的抗體Fab或Fab’片段，或者由具有對(duì)于目的抗原的特異性的抗體Fab或 Fab'片段組成，所述片段在重鏈或輕鏈的C-末端處與具有對(duì)于第二目的抗原的特異性的 單結(jié)構(gòu)域抗體相融合。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了雙特異性抗體融合蛋白，其包含具有對(duì)于目的 抗原的特異性的抗體Fab或Fab’片段，或者由具有對(duì)于目的抗原的特異性的抗體Fab或 Fab'片段組成，所述片段在重鏈或輕鏈的C-末端處與至少一個(gè)具有對(duì)于第二目的抗原的 特異性的單結(jié)構(gòu)域抗體相融合。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了雙特異性抗體融合蛋白，其包含具有對(duì)于目的 抗原的特異性的抗體Fab或Fab’片段，或者由具有對(duì)于目的抗原的特異性的抗體Fab或 Fab'片段組成，所述片段與兩個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體相融合，其中每個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體以線性順序 彼此融合(任選地經(jīng)由接頭)，并且所得到的單結(jié)構(gòu)域抗體融合物與所述Fab或Fab’片段 的輕鏈或重鏈的C-末端相融合。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了雙特異性抗體融合蛋白，其包含具有對(duì)于目的 抗原的特異性的抗體Fab或Fab’片段，或者由具有對(duì)于目的抗原的特異性的抗體Fab或 Fab'片段組成，所述片段與兩個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體相融合，其中一個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體與所述Fab 或Fab’片段的輕鏈的C-末端相融合，而另一個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體與所述Fab或Fab’片段的重 鏈的C-末端相融合，所述單結(jié)構(gòu)域抗體具有對(duì)于第二目的抗原的特異性。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)所述Fab或Fab’片段的重鏈和輕鏈各自在C-末端處包含單 結(jié)構(gòu)域抗體時(shí)，這兩個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體是等同的，即具有相同的對(duì)于相同抗原的結(jié)合特異性。 在一個(gè)實(shí)例中，它們結(jié)合在相同抗原 上的相同表位。例如，所述單結(jié)構(gòu)域抗體可以均為相同的VHdAb、相同的VHH dAb或相同的VL dAb。優(yōu)選地，當(dāng)所述Fab或Fab’片段的重鏈和輕鏈各自在C_末端處包含單結(jié)構(gòu)域抗 體時(shí)，這兩個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體是協(xié)作地結(jié)合抗原的互補(bǔ)VH/VL對(duì)，即它們是具有相同的結(jié)合 特異性的互補(bǔ)VH/VL對(duì)。通常，它們將是源自相同抗體的VH/VL對(duì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)本發(fā)明的雙特異性抗體融合蛋白包含為互補(bǔ)VH/VL對(duì)的兩 個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體時(shí)，VH單結(jié)構(gòu)域抗體與重鏈恒定區(qū)(CH1)的C-末端相融合，并且VL單結(jié) 構(gòu)域抗體與輕鏈恒定區(qū)(Ck或CX)的C-末端相融合。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)本發(fā)明的雙特異性抗體融合蛋白包含為互補(bǔ)VH/VL對(duì)的兩 個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體時(shí)，VL單結(jié)構(gòu)域抗體與重鏈恒定區(qū)(CH1)的C-末端相融合，并且VH單結(jié) 構(gòu)域抗體與輕鏈恒定區(qū)(Ck或CX)的C-末端相融合。在本發(fā)明的雙特異性融合蛋白中，所述單結(jié)構(gòu)域抗體與第二種抗原相結(jié)合，所述 第二種抗原與由所述Fab或Fab’片段組分所結(jié)合的那種抗原不同。在一個(gè)實(shí)例中，用于在本發(fā)明中使用的dAbs展示出對(duì)于補(bǔ)體途徑蛋白、CD標(biāo)志蛋 白或FcyR的特異性。在這種情況下，所述dAb優(yōu)選地對(duì)于CD分子是特異的。最優(yōu)選地， 所述dAb展示出對(duì)于選自下列的⑶分子的特異性⑶68、⑶80、⑶86、⑶64、⑶3、⑶4、⑶8、 CD45、CD16 和 CD35。在優(yōu)選的實(shí)例中，用于在本發(fā)明中使用的dAbs展示出對(duì)于血清載體蛋白、循環(huán)免 疫球蛋白分子或CD35/CR1的特異性，所述血清載體蛋白優(yōu)選地是人血清載體蛋白例如甲 狀腺素結(jié)合蛋白、運(yùn)甲狀腺素蛋白、a 1-酸性糖蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、纖維蛋白原或血清白蛋白。 最優(yōu)選地，所述dAb展示出對(duì)于人血清白蛋白的特異性。因此，在一個(gè)實(shí)例中，用血清載體 蛋白、循環(huán)免疫球蛋白分子或CD35/CR1 (例如人血清白蛋白)對(duì)兔、小鼠、大鼠、駱駝或美洲 駝進(jìn)行免疫接種，并且在滴度合適時(shí)收集血液?？梢酝ㄟ^單細(xì)胞PCR來克隆編碼所述dAb 的基因，或者可以通過EBV轉(zhuǎn)化或通過與無限增殖細(xì)胞系相融合來使編碼所述dAb的B細(xì) 胞永生化。備選地，所述單結(jié)構(gòu)域抗體可以通過如本文上面所描述的噬菌體展示來獲得。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述單結(jié)構(gòu)域抗體結(jié)合人血清白蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，所 述單結(jié)構(gòu)域抗體結(jié)合人血清白蛋白、鼠類血清白蛋白和大鼠血清白蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)合血清白蛋白的單結(jié)構(gòu)域抗體是在W02005/118642中 提供的dAb (參見例如圖lc和ld)，或在W02004/041862中提供的VHH，或在W02006/122787 的例如表III中描述的人源化的納米抗體(nanobody)。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于在本發(fā)明中使用的結(jié)合人血清白蛋白的單結(jié)構(gòu)域抗體是 重鏈VH單結(jié)構(gòu)域抗體，其包含下列⑶R中的至少一個(gè)具有在圖5(e)SEQ ID NO :56或圖 5 (k) SEQ ID NO 62中給出的關(guān)于CDR-H1的序列的CDR，具有在圖5 (f) SEQ ID NO 57或圖 5(1)SEQ ID NO 63中給出的關(guān)于CDR-H2的序列的CDR，和具有在圖5 (g) SEQ ID NO 58或 圖5(m)SEQ ID NO 64中給出的關(guān)于⑶R-H3的序列的CDR。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于在本發(fā)明中使用的結(jié)合人血清白蛋白的單結(jié)構(gòu)域抗體 是重鏈VH抗體，其中VH結(jié)構(gòu)域的⑶R-H1、⑶R-H2和⑶R-H3中的至少兩個(gè)選自下列在SEQ ID NO 56 或 SEQ ID NO 62 中給出的關(guān)于 CDR-H1 的序列，在 SEQ ID NO 57 或 SEQ ID NO 63中給出的關(guān)于⑶R-H2的序列，和在SEQ ID NO 58或SEQ ID NO :64中給出的關(guān)于⑶R-H3 的序列。例如，所述單結(jié)構(gòu)域抗體可以包含VH結(jié)構(gòu)域，其中⑶R-H1具有在SEQ ID NO 56中給出的序列，并且⑶R-H2具有在SEQ ID NO :57中給出的序列。備選地，所述單結(jié)構(gòu)域抗 體可以包含VH結(jié)構(gòu)域，其中⑶R-Hl具有在SEQ ID NO :56中給出的序列，并且⑶R-H3具有 在SEQ ID NO :58中給出的序列。為了避免疑問，應(yīng)當(dāng)理解包括了所有排列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于在本發(fā)明中使用的結(jié)合人血清白蛋白的單結(jié)構(gòu)域抗體 是重鏈VH單結(jié)構(gòu)域抗體，其中所述VH結(jié)構(gòu)域包含有在SEQ ID NO :56中給出的關(guān)于⑶R-Hl 的序列，在SEQ ID NO 57中給出的關(guān)于⑶R-H2的序列，和在SEQ ID NO 58中給出的關(guān)于 CDR-H3的序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于在本發(fā)明中使用的結(jié)合人血清白蛋白的單結(jié)構(gòu)域抗體 是重鏈VH單結(jié)構(gòu)域抗體，其中所述VH結(jié)構(gòu)域包含有在SEQ ID NO :62中給出的關(guān)于⑶R-Hl 的序列，在SEQ ID NO 63中給出的關(guān)于⑶R-H2的序列，和在SEQ ID NO 64中給出的關(guān)于 CDR-H3的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于在本發(fā)明中使用的結(jié)合人血清白蛋白的單結(jié)構(gòu)域抗體是 人源化的重鏈VH單結(jié)構(gòu)域抗體，dAbHl，其具有在圖5(a) (SEQ ID NO 52)中給出的序列。 合適的CHl-dAbHl融合物(包含G4S接頭)的例子在圖6 (SEQ ID NO 68)中給出。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于在本發(fā)明中使用的結(jié)合人血清白蛋白的單結(jié)構(gòu)域抗體是 人源化的重鏈VH單結(jié)構(gòu)域抗體，dAbH2，其具有在圖5(c) (SEQ ID NO 54)中給出的序列。 合適的CHl-dAbH2融合物(包含G4S接頭)的例子在圖6 (SEQ ID NO 69)中給出。根據(jù)由Kabat等人設(shè)計(jì)出的系統(tǒng)，對(duì)抗體可變結(jié)構(gòu)域中的殘基常規(guī)地進(jìn)行編號(hào)。 這禾中系統(tǒng)在 Kabat 等人，1987, Sequences of Proteinsof Immunological Interest, US Department of Health and HumanServices，NIH，USA (下文中稱為"Kabat 等人(同上)”) 中進(jìn)行了闡述。除非另有說明，在本說明書中使用這種編號(hào)系統(tǒng)。Kabat殘基名稱并不總是與氨基酸殘基的線性編號(hào)直接地相對(duì)應(yīng)。實(shí)際的線性氨 基酸序列可能包含比在嚴(yán)格Kabat編號(hào)中更少或額外的氨基酸，這相應(yīng)于結(jié)構(gòu)組分的縮短 或向結(jié)構(gòu)組分中的插入，無論是基本可變結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的構(gòu)架還是互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)。通過 使抗體序列中的同源性殘基與“標(biāo)準(zhǔn)” Kabat編號(hào)序列進(jìn)行比對(duì)，關(guān)于給定的抗體可以確定 殘基的正確的Kabat編號(hào)。根據(jù)Kabat編號(hào)系統(tǒng)，重鏈可變結(jié)構(gòu)域的⑶Rs位于殘基31-35 (⑶R-H1)、殘基 50-65 (CDR-H2)和殘基 95-102 (CDR-H3)處。然而，根據(jù) Chothia (Chothia，C.和 Lesk, A. M. J. Mol. Biol.，196，901-917 (1987))，等價(jià)于 CDR-Hl 的環(huán)從殘基 26 延伸至殘基 32。因 此，如本文所使用的，“⑶R-Hl ”包括殘基26至35，如由Kabat編號(hào)系統(tǒng)和Chothia的拓?fù)?環(huán)(topological loop)定義的組合所描述的。根據(jù)Kabat編號(hào)系統(tǒng)，輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDRs位于殘基24-34(CDR-Ll)、殘基 50-56 (CDR-L2)和殘基 89-97 (CDR-L3)處。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于在本發(fā)明中使用的結(jié)合人血清白蛋白的單結(jié)構(gòu)域抗體是 輕鏈VL單結(jié)構(gòu)域抗體，其包含下列⑶R中的至少一個(gè)具有在圖5(h) SEQ ID NO :59或圖 5 (n) SEQ ID NO :65中給出的關(guān)于CDR-Ll的序列的CDR，具有在圖5⑴SEQ ID NO :60或圖 5 (ο) SEQ ID NO 66中給出的關(guān)于CDR-L2的序列的CDR，和具有在圖5 (j) SEQ ID NO 61或 圖5 (ρ) SEQ ID NO 67中給出的關(guān)于CDR-L3的序列的CDR0在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于在本發(fā)明中 使用的結(jié)合人血清白蛋白的單結(jié)構(gòu)域抗體是輕鏈VL抗體，其中VL結(jié)構(gòu)域的⑶R-Ll、⑶R-L2和⑶R-L3中的至少兩個(gè)選自下列在SEQ ID NO 59 或 SEQ ID NO 65 中給出的關(guān)于 CDR-Ll 的序列，在 SEQ ID NO 60 或 SEQ ID NO 66中給出的關(guān)于⑶R-L2的序列，和在SEQ ID N0:61或SEQ ID NO :67中給出的關(guān)于CDR-L3 的序列。例如，所述結(jié)構(gòu)域抗體可以包含VL結(jié)構(gòu)域，其中⑶R-Ll具有在SEQ ID NO 59中 給出的序列，并且⑶R-L2具有在SEQ ID NO :60中給出的序列。備選地，所述結(jié)構(gòu)域抗體可 以包含VL結(jié)構(gòu)域，其中⑶R-Ll具有在SEQ ID NO :59中給出的序列，并且⑶R-L3具有在 SEQ ID NO :61中給出的序列。為了避免疑問，應(yīng)當(dāng)理解包括了所有排列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于在本發(fā)明中使用的結(jié)合人血清白蛋白的單結(jié)構(gòu)域抗體 是輕鏈VL結(jié)構(gòu)域抗體，其中所述VL結(jié)構(gòu)域包含有在SEQ ID NO 59中給出的關(guān)于⑶R-Ll 的序列，在SEQ ID NO 60中給出的關(guān)于⑶R-L2的序列，和在SEQ ID NO 61中給出的關(guān)于 CDR-L3的序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于在本發(fā)明中使用的結(jié)合人血清白蛋白的單結(jié)構(gòu)域抗體 是輕鏈VL結(jié)構(gòu)域抗體，其中所述VL結(jié)構(gòu)域包含有在SEQ ID NO 65中給出的關(guān)于⑶R-Ll 的序列，在SEQ ID NO 66中給出的關(guān)于⑶R-L2的序列，和在SEQ ID NO 67中給出的關(guān)于 CDR-L3的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于在本發(fā)明中使用的結(jié)合人血清白蛋白的單結(jié)構(gòu)域抗體是 人源化的輕鏈VL單結(jié)構(gòu)域抗體，dAbLl，其具有在圖5(b) (SEQ ID NO 53)中給出的序列。 合適的CHl-dAbLl融合物和Ckl-dAbLl融合物(均包含G4S接頭)的例子在圖6 (SEQ ID NO 70 和 SEQ ID NO 72)中給出。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于在本發(fā)明中使用的結(jié)合人血清白蛋白的單結(jié)構(gòu)域抗體是 人源化的輕鏈VL單結(jié)構(gòu)域抗體，dAbL2，其具有在圖5(d) (SEQ ID NO 55)中給出的序列。 合適的CHl-dAbL2融合物和Ckl-dAbL2融合物(均包含G4S接頭)的例子在圖6 (SEQ ID NO 71 和 SEQ ID NO 73)中給出。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)所述Fab或Fab’片段的重鏈和輕鏈各自在C-末端處包含 單結(jié)構(gòu)域抗體，并且這兩個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體是協(xié)作地結(jié)合抗原的互補(bǔ)VH/VL對(duì)(如本文上面 所描述的)時(shí)，VH dAb 是 dAbHl (SEQID NO 52)，并且 VL dAb 是 dAbLl (SEQ ID NO 53)。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)所述Fab或Fab’片段的重鏈和輕鏈各自在C-末端處包含 單結(jié)構(gòu)域抗體，并且這兩個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體是協(xié)作地結(jié)合抗原的互補(bǔ)VH/VL對(duì)(如本文上面 所描述的)時(shí)，VH dAb 是 dAbH2 (SEQID NO 54)，并且 VL dAb 是 dAbL2 (SEQ ID NO 55)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了白蛋白結(jié)合抗體或其片段，其包含有在本文上面和 圖5(e-p)中所提供的⑶Rs中的一個(gè)或多個(gè)。所述⑶Rs可以摻入到任何合適的抗體構(gòu)架 和任何合適的抗體形式之中。此類抗體包括完整抗體以及其在功能上有活性的片段或衍生 物，其可以是但不限于單克隆的、人源化的、完全人的或嵌合的抗體。因此，此類白蛋白結(jié) 合抗體可以包括具有全長重鏈和輕鏈的完整抗體分子或其片段，并且可以是但不限于Fab， 經(jīng)修飾的Fab，F(xiàn)ab，，F(xiàn)(ab，)2，F(xiàn)v，單結(jié)構(gòu)域抗體，scFv，二、三或四價(jià)抗體，Bis-scFv，雙抗 體，三抗體，四抗體和上述中的任何的表位結(jié)合片段(參見例如，Holliger和Hudson，2005， Nature Biotech.23 (9) :1126_1136 ；Adair 禾口 Lawson,2005,Drug Design Reviews-Online 2 (3)，209-217)。用于形成和制備這些抗體片段的方法是本領(lǐng)域眾所周知的(參見例如， Verma 等人，1998，Journal of Immunological Methods，216，165-181)。多價(jià)抗體可以包含多重特異性或者可以是單特異性的(參見例如W092/22853和W005/113605)。將會(huì)意識(shí) 到，本發(fā)明的這個(gè)方面還延伸至這些白蛋白結(jié)合抗體的變體。將會(huì)意識(shí)到，此類白蛋白結(jié)合抗體，特別是單結(jié)構(gòu)域抗體，可以與任何其他抗體或 蛋白質(zhì)或其他分子相綴合，如在任何其他合適的情形下所希望或使用的。在一個(gè)實(shí)例中，在 上文所描述的且在圖5 (a-d)中所顯示的單結(jié)構(gòu)域抗體dAbHl、dAbLl、dAbH2、dAbL2可以摻 入到任何合適的抗體形式中，或者在任何合適的情形(例如融合物或綴合物)下用作單結(jié) 構(gòu)域抗體。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的這個(gè)方面的抗體包含有在圖5(e)中給出的關(guān)于 CDR-Hl的序列，在圖5(f)中給出的關(guān)于CDR-H2的序列，和在圖5(g)中給出的關(guān)于CDR-H3 的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的這個(gè)方面的抗體包含有在圖5(k)中給出的關(guān)于 CDR-Hl的序列，在圖5⑴中給出的關(guān)于CDR-H2的序列，和在圖5 (m)中給出的關(guān)于CDR-H3 的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的這個(gè)方面的抗體包含有在圖5(h)中給出的關(guān)于 CDR-Ll的序列，在圖5⑴中給出的關(guān)于CDR-L2的序列，和在圖5(j)中給出的關(guān)于CDR-L3 的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的這個(gè)方面的抗體包含有在圖5(n)中給出的關(guān)于 ⑶R-Ll的序列，在圖5(0)中給出的關(guān)于⑶R-L2的序列，和在圖5(p)中給出的關(guān)于⑶R-L3 的序列。當(dāng)本發(fā)明的雙特異性融合蛋白的單結(jié)構(gòu)域抗體與白蛋白相結(jié)合時(shí)，所述單結(jié)構(gòu)域 抗體對(duì)于白蛋白的結(jié)合親和力將足以延長所述Fab或Fab’在體內(nèi)的半衰期。已報(bào)道了， 小于或等于2. 5μΜ親和力的對(duì)于白蛋白的親和力將會(huì)延長體內(nèi)半衰期(Nguyen，Α.等人 (2006) Protein Engineering, Design & Selection，19 (7)，291-297)。本發(fā)明的單結(jié)構(gòu)域 抗體分子優(yōu)選地具有適合于其目的和它們所與之結(jié)合的抗原的結(jié)合親和力。在一個(gè)實(shí)例 中，所述單結(jié)構(gòu)域抗體具有高的結(jié)合親和力，例如PM。在一個(gè)實(shí)例中，所述單結(jié)構(gòu)域抗體具 有為nM或μ M的對(duì)于抗原的結(jié)合親和力。親和力可以使用本領(lǐng)域已知的任何合適方法來 測(cè)量，包括如在本文實(shí)施例中所描述的BIAcore，其中使用天然或重組抗原。優(yōu)選地，結(jié)合白蛋白的本發(fā)明的單結(jié)構(gòu)域抗體分子具有大約2 μ M或更好的結(jié)合 親和力。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的單結(jié)構(gòu)域抗體分子具有大約ΙμΜ或更好的結(jié)合親 和力。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的單結(jié)構(gòu)域抗體分子具有大約500ηΜ或更好的結(jié)合親和 力。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的單結(jié)構(gòu)域抗體分子具有大約200ηΜ或更好的結(jié)合親和力。 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)構(gòu)域抗體分子具有大約InM或更好的結(jié)合親和力。將會(huì)意 識(shí)到，使用本領(lǐng)域已知的任何合適方法可以改變由本發(fā)明所提供的和本領(lǐng)域中已知的單結(jié) 構(gòu)域抗體的親和力。因此，本發(fā)明還涉及本發(fā)明的結(jié)構(gòu)域抗體分子的變體，其具有改善的 對(duì)于白蛋白的親和力。此類變體可以通過許多親和力成熟方案來獲得，包括使⑶Rs突變 (Yang 等人，J. Mol. Biol.，2M，392-403，1995)、鏈改組(Marks 等人，Bio/Technology，邊， 779-783，1992)、大腸桿菌(E. coli)增變株的使用(Low 等人，J. Mol. Biol.，250，359-368， 1996)、DNA 改組(Patten 等人，Curr. Opin. Biotechnol. ,8,724-733,1997)、噬菌體展示 (Thompson 等人，J. Mol. Biol. ,256,77-88,1996)和有性 PCR(Crameri 等人，Nature, 391,288-291，1998)。Vaughan等人(同上)討論了這些親和力成熟方法。本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明的雙特異性抗體融合蛋白的分離的DNA序列。本發(fā)明的DNA序列可以包括合成DNA (例如通過化學(xué)加工而產(chǎn)生的)、cDNA、基因組DNA或其任何組合。編碼本發(fā)明的雙特異性抗體融合蛋白的DNA序列可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所 周知的方法來獲得。例如，如所希望的，可以從確定的DNA序列或者基于相應(yīng)的氨基酸序列 來合成編碼所述抗體片段、接頭和/或dAbs的部分或全部的DNA序列?？梢允褂梅肿由飳W(xué)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來制備編碼本發(fā)明的雙特異性抗體融合蛋白的 DNA序列。可以使用寡核苷酸合成技術(shù)來完全或部分地合成所需的DNA序列。在合適時(shí)，可 以使用位點(diǎn)定向誘變和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的DNA序列的克隆或表達(dá)載體。因此， 提供了包含一個(gè)或多個(gè)DNA序列的克隆或表達(dá)載體，所述DNA序列編碼本發(fā)明的雙特異性 抗體融合蛋白。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述克隆或表達(dá)載體包含編碼整個(gè)雙特異性抗 體融合蛋白的單個(gè)DNA序列。因此，所述克隆或表達(dá)載體順次包含DNA編碼的轉(zhuǎn)錄單元，從 而使得產(chǎn)生出翻譯融合蛋白。事實(shí)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，本發(fā)明的融合蛋白可以在N-末端或C-末端處 具有所述dAb，并因此dAb DNA編碼的轉(zhuǎn)錄單元將會(huì)在編碼翻譯融合物的DNA序列內(nèi)分別處 于開始或最后。因此，翻譯融合物可以包含N-末端dAb和C-末端Fab或Fab’。此外，翻譯 融合物可以包含N-末端Fab或Fab，和C-末端dAb。將會(huì)意識(shí)到，所述Fab或Fab’的重鏈和輕鏈可以摻入到相同或不同的載體中。在 一個(gè)實(shí)施方案中，一種載體可以包括包含F(xiàn)ab或Fab’重鏈和C-末端dAb的翻譯融合物，而 另一種載體可以包括包含F(xiàn)ab或Fab’輕鏈和C-末端dAb的翻譯融合物。例如，當(dāng)希望產(chǎn)生在抗體片段的N-末端處具有dAb部分的雙特異性抗體融合蛋白 時(shí)，載體將以順次順序包含下列DNA轉(zhuǎn)錄單元編碼dAb部分的DNA轉(zhuǎn)錄單元；任選地，編 碼接頭序列的DNA轉(zhuǎn)錄單元；和編碼抗體片段的DNA轉(zhuǎn)錄單元。當(dāng)希望產(chǎn)生在抗體片段的 C-末端處具有dAb部分的雙特異性抗體融合蛋白時(shí)，載體將以順次順序包含下列DNA轉(zhuǎn)錄 單元編碼抗體片段的DNA轉(zhuǎn)錄單元；任選地，編碼接頭序列的DNA轉(zhuǎn)錄單元；和編碼dAb 部分的DNA轉(zhuǎn)錄單元，所述dAb部分具有對(duì)于血清載體蛋白、循環(huán)免疫球蛋白分子或CD35/ CRl(例如人血清白蛋白)的特異性。因此，本發(fā)明的翻譯融合物可以以不同的構(gòu)造，包括 例如但不限于，dAb-接頭-Fab、Fab-接頭-dAb、dAb_Fab、Fab_dAb、Fab，-dAb、dAb_Fab，、 dAb-接頭-Fab’、Fab’ -接頭-dAb。當(dāng)例如使用兩種載體時(shí)，第一種可以包含與dAb相融 合的Fab或Fab’的重鏈，而第二種可以包含與dAb相融合的Fab或Fab’的輕鏈。關(guān)于包含在本發(fā)明的翻譯融合物中的抗體片段的DNA密碼可以作為轉(zhuǎn)錄單元摻 入到載體中，其中以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的構(gòu)造，例如轉(zhuǎn)錄單元可以包含關(guān)于輕鏈的密碼， 隨后為重鏈密碼，或者反之亦然；參見，特別是Humphreys等人，2002，Protein Expression andPurifixation, 26 :309_320。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的載體包含合適的前導(dǎo)序列，例如抗體前導(dǎo)序列。此類前導(dǎo)序 列是本領(lǐng)域眾所周知的。通過其可以構(gòu)建出載體的一般方法、轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)化方法以及培養(yǎng)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。在這方面，可參考“CurrentProtocols in Molecular Biology”， 1999, F. Μ· Ausubel (編輯)，Wiley Interscience, New York,禾口由 Cold Spring Harbor Publishing 出品的 Maniatis Manual。還提供了包含一種或多種克隆或表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，所述克隆或表達(dá)載體包含 一個(gè)或多個(gè)編碼本發(fā)明的雙特異性抗體融合蛋白的DNA序列。任何合適的宿主細(xì)胞/載體 系統(tǒng)可以用于表達(dá)編碼所述雙特異性抗體融合蛋白的DNA序列?？梢允褂眉?xì)菌例如大腸桿 菌和其他微生物系統(tǒng)，或者還可以使用真核生物例如哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。合適的 哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括NSO、CH0、骨髓瘤或雜交瘤細(xì)胞。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，在大腸 桿菌中表達(dá)本發(fā)明的融合蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的融 合蛋白ο
本發(fā)明還提供了用于產(chǎn)生雙特異性抗體融合蛋白的方法，其包括在適合于從編碼 所述雙特異性抗體融合蛋白的DNA序列中表達(dá)出蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)包含本發(fā)明的載體 的宿主細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于分離所述雙特異性抗體融合蛋白的方法。在產(chǎn)生之后，當(dāng)需要時(shí)，通過使用本領(lǐng)域已知的任何合適方法，可以純化出本發(fā)明 的雙特異性抗體融合蛋白?？梢允褂美绲幌抻谏V法技術(shù)，例如離子交換、大小排阻、 G蛋白或疏水相互作用色譜法。雙特異性抗體融合蛋白的大小可以通過本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法來證實(shí)，例如大小 排阻色譜法和非還原性SDS-PAGE。此類技術(shù)可以用于證實(shí)，所述蛋白質(zhì)未二聚化和/或不 具有部分缺失(例如dAb部分)。如果檢測(cè)出二聚體，那么可以通過使用如上所描述的常規(guī) 色譜法技術(shù)來從二聚體種類中純化出單體的雙特異性抗體融合蛋白。本發(fā)明的雙特異性抗體融合蛋白在疾病或病癥的治療中有用，所述疾病或病癥包 括炎性疾病和病癥、免疫疾病和病癥、纖維變性病癥和癌癥。術(shù)語“炎性疾病或病癥”和“免疫疾病或病癥”包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié) 炎、斯蒂爾病、穆-韋病(Muckle Wellsdisease)、銀屑病、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、SLE(系 統(tǒng)性紅斑狼瘡)、哮喘、變應(yīng)性鼻炎、特應(yīng)性皮炎、多發(fā)性硬化、脈管炎、I型糖尿病、移植和 移植物抗宿主病。術(shù)語“纖維變性病癥”包括特發(fā)性肺纖維化(IPF)、系統(tǒng)性硬化病(或硬皮病)、 腎纖維化、糖尿病性腎病、IgA腎病、高血壓、終末期腎臟病、腹膜纖維變性(不臥床持 續(xù)腹膜透析)、肝硬化、年齡相關(guān)的黃斑變性(ARMD)、視網(wǎng)膜病變、心臟反應(yīng)性纖維化 (cardiacreactive fibrosis)、瘢痕形成、瘢痕瘤、燒傷、皮膚潰瘍、血管成形術(shù)、冠狀動(dòng)脈 搭橋手術(shù)、關(guān)節(jié)成形術(shù)和白內(nèi)障手術(shù)。術(shù)語“癌癥”包括起于上皮的、在皮膚中或更通常地在身體器官(例如乳腺、卵 巢、前列腺、肺、腎、胰腺、胃、膀胱或腸)的襯里(lining)中發(fā)現(xiàn)的惡性新生長。癌癥趨于 浸潤到相鄰組織中并且擴(kuò)散(轉(zhuǎn)移)至遠(yuǎn)離的器官，例如至骨、肝、肺或腦。因此，根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步方面，提供了藥物組合物，其包含與一種或多種藥學(xué)上 可接受的載體、賦形劑或稀釋劑相聯(lián)合的本發(fā)明的抗體融合物。還提供了本發(fā)明的抗體融 合蛋白在制備用于治療疾病或病癥的藥物中的用途。最優(yōu)選地，所述疾病或病癥是炎性疾 病或病癥。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可以采取適合于口服、頰、腸胃外、皮下、鼻、局部、眼或直腸施用的形式，或者適合于通過吸入或吹入進(jìn)行施用的形式。當(dāng)適當(dāng)時(shí)，例如如果所述抗體融合蛋白的單結(jié)構(gòu)域抗體與白蛋白相結(jié)合，那么可 以值得做的是，通過使用本領(lǐng)域已知的任何合適方法，用人或重組血清白蛋白對(duì)所述雙特 異性融合蛋白進(jìn)行預(yù)配制。
對(duì)于口服施用，所述藥物組合物可以采取例如片劑、錠劑或膠囊的形式，其通過常 規(guī)方法用藥學(xué)上可接受的賦形劑例如粘合劑(例如預(yù)膠化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或 羥丙基甲基纖維素)；填充劑(例如乳糖、微晶纖維素或磷酸氫鈣)；潤滑劑(例如硬脂酸 鎂、滑石或硅石)；崩解劑(例如馬鈴薯淀粉或乙醇酸鈉)；或潤濕劑(例如月桂基硫酸鈉) 來制備。片劑可以通過本領(lǐng)域眾所周知的方法進(jìn)行包衣。用于口服施用的液體制劑可以采 取例如溶液、糖漿劑或懸浮液的形式，或者它們可以呈現(xiàn)為用于在使用前用水或其他合適 的媒介物進(jìn)行構(gòu)建的干燥產(chǎn)物。此類液體制劑可以通過常規(guī)方法用藥學(xué)上可接受的添加劑 來進(jìn)行制備，所述添加劑例如為懸浮劑、乳化劑、非水性媒介物或防腐劑。當(dāng)適當(dāng)時(shí)，所述制 劑還可以包含緩沖鹽類、矯味劑、著色劑或甜味劑。用于口服施用的制劑可以適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行配制，以產(chǎn)生活性化合物的受控釋放。
對(duì)于頰施用，所述組合物可以采取以常規(guī)方式配制的片劑或錠劑的形式。本發(fā)明的雙特異性抗體可以被配制成用于腸胃外施用，所述腸胃外施用通過注 射，例如通過推注或輸注來進(jìn)行。用于注射的制劑可以呈現(xiàn)為單位劑型，例如在玻璃安瓿或 多劑量容器例如玻璃小瓶中。用于注射的組合物可以采取諸如在油性或水性媒介物中的懸 浮液、溶液或乳狀液的形式，并且可以包含配制試劑(formulatory agent)，例如懸浮劑、穩(wěn) 定劑、防腐劑和/或分散劑。備選地，活性成分可以為用于在使用前用合適的媒介物例如無 熱原的無菌水進(jìn)行構(gòu)建的粉末形式。除了上面所描述的制劑外，本發(fā)明的雙特異性抗體也可以配制為貯庫制劑。此類 長效制劑可以通過植入或者通過肌內(nèi)注射來進(jìn)行施用。對(duì)于鼻施用或通過吸入施用，根據(jù)本發(fā)明的化合物可以方便地以用于加壓包裝或 噴霧器的噴霧劑呈現(xiàn)形式進(jìn)行遞送，其中使用合適的推進(jìn)劑例如二氯二氟甲烷、一氟三氯 甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合適的氣體或氣體混合物。如果需要，所述組合物可以呈現(xiàn)在包裝或分配裝置中，所述包裝或分配裝置可以 包含一個(gè)或多個(gè)含有活性成分的單位劑型。所述包裝或分配裝置可以附有關(guān)于施用的說明 書。對(duì)于局部施用，根據(jù)本發(fā)明的化合物可以方便地配制在包含活性組分的合適的軟 膏中，所述活性組分懸浮或溶解在一種或多種藥學(xué)上可接受的載體中。具體的載體包括例 如礦物油、液體石油、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯、乳化蠟和水。備選地，根據(jù)本發(fā)明的化合 物可以配制在包含活性組分的合適的洗劑中，所述活性組分懸浮或溶解在一種或多種藥學(xué) 上可接受的載體中。具體的載體包括例如礦物油、脫水山梨糖醇單硬脂酸酯、聚山梨醇酯 60、鯨蠟基酯蠟、鯨蠟硬脂醇(cetearyl alcohol)、苯甲醇、2_辛基十二烷醇和水。對(duì)于眼施用，根據(jù)本發(fā)明的化合物可以方便地配制為在等滲的、pH經(jīng)調(diào)整的無菌 鹽水中的微離子化(microionized)的懸浮液，其中具有或不具有防腐劑例如殺細(xì)菌劑或 殺真菌劑，例如硝酸苯汞、苯扎氯銨或醋酸氯己定。備選地，對(duì)于眼施用，化合物可以配制在 軟膏例如凡士林中。
對(duì)于直腸施用，根據(jù)本發(fā)明的化合物可以方便地配制為栓劑。這些可以通過將活性組分與合適的非刺激性賦形劑相混合來制備，所述非刺激性賦形劑在室溫下是固體但在 直腸溫度下是液體，并因而將會(huì)在直腸中融化從而釋放出活性組分。此類材料包括例如可 可脂、蜂蠟和聚乙二醇。對(duì)于預(yù)防或治療特定病狀所需的本發(fā)明化合物的量將依賴于所選擇的化合物和 待治療的患者的病狀而改變。然而，一般而言，日劑量可以為大約lOng/kg至1000mg/kg，通 常100ng/kg至100mg/kg，例如對(duì)于口服或頰施用為大約0. 01mg/kg至40mg/kg體重，對(duì)于 腸胃外施用為大約lOng/kg至50mg/kg體重，和對(duì)于鼻施用或者通過吸入或吹入施用為大 約0. 05mg至大約lOOOmg，例如大約0. 5mg至大約lOOOrng。本發(fā)明的每個(gè)實(shí)施方案的優(yōu)選特征比照適用于其他實(shí)施方案中的每一個(gè)。在本說 明書中所引用的所有出版物(包括但不限于專利和專利申請(qǐng))通過提及而合并入本文，就 如同每一單個(gè)出版物被明確和單獨(dú)地指明通過提及而合并(好像完全闡述似的)一樣?，F(xiàn)在，將就下列實(shí)施例而言來描述本發(fā)明，所述實(shí)施例僅是舉例說明性的，而無論 如何不應(yīng)當(dāng)解釋為限制了本發(fā)明的范圍。附圖列表

圖1 :Fab-dAbs的圖解表示，其中dAb在C-末端處。圖 2 :Fab-didAbs 的圖解表示。圖 3 :FabA-dAbL3 (CK-SG4SE) (1)和 FabA_dAbL3 (CK-G [APAPA] 2) (2)的 SDS PAGE 分 析。圖 4 :FabA-dAbL3 (CK-SG4SE) (1)和 FabA_dAbL3 (CK-G [APAPA] 2) (2)的 Western 印 跡分析。圖 4a :FabB-didAbs 的 SDS PAGE 泳道M = SeeBlue標(biāo)準(zhǔn)參照物泳道1和2 = IgG對(duì)照泳道3 = FabB泳道4 = FabB-didAb, -dAbLl (ck_G4Sx2) & dAbHl (CH1_G4Sx2)泳道5 = FabB-didAb, _dAbL2 (ck_G4Sx2) & dAbH2 (CH1_G4Sx2)。圖5 結(jié)構(gòu)域抗體dAbHl、dAbH2、dAbLl和dAbL2以及源自這些抗體中每一個(gè)的 ⑶Rs的序列。圖6 :FabB-dAb構(gòu)建體，其包含與結(jié)構(gòu)域抗體相融合的FabB重鏈或輕鏈可變結(jié)構(gòu) 域。圖Fab，A重鏈和輕鏈序列以及FabA重鏈序列。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1 對(duì)于人血清白蛋白特異的dAb的產(chǎn)生使用重組DNA技術(shù)來產(chǎn)生由符合讀框的DNA編碼的轉(zhuǎn)錄單元，其編碼具有對(duì)于人 血清白蛋白的特異性的dAb。當(dāng)需要時(shí)，使用重組DNA技術(shù)可以產(chǎn)生由符合讀框的DNA編碼的轉(zhuǎn)錄單元，其編碼 具有對(duì)于募集蛋白的特異性的dAb。實(shí)施例2 抗體片段的產(chǎn)生
為了 dAb與輕鏈C-末端的融合，合成了編碼人κ輕鏈恒定區(qū)(具有κ恒 定區(qū)的Km3同種異型)、肽接頭和dAb的DNA，并將其作為SacI-PvuII限制片段克隆 到UCB-Celltech內(nèi)部的(in-house)表達(dá)載體pTTOD(Fab) (ρΤΤ0-1的衍生物，其描述在 Popplewell等人，Methods Mol. Biol. 2005 ；308 17-30中)中，所述表達(dá)載體包含編碼人 Y-ICHl恒定區(qū)的DNA。這產(chǎn)生了由下列組成的雙順反子基因排列經(jīng)由接頭與dAb相融合 的人源化輕鏈的基因，隨后為人源化重鏈Fab片段的基因，兩者都在tac啟動(dòng)子的控制下。 還編碼了在Gly4Ser接頭上游的獨(dú)特的BspEl位點(diǎn)，或在富含Ala-Pro的接頭上游的AscI 位點(diǎn)。
為了 dAb與重鏈C-末端的融合，合成了編碼人CHl片段(具有Yl同種型)以及 隨后的接頭編碼序列和dAb的DNA。將這作為Apal-EcoRI限制片段亞克隆到UCB-Celltech 內(nèi)部的表達(dá)載體pTTOD (Fab) (pTTO-1的衍生物，其描述在Popplewell等人(上文)中)中， 所述表達(dá)載體包含編碼人Y-ICHl恒定區(qū)的DNA。這產(chǎn)生由下列組成的雙順反子基因排列 人源化輕鏈的基因，非編碼性基因間序列，隨后為經(jīng)由接頭與dAb相融合的重鏈的基因，這 兩個(gè)基因都在tac啟動(dòng)子的控制下。將該重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株W3110中，在 其中通過添加IPTG來誘導(dǎo)表達(dá)。最初通過在大約0. 5的0D(600nm)時(shí)添加200uMIPTG來 以小規(guī)模進(jìn)行表達(dá)實(shí)驗(yàn)(5ml培養(yǎng)體積)，在誘導(dǎo)后2小時(shí)收獲細(xì)胞，并且在Tris/EDTA中于 30°C提取過夜。將經(jīng)澄清的提取物用于通過Biacore的親和力分析。選擇給出有前途的表 達(dá)產(chǎn)率和活性的構(gòu)建體用于發(fā)酵。^^在下列實(shí)施例中，將dAb所與之融合的抗體鏈命名為CK或LC (對(duì)于c κ輕鏈)，和 命名為CHl或HC (對(duì)于重鏈恒定結(jié)構(gòu)域CHl)。用于在大腸桿菌中表達(dá)的FabA-dAb融合物質(zhì)粒的構(gòu)建通過使dAbL3或dAbH4與FabA的輕鏈或重鏈恒定區(qū)的C-末端相融合來構(gòu)建 Fab-dAb融合蛋白。使用柔性接頭(SGGGGSE(SEQ ID NO :1))或剛性接頭(G (APAPA) 2 (SEQ ID NO 34))來將 dAb 與 c κ 區(qū)(SEQ IDNO 75)相連接，而使用接頭 DKTHTS (SEQ ID NO 2) 來將dAb與CHI區(qū)(SEQ ID NO 76)相連接。作為片段合成地制備編碼恒定區(qū)_dAb融合物 的DNA序列，以使得能夠亞克隆到內(nèi)部的pTTOD載體的FabA序列中。通過下列方式來構(gòu)建輕鏈-dAb融合物將合成的基因的SacI-ApaI片段亞克隆到 能夠表達(dá)FabA的質(zhì)粒的相應(yīng)位點(diǎn)中，所述合成的基因編碼經(jīng)由柔性接頭(SGGGGSE(SEQ ID NO 1))或剛性接頭(G (APAPA) 2 (SEQ ID NO :34))與 dAbL3 或 dAbH4 相融合的 C-末端 c κ。通過下列方式來構(gòu)建重鏈-dAb融合物將合成的基因的Apal-EcoRI片段亞克隆 到能夠表達(dá)FabA的質(zhì)粒的相應(yīng)位點(diǎn)中，所述合成的基因編碼經(jīng)由DKTHTS接頭與dAbL3或 dAbH4相融合的C-末端CHI。Fab’A源自IL-I β結(jié)合抗體，其重鏈和輕鏈序列分別提供在圖7中所示的SEQ ID NO 74和75中。在其中輕鏈具有附著的dAb的Fab，A中，將重鏈的鉸鏈改變?yōu)镈KTHTS，即 使當(dāng)無dAb與重鏈(SEQ ID NO 76)相附著時(shí)。FabA包含相同的輕鏈序列(SEQ ID NO 75)和在鏈間半胱氨酸處終止的截短的重 鏈序列(SEQ ID NO 77)。dAbL3和dAbH4分別為結(jié)合人血清白蛋白的輕鏈和重鏈結(jié)構(gòu)域抗體。
用干在大腸桿菌中表汰的FabA-didAb融合物質(zhì)粒的構(gòu)律通過將編碼CHl-dAb融合物的Apal-EcoRI片段亞克隆到現(xiàn)有的Fab_dAb質(zhì)粒(其 中dAb經(jīng)由柔性接頭與輕鏈相融合)中來構(gòu)建在輕鏈和重鏈上均具有dAbL3或dAbH4的 FabA-didAbο用干在Π甫gL云M勿細(xì)胞沖表汰的FabB-dAb融合物質(zhì)粒的構(gòu)律FabB-dAb s、FabB-dAbHl (CH1_G4Sx2)、FabB_dAbH2 (CHI-G4Sx2)、FabB-dAbLl (CH1_G4Sx2)、FabB_dAbL2 (CH1_G4Sx2)都通過 PCR 進(jìn)行裝配，然后克隆到哺乳動(dòng) 物表達(dá)載體中從而在HCMV-MIE啟動(dòng)子和SV40E polyA序列的控制下。這些與包含F(xiàn)abB輕 鏈的相似載體相配對(duì)以用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)(參見下文)。FabB源自結(jié)合細(xì)胞表面共刺激分子的抗體。如實(shí)施例3中所描的，獲得dAbHl、dAbH2、dAbLl和dAbL2。用干在π甫gL云M勿細(xì)朐中表汰的FabB-dAb融合質(zhì)粒的構(gòu)律FabB-dAbs、FabB-dAbHl (CH1_G4Sx2)、FabB_dAbH2 (CH1_G4Sx2)、 FabB-dAbLl (CK_G4Sx2)、FabB_dAbL2 (CK_G4Sx2)都通過PCR進(jìn)行裝配，然后克隆到哺乳動(dòng)物 表達(dá)載體中從而在HCMV-MIE啟動(dòng)子和SV40E polyA序列的控制下。FabB-dAbs和didAbs的哺乳動(dòng)物表汰根據(jù)制造商的說明書，使用Invitrogen的293feCtin轉(zhuǎn)染試劑，用重鏈和 輕鏈質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。簡而言之，使2yg重鏈質(zhì)粒+2yg輕鏈質(zhì)粒與ΙΟμΙ 293fectin+340 μ 1 Optimem介質(zhì)一起在RT下溫育20分鐘。然后，將該混合物添加至處于 懸浮的5 X IO6個(gè)ΗΕΚ293細(xì)胞，并且于37°C在搖動(dòng)下溫育4天。Biacore使用CM5 傳感器芯片和 HBS-EP(10mM HEPES (pH7. 4), 150mM NaCl,3mM EDTA, 0. 05 % ν/ν表面活性劑Ρ20)運(yùn)行緩沖液，通過在BiacoreT 100上進(jìn)行的表面等離子共 振(SPR)來測(cè)定關(guān)于Fab-dAb構(gòu)建體的相互作用的結(jié)合親和力和動(dòng)力學(xué)參數(shù)。使用人 F (ab，)2-特異性山羊 Fab (Jackson ImmunoResearch, 109-006-097)或內(nèi)部產(chǎn)生的抗人 CHl 單克隆抗體來將Fab-dAb樣品捕獲至傳感器芯片表面。通過標(biāo)準(zhǔn)的胺偶聯(lián)化學(xué)來達(dá)到捕獲 抗體的共價(jià)固定。每個(gè)試驗(yàn)循環(huán)由下述組成首先采用1分鐘注射來捕獲Fab-dAb，隨后為由3分鐘 的抗原注射組成的締合階段，在這之后監(jiān)控解離5分鐘。在每個(gè)循環(huán)后，采用下列方式來使 捕獲表面再生2X 1分鐘的40mMHCl注射，隨后為30秒的5mM NaOH0所使用的流速對(duì)于捕 獲來說為10 μ 1/分鐘，對(duì)于締合和解離階段來說為30 μ 1/分鐘，和對(duì)于再生來說為10 μ 1/ 分鐘。關(guān)于動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)，執(zhí)行抗原滴定法(對(duì)于人血清白蛋白通常為62. 5ηΜ_2μΜ，對(duì)于 IL-I β為1.25-40ηΜ)，將空白流動(dòng)池(flow-cell)用于參照扣除，并且包括了緩沖液空白 注射以扣除儀器噪聲和偏移。使用Biacore T100評(píng)價(jià)軟件，通過所得到的傳感圖(sensorgram)與標(biāo)準(zhǔn)1 1 結(jié)合模型的同時(shí)總體配合(simultaneousglobal-fitting)來測(cè)定動(dòng)力學(xué)參數(shù)。為了測(cè)試同時(shí)的結(jié)合，在被捕獲的Fab-dAb上注射分開的5 μ MHSA或IOOnM IL-I β，或者5 μ M HSA和IOOnM IL-1 β的混合溶液的3分鐘注射。
從大腸桿菌中純化Fab-dAb周質(zhì)提取將在周質(zhì)內(nèi)包含F(xiàn)ab-dAbs的大腸桿菌粒狀沉淀重懸浮在具有IOOmM Tris/HCl,IOmM EDTA pH 7. 4的原始培養(yǎng)體積中。然后，使這些懸浮液于4°C在250rpm下溫育16小 時(shí)。使重懸浮的粒狀沉淀于4°C以IOOOOxg離心1小時(shí)。去除上清液，并且進(jìn)行0.45 μ m過
濾οG蛋白捕獲通過G蛋白色譜法從經(jīng)過濾的上清液中捕獲Fab-dAbs。簡而言之，以20分鐘 的停留時(shí)間將上清液施加至在20mM磷酸鹽，150mM NaClpH7. 1中平衡的Gammabind Plus Sepharose (GE Healthcare)柱。用 20mM 磷酸鹽，150mM NaCl pH7. 1 洗滌該柱，并且用 0. IM 甘氨酸/HClpH2. 8洗脫下結(jié)合的材料。收集洗脫峰，并且用IM乙酸鈉將pH調(diào)整至 pH5。 將pH經(jīng)調(diào)整的洗出液濃縮，并且使用IOk麗CO膜而滲濾到50mM乙酸鈉pH4. 5中。離子交換用NaCl洗脫梯度，在pH4. 5下，通過陽離子交換色譜法來進(jìn)一步純化Fab-dAbs。 簡而言之，將經(jīng)滲濾的G蛋白洗出液施加至在50mM乙酸鈉pH4. 5中平衡的Sourcel5S(GE Healthcare)柱。用50mM乙酸鈉pH4. 5洗滌該柱，并且用20柱體積的在50mM乙酸鈉pH4. 5 中0至IM NaCl的線性梯度來洗脫下結(jié)合的材料。在該梯度自始至終收集第三柱體積級(jí)分。 通過A280和SDS-PAGE來分析所述級(jí)分，并且匯集相關(guān)級(jí)分。凝膠過濾如果需要，通過凝膠過濾來進(jìn)一步純化Fab-dAbs。簡而言之，將 FabA-dAbL3 (CK-SG4SE)匯集的離子交換洗脫級(jí)分施加至在50mM乙酸鈉，125mM NaCl pH 5. 0 中平衡的 Superdex200(GE Healthcare)柱，并且用 50mM 乙酸鈉，125mM NaCl pH 5. 0 的 等度梯度(isocraticgradient)來進(jìn)行洗脫。在該梯度自始至終收集1/120柱體積級(jí)分。 通過A280和SDS-PAGE來分析所述級(jí)分，并且匯集相關(guān)級(jí)分。對(duì)于未經(jīng)歷凝膠過濾的Fab-dAbs，將匯集的離子交換洗脫級(jí)分濃縮，并且使用IOk MWCO膜而滲濾到50mM乙酸鈉，125mM NaCl pH 5. 0中。SDS-PAGE當(dāng)需要時(shí)用水稀釋樣品，然后向10μ 1中添加IOyL 2Χ樣品走樣緩沖液。對(duì)于非 還原的樣品，在這一點(diǎn)上添加2 μ L IOOmM NEM,而對(duì)于還原的樣品，添加2 μ L IOX還原劑。 使樣品渦旋振蕩，于85°C溫育5分鐘，冷卻，并且在12500rpm下離心30秒。將準(zhǔn)備好的樣 品加載到4-20%丙烯酰胺Tris/甘氨酸SDS凝膠上，并且在125V下走樣100分鐘。將凝膠 轉(zhuǎn)移到PVDF膜上以用于Western印跡法，或者用考馬斯藍(lán)蛋白質(zhì)染料進(jìn)行染色。Western 印跡法在150mA下，在12mM Tris，96mM甘氨酸pH8. 3中，將凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜，共16小 時(shí)。用在PBS+0. 1% Tween20中的2% Marvel (封閉緩沖液)使PVDF膜封閉1小時(shí)?？?輕鏈HRP-兔抗人κ輕鏈，在封閉緩沖液中的1/5000稀釋度，共1小時(shí)?？?重鏈小鼠抗人重鏈，在封閉緩沖液中的1/7000稀釋度，共1小時(shí)。隨后為HRP-山羊抗小鼠，在封閉緩沖液中的1/2000稀釋度，共1小時(shí)?？?His標(biāo)簽 兔抗His6，在封閉緩沖液中的1/1000稀釋度，共1小時(shí)。隨后為HRP-山羊抗兔 IgG，在封閉緩沖液中的1/1000稀釋度，共1小時(shí)。所有印跡用100ml PBS+0. 1 % Tween20洗滌6次，每次洗滌10分鐘。印跡用下列 方式進(jìn)行顯現(xiàn)用ECL試劑1分鐘，隨后暴露于Amersham Hyperfilm ；或者用金屬增強(qiáng)的 DAB試劑20-30分鐘，隨后為水。高溫反相HPLC樣品(2μ g)于80°C在2. Imm C8 Poroshell柱上進(jìn)行分析，其中使用2ml/分鐘的 流速和18-38% B的梯度，經(jīng)過4分鐘。A = 0. 1% TFA,在 H2O 中B = O. 065% TFA，在 80 20 IPA MeOH 中通過在214nm處的吸收來進(jìn)行檢測(cè)。ELISA使用夾心ELISA來測(cè)量Fab-dAb的產(chǎn)率。簡而言之，用抗-CHl抗體來捕獲 Fab-dAb,隨后用抗-κ -HRP來揭示。實(shí)施例3 產(chǎn)?？拱椎鞍卓贵w用重組的chromapure人血清白蛋白(購自Jackson)對(duì)1/2垂耳兔進(jìn)行免疫接 種。兔以皮下方式接受IOOug HSA蛋白的3次免疫接種，第一次免疫接種在完全弗氏佐劑 中，而后續(xù)的免疫接種在不完全弗氏佐劑中。使用W004/051268中描述的方法來分離出結(jié) 合人、小鼠和大鼠血清白蛋白的抗體1和2。分離出抗體1和2的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和 輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)的基因，并進(jìn)行測(cè)序，在經(jīng)由反轉(zhuǎn)錄PCR進(jìn)行克隆后。將所嫁接的輕鏈序列亞克隆到兔輕鏈表達(dá)載體PVRbcK中，所述表達(dá)載體包含編 碼兔C- κ恒定區(qū)的DNA。將所嫁接的重鏈序列亞克隆到兔重鏈表達(dá)載體pVRbHFab中，所 述表達(dá)載體包含編碼兔Fab’重鏈恒定區(qū)的DNA。將質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞中，并且就白蛋 白結(jié)合和親和力來篩選所產(chǎn)生的抗體(表1)。根據(jù)制造商的說明書(InVitrogen，目錄號(hào) 11668)，使用LipofectamineTM2000操作程序來進(jìn)行CHO細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。產(chǎn)生人源化的結(jié)構(gòu)域抗體dAbLl、dAbHl、dAbL2和dAbH2通過使用人V-區(qū)接納體構(gòu)架和供體殘基(在構(gòu)架區(qū)中)來設(shè)計(jì)人源化的VL和VH 區(qū)。對(duì)于抗體1和2中的每一種，設(shè)計(jì)一個(gè)所嫁接的VL區(qū)(Li (SEQ ID NO 53)和L2 (SEQ ID NO 55))和一個(gè) VH 區(qū)(HI (SEQ ID NO 52)和 H2 (SEQ ID NO :54))，并且通過寡核苷酸 裝配和PCR誘變來構(gòu)建基因。所嫁接的結(jié)構(gòu)域抗體及其CDRs顯示在圖5中。表1 抗白蛋白抗體的親和力 實(shí)施例4 在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表汰的FabB-dAbs的分析如在“方法”中所描述的，產(chǎn)生FabB-dAb構(gòu)建體，并且在BIAcore中直接測(cè)試包含 FabB-dAbs的來自經(jīng)轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞的上清液。進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析以評(píng)估HSA與FabB-dAb構(gòu)建體的相互作用。這些構(gòu)建體由與 FabB的CHl的C-末端相融合的dAbLl、dAbH2或dAbL3組成(參見圖6)。FabB_dAbLl對(duì) 于 HSA(Kd = 170nM)具有比 FabB_dAbL3 (KD = 392nM)更高的親和力。FabB_dAbH2 顯示出 具有最差的針對(duì)HSA的親和力(KD = 1074nM)，參見表2。表2 關(guān)于HSA與融合至dAbLl、dAbH2或dAbL3的FabBs的結(jié)合而測(cè)定的親和力和動(dòng)力 學(xué)參數(shù)。所顯示的數(shù)據(jù)為平均值士SEM。(對(duì)于FabB-dAbLl和FabB_dAbH2，η = 4。對(duì)于 FabB-dAbL3, η = 2)。FabB-dAb蛋白質(zhì)的SDS-PAGE和Western印跡法證實(shí)了，所產(chǎn)生的FabB-dAbs具有 預(yù)期的大小。實(shí)施例5 在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表汰的FabB-didAbs的分析如在“方法”中所描述的，產(chǎn)生FabB-didAb構(gòu)建體，并且在BIAcore中直接測(cè)試包 含didAbs的來自經(jīng)轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞的上清液。使用其中將單dAbs與Fab的重鏈和輕鏈C-末端兩者相融合的didAb構(gòu)建體來進(jìn) 行進(jìn)一步的分析。與單獨(dú)的單dAb相比較而言，其中didAb源自天然重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域 配對(duì)的構(gòu)建體顯示出親和力的顯著改善(表2和3)。由兩個(gè)等同的dAbLls組成的didAb 融合物未顯示出超過對(duì)于單個(gè)dAbLl所看到的那種的在親和力方面的改善(數(shù)據(jù)未顯示)。表3

關(guān)于HSA與融合至dAbLl & dAbHl或dAbL2 & dAbH2的FabBs的結(jié)合而測(cè)定的親 和力和動(dòng)力學(xué)參數(shù)。FabB-didAb蛋白質(zhì)的SDS-PAGE證實(shí)了，所述FabB-didAbs良好地表達(dá)并且具有預(yù) 期的大小(參見圖4a)。注意該SDS PAGE凝膠為由細(xì)胞所表達(dá)的總蛋白質(zhì)。實(shí)施例6 經(jīng)純化的FabA-dAbs的分析如在“方法”中所描述的，構(gòu)建出用于在大腸桿菌中表達(dá)Fab-dAbs， Fab，A-dAbL3 (CK-SG4SE) Fab，A_dAbL3 (CK-G[APAPA]2)的質(zhì)粒。如在“方法”中所描述的， 將Fab-dAbs表達(dá)到大腸桿菌的周質(zhì)中，并且純化至均質(zhì)。通過高溫反相HPLC、SDS-PAGE和 Western印跡法來評(píng)估Fab-dAbs的純度。還通過Biacore就抗原結(jié)合來對(duì)Fab-dAbs進(jìn)行 評(píng)估。高溫反相HPLC如在“方法”中所描述的來施行的高溫反相HPLC給出了在FabA_dAbL3 (CK-SG4SE) 和FabA-dAbL3 (CK-G[APAPA]2)中所包含的所有種類的定量分析。所存在的每種種類的百 分比顯示在表4中。表4 在Fab-dAb批次中存在的種類的定量 如在“方法”中所描述的，在非還原和還原條件下準(zhǔn)備Fab-dAb樣品，并且在凝膠 上走樣。對(duì)凝膠進(jìn)行考馬斯染色。Fab，A-dAbL3 (CK-SG4SE)和 Fab，A_dAbL3 (CK_G[APAPA]2) 這兩種Fab-dAb樣品的條帶圖譜與通過高溫反相HPLC所觀察到的圖譜良好地相符合(圖3)。Western 印跡如在“方法”中所描述的，對(duì)Fab-dAb樣品實(shí)施非還原SDS-PAGE，隨后為用抗-輕 鏈和抗_重鏈抗體進(jìn)行的Western印跡分析。這證實(shí)了，dAb在Fab的輕鏈上，并且重鏈在 兩種樣品中均是未修飾的(圖4)。還證明了，通過經(jīng)考馬斯染色的非還原SDS PAGE而檢測(cè) 出的所有條帶都是Fab-dAb相關(guān)產(chǎn)物。Biacore將如在“方法”中所描述的通過SPR的動(dòng)力學(xué)分析用于評(píng)估人血清白蛋白與 Fab，A-dAbL3 (CK-SG4SE)和 Fab，A_dAbL3 (CK-G[APAPA]2)的結(jié)合。表 5 中的結(jié)果證明，這 兩種構(gòu)建體均能夠以大約ΙμΜ的相似的親和力(Kd)結(jié)合人血清白蛋白。表 5 進(jìn)一步的動(dòng)力學(xué)分析證明，所有融合構(gòu)建體保留了原始FabA針對(duì)IL_1 β的相互 作用特征(表6)，其中在動(dòng)力學(xué)和親和力參數(shù)方面僅可見很小的差異。表6 通過將每種構(gòu)建體捕獲至傳感器芯片表面來評(píng)估每種構(gòu)建體同時(shí)與人血清白蛋 白和IL-I β抗原兩者相結(jié)合的潛力，然后施行分開的3分鐘的5 μ M人血清白蛋白或IOOnM IL-I β注射，或者5μ M人血清白蛋白和IOOnM IL-I β兩者的混合溶液注射。對(duì)于每種 Fab-dAb構(gòu)建體，對(duì)于組合的HSA/IL-1 β溶液所看到的應(yīng)答與獨(dú)立注射的應(yīng)答之和幾乎等 同，參見表7。這顯示，所述？油-(^1^能夠同時(shí)與11^-10和人血清白蛋白兩者相結(jié)合，并且 IL-I β或人血清白蛋白的結(jié)合不抑制另一個(gè)的相互作用。原始FabA僅與IL-Ιβ結(jié)合，并 且有著可忽略的與人血清白蛋白的結(jié)合。表 7 上表顯示了在分開注射HSA或IL-1 ^，或者注射預(yù)混合的HSA和IL_1 0后，對(duì)于 每種構(gòu)建體所看到的結(jié)合應(yīng)答(RU)。在每種情況下，終濃度對(duì)于HSA來說為5 u M,和對(duì)于 IL-10來說為100nM。獨(dú)個(gè)的HSA和IL-1 0應(yīng)答之和顯示在括號(hào)中。實(shí)施例7 :FabA didAbsFabA-didAbs在大腸桿菌中的表達(dá)在大腸桿菌中表達(dá)C-末端HIS6標(biāo)簽終止的FabA-dAbs和FabA_didAb融合物。在 周質(zhì)提取后，經(jīng)由C-末端His6標(biāo)簽來純化dAb融合蛋白。通過用抗-CH1和抗-c k抗體 來進(jìn)行的非還原凝膠的Western印跡法來分析Fab表達(dá)。將FabA_dAb和FabA_didAb表達(dá) 為全長蛋白質(zhì)，并且顯示出與所述兩種抗體檢測(cè)試劑反應(yīng)。在大腸桿菌中表達(dá)的FabA-didAbs的分析進(jìn)行進(jìn)一步的分析以表征HSA與已向其融合了一個(gè)或多個(gè)dAbs的FabA構(gòu)建體的 結(jié)合。對(duì)于其中dAbL3或dAbH4與FabA的輕鏈或重鏈相融合的各種構(gòu)建體進(jìn)行結(jié)合試驗(yàn) (關(guān)于構(gòu)建體的細(xì)節(jié)和結(jié)合數(shù)據(jù)的概括參見表8)。盡管看到僅在輕鏈或重鏈上攜帶dAbH4 的構(gòu)建體以相當(dāng)差的親和力(分別 9iiM和3iiM)結(jié)合HSA，但對(duì)于攜帶dAbL3(作為單一 融合物(在輕鏈或重鏈上)或者與在相對(duì)鏈上的第二個(gè)dAb(dAbL3或dAbH4)搭檔)的構(gòu) 建體觀察到較高親和力結(jié)合。表8
權(quán)利要求
雙特異性抗體融合蛋白，其包含具有對(duì)于目的抗原的特異性的抗體Fab或Fab’片段，所述片段與至少一個(gè)具有對(duì)于第二目的抗原的特異性的單結(jié)構(gòu)域抗體相融合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的融合蛋白，其在所述Fab或Fab’片段的重鏈或輕鏈的N-或C-末 端處包含單結(jié)構(gòu)域抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的融合蛋白，其中所述單結(jié)構(gòu)域抗體是VH或VHH。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的融合蛋白，其中所述單結(jié)構(gòu)域抗體是VL。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的融合蛋白，其包含兩個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體，其中一個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體與 所述Fab或Fab，片段的輕鏈的C-末端相融合，而另一個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體與所述Fab或Fab’ 片段的重鏈的C-末端相融合。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的融合蛋白，其中每個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體是具有相同的結(jié)合特異性的VH 結(jié)構(gòu)域。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的融合蛋白，其中每個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體是具有相同的結(jié)合特異性的VL 結(jié)構(gòu)域。
8.根據(jù)權(quán)利要求5的融合蛋白，其中一個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體是VH結(jié)構(gòu)域，而另一個(gè)單結(jié)構(gòu) 域抗體是VL結(jié)構(gòu)域，并且所述VH和VL結(jié)構(gòu)域是協(xié)作地結(jié)合所選擇的抗原的互補(bǔ)VH/VL對(duì)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的融合蛋白，其中所述VH結(jié)構(gòu)域與所述Fab或Fab’片段的重鏈的 C-末端相融合，并且所述VL結(jié)構(gòu)域與所述Fab或Fab’片段的輕鏈的C-末端相融合。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的融合蛋白，其中每個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體是完全人的或人 源化的。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的融合蛋白，其中所述Fab或Fab’是完全人的或人源 化的。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)的融合蛋白，其中與所述抗體Fab或Fab’片段相 融合的每個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體是經(jīng)由獨(dú)立地選自下列的接頭進(jìn)行融合的氨基酸序列GS、PPP、 SEQ ID NO:l、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO 10,SEQ ID NO =IUSEQ ID NO :12、SEQ ID NO 13,SEQ ID NO : 14、SEQ ID NO 15,SEQ IDNO 16,SEQ ID NO :17、SEQ ID NO : 18、SEQ ID NO :19、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :24、SEQ IDNO 25,SEQ ID NO :26、SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :28、SEQ IDNO : 129、SEQ ID NO :30、SEQ ID N0:31、SEQ ID NO :32、SEQ IDNO :33、SEQ ID NO :34、SEQ ID NO :35、SEQ ID NO :36、SEQ ID NO 37,SEQ ID NO :38、SEQ ID NO :39、SEQ ID NO :40、SEQ ID NO :41、SEQ IDNO :42、SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :44、SEQ ID NO :45、SEQ ID NO :46、SEQ ID NO :47、SEQ ID NO :48、 SEQ ID NO :49、SEQ ID NO 50 和 SEQID NO :51。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的融合蛋白，其中所述接頭序列選自SEQIDN0:USEQ ID NO :2、 SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO :45。
14.根據(jù)權(quán)利要求2的融合蛋白，其中所述單結(jié)構(gòu)域抗體經(jīng)由具有SEQID NO :2或SEQ ID NO 45中給出的序列的接頭與所述Fab或Fab，片段的重鏈的C-末端相連接。
15.根據(jù)權(quán)利要求2的融合蛋白，其中所述單結(jié)構(gòu)域抗體經(jīng)由具有SEQID NO :1或SEQ ID NO :45中給出的序列的接頭與所述Fab或Fab，片段的輕鏈的C-末端相連接。
16.根據(jù)權(quán)利要求9的融合蛋白，其中所述VH結(jié)構(gòu)域經(jīng)由具有SEQID NO :2或SEQ IDN0:45中給出的序列的接頭與所述Fab或Fab，片段的重鏈的C-末端相連接，并且所述VL 結(jié)構(gòu)域經(jīng)由具有SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :45中給出的序列的接頭與所述Fab或Fab，片 段的輕鏈的C-末端相連接。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的融合蛋白，其中每個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體具有對(duì)于血清載 體蛋白、循環(huán)免疫球蛋白分子或CD35/CR1的特異性，所述單結(jié)構(gòu)域抗體通過與所述血清載 體蛋白、循環(huán)免疫球蛋白分子或CD35/CR1結(jié)合而為具有對(duì)于所述目的抗原的特異性的所 述抗體Fab或Fab，片段提供了延長的半衰期。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的融合蛋白，其中每個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體的特異性是對(duì)于血清載體蛋 白的。
19.根據(jù)權(quán)利要求17或權(quán)利要求18的融合蛋白，其中所述血清載體蛋白是選自下列的 人血清載體蛋白甲狀腺素結(jié)合蛋白、運(yùn)甲狀腺素蛋白、α -酸性糖蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、纖維 蛋白原和血清白蛋白。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的融合蛋白，其中所述血清載體蛋白是人血清白蛋白。
21.表達(dá)載體，其包含關(guān)于權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)之中所定義的雙特異性抗體融合 蛋白的密碼。
22.宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求21中所定義的載體。
23.權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)之中所定義的雙特異性抗體融合蛋白在制備用于治療疾 病或病癥的藥物中的用途。
24.用于治療疾病或病癥的方法，其包括施用治療有效量的權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng) 之中所定義的雙特異性抗體融合蛋白。
全文摘要
本發(fā)明提供了雙特異性抗體融合蛋白，其包含具有對(duì)于目的抗原的特異性的抗體Fab或Fab’片段，所述片段與至少一個(gè)具有對(duì)于第二目的抗原的特異性的單結(jié)構(gòu)域抗體相融合。
文檔編號(hào)C07K16/46GK101842387SQ200880113719
公開日2010年9月22日 申請(qǐng)日期2008年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月26日
發(fā)明者D·P·胡姆皮雷斯, E·達(dá)弗 申請(qǐng)人:Ucb醫(yī)藥有限公司