專利名稱：雙特異性抗體的制作方法
雙特異性抗體 本發(fā)明涉及雙特異性抗體、其生產(chǎn)方法、含有所述抗體的藥物組合物及其用途。
背景技術(shù)：
最近開發(fā)了多種多特異性重組抗體形式，例如，通過融合例如IgG抗體形式和單鏈結(jié)構(gòu)域的四價雙特異性抗體(參見例如Coloma, M. J.等人，Nature Biotech 15(1997) 159-163 ；W0 2001/077342 和 Morrison，S. L.，NatureBiotech. 25(2007) 1233-1234)。也開發(fā)了若干種其他新形式其中抗體核心結(jié)構(gòu)(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)不再被保留，例如雙抗體、三抗體或四抗體、微抗體(minibodies)、若干種單鏈形式(scFv、Bis-scFv),它們能結(jié)合兩個或更多抗原(Hoi Iiger, P.等人，Nature Biotech23 (2005) 1126-1136 ；Fischer, N.，Leger 0.，Pathobiology 74(2007)3-14 ；Shen,J.等人，Journal of Immunological Methods 318 (2007) 65-74 ;Wu, C.等人，Nature·Biotech.25(2007)1290-1297)。全部此類形式都使用接頭，或用于將抗體核心(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)融合至其他結(jié)合蛋白質(zhì)(例如scFv),或融合例如兩個Fab片段或scFv (Fischer N. , Leger 0.,Pathobiology 74(2007)3-14)。應(yīng)當(dāng)注意,可通過維持與天然存在的抗體的高度相似,來保留效應(yīng)子功能，例如通過Fe受體結(jié)合介導(dǎo)的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)或抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)。在WO 2007/024715中報道了作為改造的多價和多特異性結(jié)合蛋白質(zhì)的雙可變結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白。在US 6，897，044中報道了生物活性抗體二聚體的制備方法。在US7，129，330中報道了具有至少四個通過多肽接頭彼此連接的可變結(jié)構(gòu)域的多價Fv抗體構(gòu)建體。在US 2005/0079170中報道了二聚或多聚抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)。在US 6，511，663中報道了包含三個或四個通過連接結(jié)構(gòu)彼此共價結(jié)合的Fab片段的三價或四價單特異性抗原結(jié)合蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)不是天然免疫球蛋白。在WO 2006/020258中報道了可在原核和真核細(xì)胞中有效率地表達(dá)，并且在治療和診斷方法中有用的四價雙特異性抗體。在US 2005/0163782中報道了從包含通過至少一個鏈間二硫鍵連接的二聚體和沒有通過至少一個鏈間二硫鍵連接的二聚體的混合物中分離上述兩種類型的多肽二聚體，或優(yōu)選地合成通過至少一個鏈間二硫鍵連接的二聚體的方法。在US 5，959，083中報道了雙特異性四價受體。在W02001/077342中報道了具有三個或更多功能性抗原結(jié)合位點的改造的抗體。在WO 1997/001580中報道了多特異性和多價的抗原結(jié)合多肽。W01992/004053報道了通常用結(jié)合相同的抗原決定簇的IgG類的單克隆抗體制備的同種綴合物(homoconjugate)是通過合成交聯(lián)共價連接的。在WO 1991/06305中報道了對抗原具有高親和性的寡聚單克隆抗體，其中分泌的寡聚體，通常屬于IgG類的寡聚體，具有兩個或更多締合到一起形成四價或六價IgG分子的免疫球蛋白單體。在US 6，350，860中報道了源自羊的抗體和改造的抗體構(gòu)建體，它們可用于治療其中干擾素Y活性是病原的疾病。在US2005/0100543中報道了可靶向的構(gòu)建體，它們是雙特異性抗體的多價載體，即可靶向的構(gòu)建體的每個分子可以作為兩個或更多雙特異性抗體的載體。
在WO 1995/009917中報道了遺傳改造的雙特異性四價抗體。在W02007/109254中報道了由穩(wěn)定化的scFv組成或包含穩(wěn)定化的scFv的穩(wěn)定化的結(jié)合分子。從 Lu, D.等人，Biochemical and Biophysical Research Communications318 (2004) 507-513 ；Lu,D.等人，J. Biol. Chem.，279 (2004) 2856-2865 和 Lu，D.等人，J. BiolChem. 280(2005) 19665-72中知曉了針對EGFR和IGF-1R的雙特異性抗體。US 2007/0274985涉及包含單鏈Fab(SCFab)蛋白質(zhì)的合成抗體分子，其也可與二聚體包括異數(shù)抗體締合，其中至少兩個單鏈抗體分子是締合的。WO 2009/080253涉及雙特異性二價抗體。然而，考慮到多特異性抗體的不同的問題和方面(例如藥物動力學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)、穩(wěn)定性、聚集、表達(dá)產(chǎn)量、副產(chǎn)品)，存在對更多備選的多特異性抗體形式的需求。
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發(fā)明概述在一方面，本發(fā)明涉及雙特異性抗體，包含a)特異性結(jié)合第一個抗原的第一個全長抗體的重鏈和輕鏈；b)特異性結(jié)合第二個抗原的第二個全長抗體的重鏈和輕鏈，其中重鏈的N端通過肽接頭連接到輕鏈的C端。在本發(fā)明的另一方面，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體還具有以下特征a)的全長抗體的重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域和b)的全長抗體的重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域各自在包含抗體CH3結(jié)構(gòu)域之間的原界面中的改變的界面處交匯；其中，i)在一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域中用具有較大側(cè)鏈體積的氨基酸殘基取代氨基酸殘基，從而在一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)生成凸起，該凸起可位于另一條重鏈的CH3域的界面內(nèi)的腔內(nèi)并且其中ii)在另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域中用具有較小側(cè)鏈體積的氨基酸殘基取代氨基酸殘基，從而在第二個CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)生成腔，其中第一個CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)的凸起可置于該腔內(nèi)。在另一方面，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體具有以下特征通過引入半胱氨酸(C)作為每個CH3結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)位置的氨基酸，兩個CH3結(jié)構(gòu)域都被進(jìn)一步改變，如此使得兩個CH3結(jié)構(gòu)域之間能形成二硫橋。在本發(fā)明的另一方面，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體具有以下特征b)所述的第二個全長抗體的重鏈和輕鏈的抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)是通過在以下位點之間引入二硫鍵，通過二硫化物穩(wěn)定的i)重鏈可變結(jié)構(gòu)域第44位至輕鏈可變結(jié)構(gòu)域第100位，ii)重鏈可變結(jié)構(gòu)域第105位至輕鏈可變結(jié)構(gòu)域第43位，或iii)重鏈可變結(jié)構(gòu)域第101位至輕鏈可變結(jié)構(gòu)域第100位。在本發(fā)明的另一方面，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體具有以下特征a)第一個全長抗體特異性地結(jié)合IGF-IR并包含具有SEQ ID NO : I的氨基酸序列的重鏈和具有SEQ ID NO 2的氨基酸序列的輕鏈，并且b)第二個全長抗體特異性地結(jié)合EGFR并包含通過肽接頭與輕鏈連接的重鏈，其中所述肽連接的重鏈和輕鏈具有SEQ ID NO 3的氨基酸序列。
在本發(fā)明的另一方面，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體具有以下特征a)第一個全長抗體特異性地結(jié)合IGF-IR并包含具有SEQ ID NO : I的氨基酸序列的重鏈和具有SEQ ID NO 2的氨基酸序列的輕鏈，并且b)第二個全長抗體特異性地結(jié)合EGFR并包含通過肽接頭與輕鏈連接的重鏈，其中所述肽連接的重鏈和輕鏈具有SEQ ID NO 4的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一方面，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體具有以下特征a)第一個全長抗體特異性地結(jié)合EGFR并包含具有SEQ ID NO :5的氨基酸序列的重鏈和具有SEQ ID NO 6的氨基酸序列的輕鏈，并且b)第二個全長抗體特異性地結(jié)合IGF-IR并包含通過肽接頭與輕鏈連接的重鏈， 其中所述肽連接的重鏈和輕鏈具有SEQ ID NO 7的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一方面，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體具有以下特征a)第一個全長抗體特異性地結(jié)合EGFR并包含具有SEQ ID NO :5的氨基酸序列的重鏈和具有SEQ ID NO 6的氨基酸序列的輕鏈，并且b)第二個全長抗體特異性地結(jié)合IGF-IR并包含通過肽接頭與輕鏈連接的重鏈，其中所述肽連接的重鏈和輕鏈具有SEQ ID NO 8的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一方面，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體的特征在于抗體包含IgGl的恒定區(qū)。在本發(fā)明的另一方面，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體的特征在于在Asn297用糖鏈糖基化抗體，其中糖鏈中的巖藻糖量是65%或更低。本發(fā)明的其他方面是包含所述雙特異性抗體的藥物組合物、所述組合物用于治療癌癥、所述雙特異性抗體用于生產(chǎn)制造治療癌癥的藥物的用途、通過向需要此類治療的患者施用所述雙特異性抗體治療罹患癌癥患者的方法。本發(fā)明的其他方面是編碼根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體的鏈的核酸分子。本發(fā)明還提供能在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)所述核酸的含有所述根據(jù)本發(fā)明的核酸的表達(dá)載體，以及含有用于重組生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體的此類載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還包含原核或真核宿主細(xì)胞，其包含根據(jù)本發(fā)明的載體。本發(fā)明還包含生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體的方法，其特征在于在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的核酸并從所述細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中回收所述雙特異性抗體。本發(fā)明還包含通過用于生產(chǎn)雙特異性抗體的此類方法獲得的抗體。本發(fā)明的另一個方面是制備根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體的方法，包括以下步驟a)用包含核酸分子的載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，所述核酸分子編碼aa)特異性結(jié)合第一個抗原的第一個全長抗體的重鏈和輕鏈；；和ab)特異性結(jié)合第二個抗原的第二個全長抗體的重鏈和輕鏈，其中重鏈的N端通過肽接頭與輕鏈的C端連接；和b)在允許合成所述抗體分子的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞；和c)從所述培養(yǎng)物回收所述抗體分子。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體具有有價值的特征，例如在哺乳動物細(xì)胞(例如HEK293細(xì)胞和CHO細(xì)胞)中良好的表達(dá)產(chǎn)量、穩(wěn)定性、生物或藥理學(xué)活性、藥物動力學(xué)性質(zhì)。它們可用于例如治療諸如癌癥的疾病。包含3條多肽鏈的根據(jù)本發(fā)明的這些雙特異性抗體在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)時尤其具有有價值的副產(chǎn)品譜。附圖描述圖I具有包含典型順序的可變結(jié)構(gòu)域和恒定結(jié)構(gòu)域的兩對重鏈和輕鏈的、特異性地結(jié)合第一個抗原I而沒有CH4結(jié)構(gòu)域的全長抗體的示意結(jié)構(gòu)。圖2根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體的示意結(jié)構(gòu)。圖3a和3b根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體的示意結(jié)構(gòu)，包括knobs-intohole修飾的CH3結(jié)構(gòu)域。圖4a和4b根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體的示意結(jié)構(gòu),包括knobs_intohole修飾的 CH3結(jié)構(gòu)域和第二個抗體重鏈和輕鏈的VH和VL結(jié)構(gòu)域的二硫化物穩(wěn)定。圖5根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體Ang2_VEGF 0A-Ava-N_scFabLC06對HUVEC增殖的抑制。圖6根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體Ang2_VEGF 0A-Ava-N_scFabLC06對Tie2磷酸化的抑制。圖70A-Akl8-scFab_GA201 (圖 7a)和 0A-GA201-scFab_Akl8 (圖 7b)的蛋白質(zhì)印跡(還原的)。圖8較之親本單特異性抗體<IGF-1R>HUMAB Clone 18或<EGFR>ICR62，雙特異性〈EGFR-IGF1R〉抗體0A-GA201-scFab_Akl8_WT對H322M癌細(xì)胞生長的抑制(劑量依賴性的)。圖9Biacore (表面等離子體共振)傳感圖雙特異性抗體0A_GA201-scFab_Akl8_WT顯示了同時結(jié)合胺偶聯(lián)的人EGFR和人IGFlR(x軸應(yīng)答，y軸時間)。

圖10較之親本單特異性抗體<IGF-1R>HUMAB Clone 18和<EGFR>ICR62的組合，0A-GA201-scFab-Akl8_WT在BxPC3異種移植物模型中對腫瘤生長的抑制發(fā)明詳述在一方面，本發(fā)明涉及雙特異性抗體，包含a)特異性結(jié)合第一個抗原的第一個全長抗體的重鏈和輕鏈；b)特異性結(jié)合第二個抗原的第二個全長抗體的重鏈和輕鏈，其中重鏈的N端通過肽接頭與輕鏈的C端連接。術(shù)語“全長抗體”指由兩個“全長抗體重鏈”和兩個“全長抗體輕鏈”組成的抗體(見圖I)。“全長抗體重鏈”是由以N端至C端方向的抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)、抗體恒定重鏈結(jié)構(gòu)域I (CHl)、抗體鉸鏈區(qū)(HR)、抗體重鏈恒定結(jié)構(gòu)域2 (CH2)和抗體重鏈恒定結(jié)構(gòu)域3(CH3)組成的多肽，簡寫為VH-CH1-HR-CH2-CH3 ;在屬于IgE亞類的抗體的情況下任選地有重鏈恒定結(jié)構(gòu)域4(CH4)。優(yōu)選地“全長抗體重鏈”是由以N端到C端方向的VH、CHUHR、CH2和CH3組成的多肽?！叭L抗體輕鏈”由以N端至C端方向的抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)和抗體輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域(CL)組成的多肽，簡寫為VL-CL?？贵w輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域(CL)可以是K (kappa)或λ (lambda)。兩個全長抗體鏈通過CL結(jié)構(gòu)域和CHl結(jié)構(gòu)域之間和全長抗體重鏈的鉸鏈區(qū)之間的多肽間二硫鍵連接到一起。典型的全長抗體的實例是天然抗體如IgG (例如IgGl和IgG2)、IgM、IgA、IgD和IgE。根據(jù)本發(fā)明的全長抗體可來自單個物種例如人類，或它們可以是嵌合的或人源化的抗體。根據(jù)本發(fā)明的全長抗體包含兩個抗原結(jié)合位點，每個位點由特異性地結(jié)合相同的抗原的VH和VL對形成。所述全長抗體的重鏈或輕鏈的C端表示位于所述重鏈或輕鏈的C端的最后一個氨基酸。所述全長抗體的重鏈或輕鏈的N端表不位于所述重鏈或輕鏈的N端的最后一個氨基酸。如本發(fā)明中所用的術(shù)語“肽接頭”表示具有氨基酸序列的肽，其優(yōu)選地源自人工合成。根據(jù)本發(fā)明的肽用于通過肽接頭連結(jié)第二個全長抗體(特異性地結(jié)合第二個抗原)輕鏈的C端和重鏈的N端。在第二個全長抗體重鏈和輕鏈中的肽接頭是具有至少30個氨基酸長度，優(yōu)選地32至50個氨基酸長度的氨基酸序列的肽。在一個中肽接頭是具有32至40個氨基酸長度的氨基酸序列的肽。在一個實施方式中所述接頭是(GxS)n，其中G=甘氨酸，
S=絲氨酸，(叉=3,11 = 8、9或10,111 = 0、1、2或3)或(叉=4,和11 = 6、7或8,和111 = 0、1、2或3),優(yōu)選地X = 4, η = 6或7,和m = 0、1、2或3,更優(yōu)選地x = 4, n = 7,m = 2。在一個實施方式中，所述接頭是(G4S)6G2。優(yōu)選地根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體的CH3結(jié)構(gòu)域可以用“knob-into-holes”技術(shù)改變,該技術(shù)在例如WO 96/027011、Ridgway J. B.等人， Protein Eng 9 (1996) 617-621 和 Merchant，A. Μ·等人，Nat Biotechnol 16(1998)677-681中詳細(xì)說明并有一些實例。在該方法中，兩個CH3結(jié)構(gòu)域的相互作用表面被改變以增加含有這兩個CH3結(jié)構(gòu)域的重鏈的異二聚化。(兩條重鏈的)兩個CH3結(jié)構(gòu)域中每個都可作為“knob”,而另一個作為“hole”。二硫橋的引入穩(wěn)定異二聚體(Merchant, A. M等人，NatureBiotech 16 (1998) 677-681 ;Atwell，S.等人 J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35)并增加產(chǎn)量。在本發(fā)明的一方面，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體還具有以下特征一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域和另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域在包含抗體CH3結(jié)構(gòu)域之間的原界面的界面處交匯；其中所述界面被改變以促進(jìn)雙特異性抗體的形成，其中所述改變具有以下特征a) 一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域被改變，使得在雙特異性抗體內(nèi)的在與另一條重鏈CH3結(jié)構(gòu)域的原界面交匯的一條重鏈CH3結(jié)構(gòu)域的原界面內(nèi)，氨基酸殘基被具有較大側(cè)鏈體積的氨基酸殘基取代，從而在一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)生成凸起，該凸起可置于另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)的腔內(nèi)并且b)另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域被改變，使得在雙特異性抗體內(nèi)的在與第一條重鏈CH3結(jié)構(gòu)域的原界面交匯的第二條重鏈CH3結(jié)構(gòu)域的原界面內(nèi)，氨基酸殘基被具有較小側(cè)鏈體積的氨基酸殘基取代，從而在第二個CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)生成腔，第一個CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)的凸起可置于該腔內(nèi)。因此根據(jù)本發(fā)明的抗體優(yōu)選地具有以下特征a)的全長抗體的重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域和b)的全長抗體的重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域各自在包含抗體CH3結(jié)構(gòu)域之間的原界面中交替的界面處交匯；其中，i)在一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域中氨基酸殘基被具有較大側(cè)鏈體積的氨基酸殘基取代，從而在一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)生成凸起，該凸起可置于另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)的腔內(nèi)并且其中
ii)在另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域中氨基酸殘基被具有較小側(cè)鏈體積的氨基酸殘基取代，從而在第二個CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)生成腔，第一個CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)的凸起可置于該腔內(nèi)。優(yōu)選地所述具有較大側(cè)鏈體積的氨基酸殘基選自精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W) O優(yōu)選地所述具有較小側(cè)鏈體積的氨基酸殘基選自丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、纈氨酸(V)。在本發(fā)明的一個方面，通過引入半胱氨酸(C)作為每個CH3結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)位置的氨基酸來進(jìn)一步改變兩個CH3結(jié)構(gòu)域，使得兩個CH3結(jié)構(gòu)域之間能形成二硫橋。在一個實施方式中，雙特異性抗體包含“Knobs鏈”的CH3結(jié)構(gòu)域中的T366W突變和·“hole鏈”的CH3結(jié)構(gòu)域中的T336S、L368A、Y407V突變。也可使用CH3結(jié)構(gòu)域之間額外的鏈間二硫橋(Merchant, A. M 等人，Nature Biotech 16 (1998) 677-681),例如通過向 “knobs鏈”的CH3結(jié)構(gòu)域中引入Y349C突變，向“hole鏈”的CH3結(jié)構(gòu)域中引入E356C突變或S354C突變。在另一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體包含兩個CH3結(jié)構(gòu)域中的一個中的Y349C、T366W突變和兩個CH3結(jié)構(gòu)域中的另一個中的E356C、T366S、L368A、Y407V突變。在另一個優(yōu)選的實施方式中雙特異性抗體包含兩個CH3結(jié)構(gòu)域中的一個中的Y349C、T366W突變和兩個CH3結(jié)構(gòu)域中的另一個中的S354C、T366S、L368A、Y407V突變(一個CH3結(jié)構(gòu)域中額外的Y349C突變和另一個CH3結(jié)構(gòu)域中額外的E356C或S354C突變形成鏈間二硫橋)(編號均根據(jù)Kabat EU索引)。也可以備選地或額外地使用由如EP 1870459A1所述的其他knobs-in-holes技術(shù)。因此雙特異性抗體的另一個實例是“knobs鏈”的CH3結(jié)構(gòu)域中的R409D ；K370E突變和“hole鏈” CH3結(jié)構(gòu)域中的D399K ；E357K突變(編號均根據(jù)Kabat EU 索引)。在另一個實施方式中雙特異性抗體包含“knobs鏈”CH3結(jié)構(gòu)域中的T366W突變和“hole鏈” CH3結(jié)構(gòu)域中的T366S、L368A、Y407V突變，以及額外地“knobs鏈” CH3結(jié)構(gòu)域中的R409D ；K370E突變和“hole鏈” CH3結(jié)構(gòu)域中的D399K ；E357K突變。在另一個實施方式中雙特異性抗體包含兩個CH3結(jié)構(gòu)域中的一個中的Y349C、T366W突變和兩個CH3結(jié)構(gòu)域中的另一個中的S354C、T366S、L368A、Y407V突變，或者所述三價雙特異性抗體包含兩個CH3結(jié)構(gòu)域中的一個中的Y349C、T366W突變和兩個CH3結(jié)構(gòu)域中的另一個中的S354C、T366S、L368A、Y407V突變，以及額外地“knobs鏈” CH3結(jié)構(gòu)域中的R409D ；K370E突變和‘hole鏈” CH3結(jié)構(gòu)域中的D399K ；E357K突變。在一個實施方式中，第二個全長抗體(特異性結(jié)合第二個抗原)的重鏈和輕鏈的抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)是通過在以下位點引入二硫鍵，用二硫化物穩(wěn)定的i)重鏈可變結(jié)構(gòu)域第44位至輕鏈可變結(jié)構(gòu)域第100位，ii)重鏈可變結(jié)構(gòu)域第105位至輕鏈可變結(jié)構(gòu)域第43位，或iii)重鏈可變結(jié)構(gòu)域第101位至輕鏈可變結(jié)構(gòu)域第100位(編號均根據(jù)Kabat EU索引)。在一個實施方式中，第二個全長抗體(特異性結(jié)合第二個抗原)的重鏈和輕鏈的抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)是通過在以下位點引入二硫鍵，用二硫化物穩(wěn)定的重鏈可變結(jié)構(gòu)域第44位至輕鏈可變結(jié)構(gòu)域第100位。此類進(jìn)一步的二硫化物穩(wěn)定是通過在第二個全長抗體重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域VH和VL之間引入二硫鍵實現(xiàn)的。引入非天然二硫橋以穩(wěn)定單鏈Fv的技術(shù)在例如 WO 94/029350、Rajagopal，V.等人，Prot. Engin. 10(1997) 1453-59、Kobayashi，
H.等人，Nuclear Medicine&Biology,第 25 卷，(1998)387-393 或 Schmidt, Μ.等人，Oncogene (1999) 18，1711-1721中說明。在一個實施方式中第二個全長抗體重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域之間任選的二硫鍵位于重鏈可變結(jié)構(gòu)域第44位和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域第100位之間。在一個實施方式中可變結(jié)構(gòu)域之間任選的二硫鍵位于重鏈可變結(jié)構(gòu)域第105位和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域第43位之間(編號總是根據(jù)Kabat EU索引)。在一個實施方式中，優(yōu)選在第二個全長抗體重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域VH和VL之間有所述任選的二硫化物穩(wěn)定的根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體?！?br> 在一個實施方式中，優(yōu)選在第二個全長抗體重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域VH和VL之間沒有所述任選的二硫化物穩(wěn)定的根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體。根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體的兩部分都包含抗原結(jié)合位點(第一個全長抗體重鏈和輕鏈包含一個抗原結(jié)合位點，第二個全長抗體重鏈和輕鏈包含一個抗原結(jié)合位點)。如本文所用的術(shù)語“結(jié)合位點”或“抗原結(jié)合位點”指各自的抗原實際結(jié)合的根據(jù)本發(fā)明的所述雙特異性抗體的區(qū)域。第一個全長抗體重鏈和輕鏈或第二個全長抗體重鏈和輕鏈中的每個抗原結(jié)合位點是通過由抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)和抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)組成的對形成的。結(jié)合所需抗原(例如EGFR)的抗原結(jié)合位點可源自a)抗原的已知抗體(例如抗EGFR抗體)或b)使用尤其是抗原蛋白質(zhì)或核酸或其片段通過從頭(de novo)免疫方法，或者通過噬菌體展示獲得的新抗體或抗體片段。本發(fā)明的抗體的抗原結(jié)合位點含有六個互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，它們對結(jié)合位點對抗原的親和性有不同程度的貢獻(xiàn)。有三個重鏈可變結(jié)構(gòu)域⑶R(⑶RH1、⑶RH2和⑶RH3)和三個輕鏈可變結(jié)構(gòu)域⑶R0DRL1、⑶RL2和⑶RL3)。⑶R和框架區(qū)(FR)的范圍是通過與氨基酸序列的編制的數(shù)據(jù)庫比較確定的，其中根據(jù)序列中的變異性定義了這些區(qū)域。抗體特異性指抗體對抗原的特定表位的選擇性識別。例如天然抗體是單特異性的。如本文所用的術(shù)語“雙特異性”抗體指具有兩個或更多抗原結(jié)合位點，并且與兩個不同抗原或與相同抗原的兩個不同表位結(jié)合的抗體。根據(jù)本發(fā)明的“雙特異性抗體”是具有兩種不同抗原結(jié)合特異性的抗體。在一個實施方式中，本發(fā)明的抗體是對兩個不同抗原雙特異性的，即VEGF作為第一個抗原，ANG-2作為第二個抗原，或者例如EGFR作為第一個抗原，IGF-IR作為第二個抗原，或者反之亦然。如本文所用的術(shù)語“單特異性”抗體指具有一個或多個結(jié)合位點，每個結(jié)合位點結(jié)合相同抗原的相同表位的抗體。如本申請中所用的術(shù)語“價”指抗體分子中存在的結(jié)合位點的指定的數(shù)目。因此，術(shù)語“三價”、“四價”、“五價”和“六價”分別指抗體分子中存在三個結(jié)合位點、四個結(jié)合位點、五個結(jié)合位點和六個結(jié)合位點。例如天然抗體或根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體有兩個結(jié)合位點，是二價的。
如本文所用的術(shù)語“EGFR”指人表皮生長因子受體(又稱為HER-I或Erb-Bl，SEQ ID N0:13)，是c-erbB原癌基因編碼的170kDa跨膜受體，表現(xiàn)內(nèi)在的酪氨酸激酶活性(Modjtahedi，H.等 A, Br. J. Cancer 73 (1996) 228-235 ;Herbst，R. S.，和 Shin，
D.Μ.，Cancer 94(2002) 1593-1611)。SwissProt 數(shù)據(jù)庫條目 P00533 提供 EGFR 的序列。也存在EGFR的同工型和變體(例如可變RNA轉(zhuǎn)錄物、截斷型、多態(tài)性等)，包括但不限于由 Swissprot 數(shù)據(jù)庫條目 P00533-1、P00533-2、P00533-3 和 P00533-4 鑒定的那些。已知EGFR結(jié)合配體，包括α)，表皮生長因子(EGF)、轉(zhuǎn)化生長因子-a (TGf-雙調(diào)蛋白、肝素結(jié)合EGF(hb-EGF)、β動物纖維素和表皮調(diào)節(jié)素(epiregulin) (Herbst,R. S.，和 Shin，D. Μ.，Cancer 94(2002) 1593-1611 ；Mendelsohn, J.，和 Baselga，J.，Oncogene 19(2000)6550-6565)。EGFR通過酪氨酸激酶介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控多個細(xì)胞過程，包括但不限于活化控制細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞存活、細(xì)胞凋亡、血管生成、有絲分 裂發(fā)生，和轉(zhuǎn)移的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(Atalay, G.等人，Ann. Oncology 14(2003) 1346-1363 ；Tsao, A. S.,和 Herbst, R. S. , Signal 4(2003)4-9 ；Herbst, R. S.,和 Shin, D. M. , Cancer94(2002) 1593-1611 ；Modjtahedi, H.等人，Br. J. Cancer 73(1996)228-235)。
如本文所用的術(shù)語“IGF-1R”指人類胰島素生長因子I受體(IGF-IR，CD 221抗原；SEQ ID NO :14),屬于跨膜蛋白酪氨酸激酶家族(LeRoith, D.等人，Endocrin.Rev. 16 (1995) 143-163 和 Adams, T. E.等人，Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000) 1050-1063)。SwissProt數(shù)據(jù)庫條目P08069提供IGF-IR的序列。IGF-IR以高親和性結(jié)合IGF-I并起始對此配體的體內(nèi)生理應(yīng)答。IGF-IR也結(jié)合IGF-II，然而親和性略低。IGF-IR過表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞的腫瘤性轉(zhuǎn)化，并且有證據(jù)表明IGF-IR參與細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化并因此是開發(fā)治療癌癥的治療劑的有用的靶(Adams, T. E.等人，Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000) 1050-1063)。在本發(fā)明的優(yōu)選的方面，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體特異性地結(jié)合人IGF-IR和人EGFR(即根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體是雙特異性抗IGF-IR/抗EGFR抗體)。雙特異性抗體基于人 <IGF-1R>HUMAB Clone 18 (DSMACC 2587 ；W0 2005/005635，簡稱為<IGF-lR>Clonel8 或 <IGF_1R>AK18)和人源化的 <EGFR>ICR62 (W0 2006/082515,簡稱為<EGFR>ICR62)的抗原結(jié)合位點。這些雙特異性二價抗體的相關(guān)輕鏈和重鏈氨基酸序列在SEQ ID NO USEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3 (對于 0A-Akl8-scFab_GA201)中；在SEQ ID NO:5、SEQ ID NO :6、SEQ IDNO :7(對于 0A-GA201-scFab_Akl8)中；在 SEQ ID NO :1、SEQ IDN0:2、SEQ ID NO :4(對于 0A-Akl8-scFab-GA201_WT)和在 SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQID NO 8(0A-GA201-scFab-Akl8_WT)中給出。根據(jù)本發(fā)明的雙特異性〈EGFR-IGF-1R〉抗體表現(xiàn)出對需要EGFR和IGF-IR靶向治療的人類患者的益處。根據(jù)本發(fā)明的抗體具有極有價值的性質(zhì)，導(dǎo)致對罹患此類疾病，特別是罹患癌癥的患者的益處。與單特異性親本〈IGF-1R〉抗體相比，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性〈EGFR-IGF-1R〉抗體表現(xiàn)出例如IGF-IR受體的內(nèi)在化降低。此外，它們表現(xiàn)出對兩個抗原EGFR和IGF-IR都表達(dá)的腫瘤細(xì)胞的良好靶向，這表明對罹患兩個抗原EGFR和IGF-IR都表達(dá)的癌癥的患者在效力/毒性比方面的益處。因此在本發(fā)明的一方面，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體具有以下特征a)第一個全長抗體特異性地結(jié)合IGF-IR并包含具有SEQ ID NO : I的氨基酸序列的重鏈和具有SEQ ID NO 2的氨基酸序列的輕鏈，并且
b)第二個全長抗體特異性地結(jié)合EGFR并包含通過肽接頭與輕鏈連接的重鏈，其中所述連接的重鏈和輕鏈具有SEQ ID NO 3的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一方面，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體具有以下特征a)第一個全長抗體特異性地結(jié)合IGF-IR并包含具有SEQ ID NO : I的氨基酸序列的重鏈和具有SEQ ID NO 2的氨基酸序列的輕鏈，并且b)第二個全長抗體特異性地結(jié)合EGFR并包含通過肽接頭與輕鏈連接的重鏈，其中所述連接的重鏈和輕鏈具有SEQ ID NO 4的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一方面，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體具有以下特征a)第一個全長抗體特異性地結(jié)合EGFR并包含具有SEQ ID NO :5的氨基酸序列的重鏈和具有SEQ ID NO 6的氨基酸序列的輕鏈，并且
·
b)第二個全長抗體特異性地結(jié)合IGF-IR并包含通過肽接頭與輕鏈連接的重鏈，其中所述連接的重鏈和輕鏈具有SEQ ID NO 7的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一方面，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體具有以下特征a)第一個全長抗體特異性地結(jié)合EGFR并包含具有SEQ ID NO :5的氨基酸序列的重鏈和具有SEQ ID NO 6的氨基酸序列的輕鏈，并且b)第二個全長抗體特異性地結(jié)合IGF-IR并包含通過肽接頭與輕鏈連接的重鏈，其中所述連接的重鏈和輕鏈具有SEQ ID NO 8的氨基酸序列。因此在本發(fā)明的一個實施方式中雙特異性抗體是抗IGF-IR/抗EGFR抗體，并且其特征在于包含SEQ ID No :1、SEQ ID No 2和SEQ ID No :3. 22的氨基酸序列。因此本發(fā)明的一個方面是特異性結(jié)合人IGF-IR和人EGFR的雙特異性抗體，其特征在于包含SEQ IDNo USEQ ID No 2 和 SEQ ID No 3 的氨基酸序列。因此在本發(fā)明的一個實施方式中雙特異性抗體是抗IGF-IR/抗EGFR抗體，并且其特征在于包含SEQ ID No :1、SEQ ID No 2和SEQ ID No 4的氨基酸序列。因此本發(fā)明的一個方面是特異性結(jié)合人IGF-IR和人EGFR的雙特異性抗體，其特征在于包含SEQ ID No:
I、SEQ ID No 2和SEQ IDNo 4的氨基酸序列。因此在本發(fā)明的一個實施方式中雙特異性抗體是抗IGF-IR/抗EGFR抗體，并且其特征在于包含SEQ ID No :5、SEQ ID No 6和SEQ ID No 7的氨基酸序列。因此本發(fā)明的一個方面是特異性結(jié)合人IGF-IR和人EGFR的雙特異性抗體，其特征在于包含SEQ ID No:5、SEQ ID No 6和SEQ IDNo 7的氨基酸序列。因此在本發(fā)明的一個實施方式中雙特異性抗體是抗IGF-IR/抗EGFR抗體，并且其特征在于包含SEQ ID No :5、SEQ ID No 6和SEQ ID No 8的氨基酸序列。因此本發(fā)明的一個方面是特異性結(jié)合人IGF-IR和人EGFR的雙特異性抗體，其特征在于包含SEQ ID No:
5、SEQ ID No 6和SEQ IDNo 8的氨基酸序列。在本發(fā)明的一個實施方式中，雙特異性抗體是抗IGF-IR/抗EGFR抗體，并且其特征在于a)包含 SEQ ID NO USEQ ID NO 2 和 SEQ ID NO 3 的氨基酸序列。b)包含 SEQ ID NO USEQ ID NO 2 和 SEQ ID NO 4 的氨基酸序列。c)包含 SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6 和 SEQ ID NO 7 的氨基酸序列，或者d)包含 SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6 和 SEQ ID NO 8 的氨基酸序列。
在本發(fā)明的一個實施方式中所述雙特異性抗體抗IGF-IR/抗EGFR抗體的特征在于具有以下一項或多項性質(zhì)(用如實施例4和實施例5所述的測定確定的)-在H322M腫瘤細(xì)胞上，抗IGF-IR/抗EGFR抗體抑制IGF-IR的磷酸化，IC50為5nM或更少(優(yōu)選地2nM或更少);-在H322M腫瘤細(xì)胞上，雙特異性抗IGF-IR/抗EGFR抗體抑制EGFR的磷酸化，IC50為5nM或更少(優(yōu)選地2nM或更少)；-與抗IGF-IR 抗體 <IGF-1R>HUMAB Clone 18 (DSM ACC2587)相比，雙特異性抗IGF-IR/抗EGFR抗體減少IGF-IR的下調(diào)50%或更多。在本發(fā)明的另一方面，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體具有以下特征a)第一個全長抗體特異性地結(jié)合EGFR并包含具有SEQ ID NO :5的氨基酸序列的 重鏈和具有SEQ ID NO 6的氨基酸序列的輕鏈，并且b)第二個全長抗體特異性地結(jié)合IGF-IR并包含通過肽接頭與輕鏈連接的重鏈，其中所述連接的重鏈和輕鏈具有SEQ ID NO 7的氨基酸序列，且CDR內(nèi)不多于I個氨基酸殘基替換，并且其中較之SEQ ID No 7的未突變的氨基酸序列的結(jié)合親和性的KD值，結(jié)合親和性的KD值相等或減小少于4倍。在本發(fā)明的另一方面，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體具有以下特征a)第一個全長抗體特異性地結(jié)合EGFR并包含具有SEQ ID NO :5的氨基酸序列的重鏈和具有SEQ ID NO 6的氨基酸序列的輕鏈，并且b)第二個全長抗體特異性地結(jié)合IGF-IR并包含通過肽接頭與輕鏈連接的重鏈，其中所述連接的重鏈和輕鏈具有SEQ ID NO 8的氨基酸序列，且CDR內(nèi)不多于I個氨基酸殘基替換，并且其中較之SEQ ID No 8的未突變的氨基酸序列的結(jié)合親和性的KD值，結(jié)合親和性的KD值相等或減小少于4倍。在本發(fā)明的另一方面，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體具有以下特征a)第一個全長抗體特異性地結(jié)合EGFR并包含具有SEQ ID NO :5的氨基酸序列的重鏈和具有SEQ ID NO 6的氨基酸序列的輕鏈，并且b)第二個全長抗體特異性地結(jié)合IGF-IR并包含通過肽接頭與輕鏈連接的重鏈，其中所述連接的重鏈和輕鏈具有SEQ ID NO 7的氨基酸序列，且⑶R3H內(nèi)不多于I個氨基酸殘基替換，并且其中較之SEQ ID No 7的未突變的氨基酸序列的結(jié)合親和性的KD值，結(jié)合親和性的KD值相等或減小少于4倍。在本發(fā)明的另一方面，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體具有以下特征a)第一個全長抗體特異性地結(jié)合EGFR并包含具有SEQ ID NO :5的氨基酸序列的重鏈和具有SEQ ID NO 6的氨基酸序列的輕鏈，并且b)第二個全長抗體特異性地結(jié)合IGF-IR并包含通過肽接頭與輕鏈連接的重鏈，其中所述連接的重鏈和輕鏈具有SEQ ID NO 8的氨基酸序列，且⑶R3H內(nèi)不多于I個氨基酸殘基替換，并且其中較之SEQ ID No 8的未突變的氨基酸序列的結(jié)合親和性的KD值，結(jié)合親和性的KD值相等或減小少于4倍。在本發(fā)明的另一方面，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體具有以下特征a)第一個全長抗體特異性地結(jié)合EGFR并包含具有SEQ ID NO :5的氨基酸序列的重鏈和具有SEQ ID NO 6的氨基酸序列的輕鏈，并且
b)第二個全長抗體特 異性地結(jié)合IGF-IR并包含通過肽接頭與輕鏈連接的重鏈，其中所述連接的重鏈和輕鏈具有SEQ ID NO 7的氨基酸序列，且CDR內(nèi)不多于I個氨基酸殘基替換，并且其中較之SEQ ID No 7的未突變的氨基酸序列的結(jié)合親和性的KD值，結(jié)合親和性的KD值相等或減小少于4倍；并具有一項或多項以下性質(zhì)(用如實施例4和實施例5所述的測定確定)-在H322M腫瘤細(xì)胞上抗IGF-IR/抗EGFR抗體抑制IGF-IR的磷酸化，IC50為5nM或更少(優(yōu)選地2nM或更少)-在H322M腫瘤細(xì)胞上抗IGF-IR/抗EGFR抗體抑制EGFR的磷酸化，IC50為5nM或更少(優(yōu)選地2nM或更少)-與抗IGF-IR 抗體 <IGF-1R>HUMAB Clone 18 (DSM ACC2587)相比，雙特異性抗IGF-IR/抗EGFR抗體減少IGF-IR的下調(diào)50%或更多。在本發(fā)明的另一方面，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體具有以下特征a)第一個全長抗體特異性地結(jié)合EGFR并包含具有SEQ ID NO :5的氨基酸序列的重鏈和具有SEQ ID NO 6的氨基酸序列的輕鏈，并且b)第二個全長抗體特異性地結(jié)合IGF-IR并包含通過肽接頭與輕鏈連接的重鏈，其中所述連接的重鏈和輕鏈具有SEQ ID NO 8的氨基酸序列，且CDR內(nèi)不多于I個氨基酸殘基替換，并且其中較之SEQ ID No 8的未突變的氨基酸序列的結(jié)合親和性的KD值，結(jié)合親和性的KD值相等或減小少于4倍；并具有一項或多項以下性質(zhì)(用如實施例4和實施例5所述的測定確定)-在H322M腫瘤細(xì)胞上抗IGF-IR/抗EGFR抗體抑制IGF-IR的磷酸化，IC50為5nM或更少(優(yōu)選地2nM或更少)-在H322M腫瘤細(xì)胞上抗IGF-IR/抗EGFR抗體抑制EGFR的磷酸化，IC50為5nM或更少(優(yōu)選地2nM或更少)-與抗IGF-IR 抗體 <IGF-1R>HUMAB Clone 18 (DSM ACC2587)相比，雙特異性抗IGF-IR/抗EGFR抗體減少IGF-IR的下調(diào)50%或更多。在本發(fā)明的另一方面，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體具有以下特征a)第一個全長抗體特異性地結(jié)合EGFR并包含具有SEQ ID NO :5的氨基酸序列的重鏈和具有SEQ ID NO 6的氨基酸序列的輕鏈，并且b)第二個全長抗體特異性地結(jié)合IGF-IR并包含通過肽接頭與輕鏈連接的重鏈，其中所述連接的重鏈和輕鏈具有SEQ ID NO 7的氨基酸序列，且⑶R3H內(nèi)不多于I個氨基酸殘基替換，并且其中較之SEQ ID No 7的未突變的氨基酸序列的結(jié)合親和性的KD值，結(jié)合親和性的KD值相等或減小少于4倍；并具有一項或多項以下性質(zhì)(用如實施例4和實施例5所述的測定確定)-在H322M腫瘤細(xì)胞上抗IGF-IR/抗EGFR抗體抑制IGF-IR的磷酸化，IC50為5nM或更少(優(yōu)選地2nM或更少)-在H322M腫瘤細(xì)胞上抗IGF-IR/抗EGFR抗體抑制EGFR的磷酸化，IC50為5nM或更少(優(yōu)選地2nM或更少)-與抗IGF-IR 抗體 <IGF-1R>HUMAB Clone 18 (DSM ACC2587)相比，雙特異性抗IGF-IR/抗EGFR抗體減少IGF-IR的下調(diào)50%或更多。
在本發(fā)明的另一方面，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體具有以下特征a)第一個全長抗體特異性地結(jié)合EGFR并包含具有SEQ ID NO :5的氨基酸序列的重鏈和具有SEQ ID NO 6的氨基酸序列的輕鏈，并且b)第二個全長抗體特異性地結(jié)合IGF-IR并包含通過肽接頭與輕鏈連接的重鏈，其中所述連接的重鏈和輕鏈具有SEQ ID NO 8的氨基酸序列，且⑶R3H內(nèi)不多于I個氨基酸殘基替換，并且其中較之SEQ ID No 8的未突變的氨基酸序列的結(jié)合親和性的KD值，結(jié)合親和性的KD值相等或減小少于4倍；并具有一項或多項以下性質(zhì)(用如實施例4和實施例5所述的測定確定)-在H322M腫瘤細(xì)胞上抗IGF-IR/抗EGFR抗體抑制IGF-IR的磷酸化，IC50為5nM或更少(優(yōu)選地2nM或更少)·-在H322M腫瘤細(xì)胞上抗IGF-IR/抗EGFR抗體抑制EGFR的磷酸化，IC50為5nM或更少(優(yōu)選地2nM或更少)-與抗IGF-IR 抗體 <IGF-1R>HUMAB Clone 18 (DSM ACC2587)相比，雙特異性抗IGF-IR/抗EGFR抗體減少IGF-IR的下調(diào)50%或更多。例如在EP10166860. 6 中描述了 SEQ ID No 7 或 SEQ ID No 8 的 CDR3H 中的氨基
酸殘基替換的實例，其中較之未突變的氨基酸序列的結(jié)合親和性KD值，結(jié)合親和性KD值相等或降低少于4倍。如本文所用的術(shù)語“VEGF”指人血管內(nèi)皮生長因子(VEGF/VEGF-A) (SEQ ID No:15),在例如 Leung, D. W.等人，Science 246 (1989) 1306-9 ；Keck, P. J.等人，Science246 (1989) 1309-12 和 Connolly, D. T.等人，J. Biol. Chem. 264 (1989) 20017-24 中描述。VEGF參與正?；虍惓Ｑ苌梢约芭c腫瘤和眼內(nèi)疾病相關(guān)新血管化(Ferrara，N.等人，Endocr. Rev. 18 (1997) 4-25 ；Berkman, R. A.等人，J. Clin. Invest. 91 (1993) 153-159 ；Brown, L. F.等人，Human Pathol. 26 (1995) 86-91 ；Brown, L. F.等人，CancerRes. 53 (1993) 4727-4735 ；Mattern, J.等人，Brit. J. Cancer. 73 (1996) 931-934 和 Dvorak,H.等人，Am. J. Pathol. 146(1995) 1029-1039)。VEGF是同源二聚體糖蛋白，已從多種來源分離出。VEGF顯示對內(nèi)皮細(xì)胞的高度特異性有絲分裂活性。如本文所用的術(shù)語“ANG-2”指人血管生成素_2 (ANG-2)(備選地簡寫為ANGPT2或 ANG2) (SEQ ID No: 16)，在 Maisonpierre，P. C.等人，Science 277 (1997) 55-60 和Cheung, A. H.,等人，Genomics 48 (1998) 389-91中說明。發(fā)現(xiàn)血管生成素-I和血管生成素-2和ANG-2是Ties的配體，Ties是選擇性表達(dá)于血管內(nèi)皮內(nèi)的酪氨酸激酶家族。Yancopoulos, G. D.等人，Nature 407(2000)242-48。血管生成素家族目前有四個確定的成員。血管生成素-3和血管生成素-4(Ang-3和Ang-4)可代表小鼠和人中相同基因座位的有巨大差異的對應(yīng)物。Kim, I.，等人，F(xiàn)EBS Let, 443 (1999) 353-56 ；Kim, I.，等人，J BiolChem 274(1999)26523-28。ANG-I和ANG-2最初在組織培養(yǎng)實驗中分別被鑒定為激動劑和拮抗劑(關(guān)于ANG-I參見Davis，S.等人，Cell 87 (1996) 1161-69 ;關(guān)于ANG-2參見Maisonpierre, P. C.等人，Science 277(1997)55-60)。全部已知的血管生成素主要結(jié)合Tie2,并且 Ang-I 和 Ang-2 都以 3nM(Kd)的親和性結(jié)合 Tie2。Maisonpierre, P. C.等人，Science 277(1997)55-60。在優(yōu)選的實施方式中根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體特異性地結(jié)合人VEGF和人ASNG-2(即根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體是雙特異性抗VEGF/抗ANG-2抗體)。雙特異性抗體優(yōu)選地基于抗VEGF抗體貝伐珠單抗(bevac i zumab)和ANG2 i-LC06 (在W02010/040508 (PCT申請?zhí)朠CT/EP2009/007182)中說明，是通過噬菌體展示獲得的)的抗原結(jié)合位點。這些雙特異性二價抗體的相關(guān)輕鏈和重鏈氨基酸序列在SEQ ID NO:9、SEQ ID NO 10, SEQ ID NO:11(對于 Ang2-VEGF0A-Ava-N-scFabLC06SS)中、并且在 SEQ ID NO :9、SEQ ID NO : 10、SEQID NO :12(對于 Ang2-VEGF 0A-Ava-N_scFabLC06)中給出。因此在本發(fā)明的一方面，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體具有以下特征a)第一個全長抗體特異性地結(jié)合VEGF并包含具有SEQ ID NO 9的氨基酸序列的重鏈和具有SEQ ID NO 10的氨基酸序列的輕鏈，并且b)第二個全長抗體特異性地結(jié)合ANG-2并包含通過肽接頭與輕鏈連接的重鏈，其中所述連接的重鏈和輕鏈具有SEQ ID NO :11的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一方面，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體具有以下特征·a)第一個全長抗體特異性地結(jié)合VEGF并包含具有SEQ ID NO 9的氨基酸序列的重鏈和具有SEQ ID NO 10的氨基酸序列的輕鏈，并且b)第二個全長抗體特異性地結(jié)合ANG-2并包含通過肽接頭與輕鏈連接的重鏈，其中所述連接的重鏈和輕鏈具有SEQ ID NO 12的氨基酸序列。因此在本發(fā)明的一個實施方式中雙特異性抗體是抗VEGF/抗ANG-2抗體，其特征在于包含SEQ ID No :9、SEQ ID No 10和SEQ ID No 11的氨基酸序列。因此在本發(fā)明的一個實施方式中雙特異性抗體是抗VEGF/抗ANG-2抗體，其特征在于包含SEQ ID No :9、SEQ ID No 10和SEQ ID No 12的氨基酸序列。本發(fā)明的全長序列抗體包含一種或多種免疫球蛋白類的免疫球蛋白恒定區(qū)。免疫球蛋白類包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE同種型，以及在IgG和IgA的情況下，其亞型。在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的全長抗體具有IgG型抗體的恒定結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)。如本文所用的術(shù)語“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”指具有單種氨基酸組分的抗體分子制劑。術(shù)語“嵌合抗體”指包含來自一個來源或物種的可變區(qū)(即結(jié)合區(qū))，以及源自不同來源或物種的至少部分恒定區(qū)，通常用重組DNA技術(shù)制備。優(yōu)選包含鼠可變區(qū)和人恒定區(qū)的嵌合抗體。本發(fā)明涵蓋的“嵌合抗體”的其他優(yōu)選形式是其中從原抗體的恒定區(qū)修飾或改變恒定區(qū)以生成根據(jù)本發(fā)明的性質(zhì)，特別是關(guān)于Clq結(jié)合和/或Fe受體(FcR)結(jié)合的性質(zhì)的形式。此類嵌合抗體也稱為“類轉(zhuǎn)換抗體”。嵌合抗體是包含編碼免疫球蛋白可變區(qū)的DNA片段和編碼免疫球蛋白恒定區(qū)的DNA片段的免疫球蛋白基因的表達(dá)的產(chǎn)物。生產(chǎn)嵌合抗體的方法涉及本領(lǐng)域熟知的常規(guī)重組DNA和基因轉(zhuǎn)染技術(shù)。參見例如Morrison，S. L.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855 ；US 5，202，238 和 US 5，204，244。術(shù)語“人源化抗體”指其中框架或“互補(bǔ)決定區(qū)”(OTR)被修飾，以包含較之親本免疫球蛋白具有不同特異性的免疫球蛋白的CDR的抗體。在優(yōu)選的實施方式中，鼠CDR被移植到人抗體的框架區(qū)以制備“人源化抗體”。參見例如Riechmann, L.等人，Nature332(1988)323-327 和 Neuberger，Μ· S.等人，Nature 314(1985)268-270。特別優(yōu)選的 CDR對應(yīng)于代表用于嵌合抗體識別上述抗原的序列的那些CDR。本發(fā)明涵蓋的“人源化抗體”的其他形式是其中從原抗體的恒定區(qū)額外地修飾或改變恒定區(qū)，以生成根據(jù)本發(fā)明的性質(zhì)，特別是關(guān)于Clq結(jié)合和/或Fe受體(FcR)結(jié)合的性質(zhì)的形式。如本文所用的術(shù)語“人抗體”旨在包括具有源自人生殖系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體?，F(xiàn)有技術(shù)中熟知人抗體(van Dijk, Μ. A.,和van de ffinkel,J. G.，Curr.Opin. Chem. Biol. 5(2001)368-374)。人抗體也可以在能在免疫時生產(chǎn)人抗體的全部組成成分或所選擇的人抗體，而不生產(chǎn)內(nèi)源免疫球蛋白的轉(zhuǎn)基因動物(例如小鼠)中產(chǎn)生。將人生殖系免疫球蛋白基因陣列轉(zhuǎn)移到此類生殖系突變的小鼠中會導(dǎo)致在抗原攻擊時產(chǎn)生人抗體(參見例如Jakobovits, A.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA90(1993)2551-2555 Jakobovits, A.等人，Nature 362(1993)255-258 ；Bruggemann, Μ.等人，Year Immunol. 7 (1993) 33-40)。人抗體也可在卩遼菌體展示文庫中生產(chǎn)(Hoogenboom,H. R.,和 Winter，G.，J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388 ;Marks，J.D·等人，J. Mol.Biol. 222(1991)581-597)。Cole等人和Boerner等人的技術(shù)也可用于制備人單克隆抗體(Cole 等人,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R.Liss,第 77 頁(1985)；和Boerner, P.等人，J. Immunol. 147 (1991)86-95)。如在根據(jù)本發(fā)明的嵌合抗體和人源化抗體中所提到的，如本文所用的“人抗體”也包含在恒定區(qū)內(nèi)被修飾以生成根據(jù)本發(fā)明的性·質(zhì)，特別是關(guān)于Clq結(jié)合和/或FcR結(jié)合的性質(zhì)的此類抗體，例如通過“類轉(zhuǎn)換”即改變或突變Fe部分(例如從IgGl到IgG4和/或IgGl/IgG4突變)。如本文所用的術(shù)語“重組人抗體”旨在包括用重組手段制備、表達(dá)、創(chuàng)造或分離的全部人抗體，例如從宿主細(xì)胞(例如NSO或CHO細(xì)胞)或從人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因動物(例如小鼠)分離的抗體，或者用轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中的重組表達(dá)載體表達(dá)的抗體。此類重組人抗體具有重排形式的可變區(qū)和恒定區(qū)。根據(jù)本發(fā)明的重組人抗體已經(jīng)接受體內(nèi)體細(xì)胞超突變。因此，重組抗體的VH和VL區(qū)的氨基酸序列是這樣的序列，所述序列源自并與人生殖系VH和VL序列相關(guān)，可能不天然存在于體內(nèi)人抗體生殖系所有組成成分內(nèi)。如本文所用的“可變結(jié)構(gòu)域”(輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)、重鏈可變區(qū)(VH))指每對直接參與抗體與抗原結(jié)合的輕鏈和重鏈對。人輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域具有相同的一般形式，每個結(jié)構(gòu)域包含四個序列廣泛保守的框架(FR)區(qū)，由三個“高變區(qū)”(或互補(bǔ)決定區(qū)，CDR)連接。框架區(qū)采取β折疊構(gòu)象，并且⑶R可形成連接β折疊結(jié)構(gòu)的環(huán)。每條鏈中的⑶R被框架區(qū)維持其三維結(jié)構(gòu)并與來自其他鏈的CDR共同形成抗原結(jié)合位點?？贵w重鏈和輕鏈CDR3區(qū)在根據(jù)本發(fā)明的抗體的結(jié)合特異性/親和性中起到特別重要的作用，因此提供本發(fā)明的另一個對象。術(shù)語“高變區(qū)”或“抗體的抗原結(jié)合部分”用于本文時指抗體的負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。高變區(qū)包含來自“互補(bǔ)決定區(qū)”或“⑶R”的氨基酸殘基?！翱蚣堋被颉癋R”區(qū)是除了此處限定的高變區(qū)殘基之外的那些可變結(jié)構(gòu)域區(qū)。因此，抗體的輕鏈和重鏈從N端到C端包含結(jié)構(gòu)域FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。每條鏈上的CDR被此類框架氨基酸分隔開。特別地，重鏈的⑶R3是對抗原結(jié)合最重要的區(qū)域。根據(jù)Kabat等人,Sequencesof Proteins of Immunological Interest,第 5 版，Public Health Service, NationalInstitutes of Health, Bethesda, MD (1991)的標(biāo)準(zhǔn)定義確定 CDR 和 FR 區(qū)。 如本文所用，術(shù)語“結(jié)合”或“其特異性地結(jié)合”或“特異性地結(jié)合”指在用純化的野生型抗原進(jìn)行的體外測定中，優(yōu)選地在表面等離子體共振測定(BIAcore,GE-HealthcareUppsala，瑞典)中，抗體結(jié)合抗原的表位。結(jié)合的親和性用術(shù)語ka(抗體從抗體/抗原復(fù)合物締合的速率常數(shù))、kD(解離常數(shù))和KD(kD/ka)定義。在一個實施方式中結(jié)合或特異性結(jié)合指10_8mol/l或更低，優(yōu)選地10_9M至10_13mol/l的結(jié)合親和性(Kd)。因此，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體優(yōu)選地以10_8mol/l或更低，優(yōu)選地10_9至10_13mol/l的結(jié)合親和性(KD)特異性結(jié)合對其特異的每個抗原?？贵w與Fe Y RIII 的結(jié)合可以用 BIAcore 測定(GE-healthcare Uppsala,瑞典)研究。結(jié)合的親和性用術(shù)語ka (抗體從抗體/抗原復(fù)合物締合的速率常數(shù))、kD (解離常數(shù))和 KD(kD/ka)定義。術(shù)語“表位”包括任何能特異性結(jié)合抗體的多肽決定簇。在一些實施方式中，表位決定簇包括分子的化學(xué)活性表面的定組(例如氨基酸、糖側(cè)鏈、磷?；蚧酋；?，在一些實施方式中，可具有特異性三維結(jié)構(gòu)特征，和/或特異性電荷特征。表位是被抗體結(jié)合的抗原的區(qū)域。 在一些實施方式中，當(dāng)抗體在蛋白質(zhì)和/或大分子的復(fù)雜混合物中優(yōu)先識別其靶抗原時，抗體被稱為特異性結(jié)合抗原。如本申請中所用的術(shù)語“恒定區(qū)”指除了可變區(qū)外的抗體的結(jié)構(gòu)域的總和。恒定區(qū)不直接涉及抗原結(jié)合，但表現(xiàn)出多種效應(yīng)子功能。取決于其重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，抗體被分為以下類IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且其中一些類被進(jìn)一步分為亞類，例如IgGl、IgG2、IgG3和IgG4、IgAl和IgA2。對應(yīng)于不同類的抗體的重鏈恒定區(qū)分別被稱為α、δ、ε、Y和μ。全部5種抗體類中都存在的輕鏈恒定區(qū)(CL)稱為κ (kappa)和λ (lambda)。如本申請所用的術(shù)語“源自人的恒定區(qū)”指亞類IgGl、IgG2、IgG3或IgG4的人抗體的恒定重鏈區(qū)和/或恒定輕鏈κ或λ區(qū)。現(xiàn)有技術(shù)熟知此類恒定區(qū)，并被例如Kabat，
E.A.說明(參見例如 Johnson，G.和 Wu，Τ· Τ·，Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218 ;Kabat, E. A.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72(1975)2785-2788)。術(shù)語“補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(⑶C) ”指由補(bǔ)體因子Clq與大多數(shù)IgG抗體亞類的Fe部分的結(jié)合起始的過程。Clq與抗體的結(jié)合是由在所謂結(jié)合位點的限定的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用引起的?，F(xiàn)有技術(shù)熟知此類Fe部分結(jié)合位點(見上文)。此類Fe部分結(jié)合位點由例如氨基酸 L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331 和 P329 表征(編號根據(jù)Kabat EU索引)。IgGU IgG2和IgG3亞類的抗體通常表現(xiàn)補(bǔ)體活化，包括Clq和C3結(jié)合，而IgG4不活化補(bǔ)體系統(tǒng),并且不結(jié)合Clq和/或C3。IgG4亞類的抗體表現(xiàn)減弱的Fe受體(Fe Y RIIIa)結(jié)合，其他IgG亞類的抗體表現(xiàn)強(qiáng)結(jié)合。然而如果 Pro238、Asp265、Asp270、Asn297(Fc 糖缺失)、Pro329、Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434 和 His435 殘基被改變，也提供減弱的 Fe 受體結(jié)合(Shields, R. L.等人，J. Biol. Chem. 276(2001)6591-6604 ；Lund,J.等人，F(xiàn)ASEB J. 9(1995) 115-119 ；Morgan, A.等人，Immunology 86 (1995) 319-324 ;EP0307434)。在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的抗體與IgGl抗體相比，具有減弱的FcR結(jié)合，并且關(guān)于FcR結(jié)合，全長親本抗體屬于IgG4亞類，或?qū)儆贗gGl或IgG2亞類，在S228、L234、L235和/或D265具有突變，和/或含有PVA236突變。在一個實施方式中，全長親本抗體中的突變是S228P、L234A、L235A、L235E和/或PVA236。在另一個實施方式中全長親本抗體中的突變是 IgG4 中 S228P 和 L235E, IgGl 中 L234A 和 L235A。
在其他實施方式中根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體的特征在于所述全長抗體屬于人IgGl亞類。術(shù)語“抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC) ”指在效應(yīng)子細(xì)胞存在下，根據(jù)本發(fā)明的抗體裂解人靶細(xì)胞。優(yōu)選地通過在效應(yīng)子細(xì)胞(例如新鮮分離的PBMC或從血沉棕黃層純化的效應(yīng)子細(xì)胞例如單核細(xì)胞或天然殺傷(NK)細(xì)胞，或者永久生長的NK細(xì)胞系)存在下，用根據(jù)本發(fā)明的抗體處理表達(dá)EGFR和IGF-IR的細(xì)胞的制備物來測量ADCC。術(shù)語“補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(⑶C) ”指由補(bǔ)體因子Clq與大多數(shù)IgG抗體亞類的Fe部分的結(jié)合起始的過程。Clq與抗體的結(jié)合是由在所謂結(jié)合位點的限定的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用引起的?，F(xiàn)有技術(shù)熟知此類Fe部分結(jié)合位點(見上文)。此類Fe部分結(jié)合位點由例如氨基酸 L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331 和 P329 表征(編號根據(jù)Kabat EU索引)。IgGl、IgG2和IgG3亞類的抗體通常顯示補(bǔ)體活化，包括Clq和C3結(jié)合，而IgG4不活化補(bǔ)體系統(tǒng)，不結(jié)合Clq和/或C3?？贵w的恒定區(qū)直接參與ADCC(抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性)和CDC(補(bǔ) 體依賴性細(xì)胞毒性)。補(bǔ)體活化(CDC)是由補(bǔ)體因子Clq與大多數(shù)IgG抗體亞類的恒定區(qū)的結(jié)合起始的。CI q與抗體的結(jié)合是由在所謂結(jié)合位點的限定的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用引起的。現(xiàn)有技術(shù)熟知此類恒定區(qū)結(jié)合位點，被例如Lukas，T. J.等人，J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560 ;Brunhouse，R.，和 Cebra，J. J.，Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917 ；Burton, D. R.等人，Nature 288(1980)338-344 ；Thommesen, J. E.等人，Mol. Immunol. 37 (2000)995-1004 ;Idusogie, Ε· E.等人，J. Immunol. 164(2000)4178-4184 ；Hezareh, M.等人，J. Virol. 75(2001) 12161-12168 ；Morgan, A.等人，Immunology 86 (1995) 319-324 和 EP 0307434 說明。此類恒定區(qū)結(jié)合位點由例如氨基酸 L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331 和 P329 表征(編號根據(jù)Kabat EU 索引)。在一個實施方式中根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體包含IgGl或IgG3亞類(優(yōu)選地IgGl亞類的)的恒定區(qū)，該恒定區(qū)優(yōu)選地源自人。在一個實施方式中根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體包含IgGl或IgG3亞類(優(yōu)選地IgGl亞類的)的Fe部分，該恒定區(qū)優(yōu)選地源自人?？梢酝ㄟ^改造抗體的寡糖成分來增強(qiáng)單克隆抗體的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)，如 Umana, P.等人，Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180 和 US 6，602，684中說明。最常用的治療抗體，IgGl類抗體是在每個CH2結(jié)構(gòu)域的Asn297處具有保守N-連接的糖基化位點的糖蛋白。聯(lián)結(jié)于Asn297的兩個復(fù)雜雙觸角寡糖被包埋于CH2結(jié)構(gòu)域之間，與多肽骨架形成廣泛的接觸，并且其存在對抗體介導(dǎo)效應(yīng)子功能(例如抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC))是必要的(Lifely，M. R.等人，Glycobiology 5(1995)813-822 ；Jefferis, R.等人，Immunol. Rev. 163 (1998) 59-76 ；Wright, A.，和 Morrison, S. L.，TrendsBiotechnol. 15(1997)26-32)。Umana，P.等人· Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180 和WO 99/154342顯示在中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中過表達(dá)β (1，4)-N-乙酰葡萄糖胺基轉(zhuǎn)移酶III ( “GnT III”)(催化二等分(bisected)的寡糖形成的糖基轉(zhuǎn)移酶)顯著地增加抗體的體外ADCC活性。Asn297糖組分的變化或其消除也影響與Fe Y R和Clq的結(jié)合(Umana, P.等人，Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180 ；Davies, J.等人，Biotechnol.Bioeng. 74 (2001) 288-294 ；Mimura, Y.等人，J. Biol. Chem. 276 (2001) 45539-45547 ；Radaev, S.等人，J. Biol. Chem. 276 (2001) 16478-16483 ;Shields，R. L.等 A, J. Biol.Chem. 276 (2001) 6591-6604 ；Shields, R. L.等人，J. Biol. Chem. 277 (2002) 26733-26740 ；Simmons, L. C.等人，J. Immunol. Methods 263(2002) 133—147)。在例如TO 2005/018572、TO 2006/116260、TO 2006/114700、TO 2004/065540、WO 2005/011735,WO 2005/027966,WO 1997/028267,US 2006/0134709,US 2005/0054048、US 2005/0152894、WO 2003/035835, WO 2000/061739、Niwa，R.等人，J. Immunol. Methods306 (2005) 151-160 ；Shinkawa, T.等人，J Biol Chem, 278 (2003) 3466-3473 ；W0 03/055993或US 2005/0249722中說明了通過減少巖藻糖的量來增強(qiáng)單克隆抗體的細(xì)胞介導(dǎo)的效應(yīng)子功能的方法。人IgGl或IgG3的糖基化發(fā)生在Asn297，因為核心巖藻糖化的雙觸角復(fù)雜寡糖糖基化以最多2個Gal殘基終止。Kabat, E.A.等人，Sequences of Pro teins ofImmunological Interest,第 5 版 Public Health Service, National Institutes ofHealth, Bethesda, MD. (1991)和 Briiggemann, M.等人，J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361 ；Love,T. ff.等人，Methods EnzymoI. 178 (1989) 515-527 詳細(xì)報道了 IgGl 或 IgG3 亞類的人恒定重鏈區(qū)。取決于末端Gal殘基的量，這些結(jié)構(gòu)被稱為G0、Gl(a-I，6-或a_l，3_)或G2聚糖殘基(Raju, T. S.，Bioprocess Int. I (2003) 44-53)。例如 Routier, F. H.，GlycoconjugateJ. 14 (1997) 201-207描述了抗體Fe部分的CHO型糖基化。在非糖修飾的CHO宿主細(xì)胞中重組表達(dá)的抗體通常以至少85%的量在Asn297被巖藻糖化。全長親本抗體的經(jīng)修飾的寡糖可以是雜合的或復(fù)合的。優(yōu)選地二等分的，還原的/未巖藻糖化的寡糖是雜合的。在另一個實施方式中，雙分叉的，還原的/未巖藻糖化的寡糖是復(fù)合的。根據(jù)本發(fā)明，“巖藻糖的量”指相對于聯(lián)結(jié)到Ash297的全部糖結(jié)構(gòu)(例如復(fù)合、雜合和高甘露糖結(jié)構(gòu))的總量的在糖鏈內(nèi)Asn297位的所述糖的量，其用MALDI-T0F質(zhì)譜法測量并計算平均值。巖藻糖的相對量是含有巖藻糖的結(jié)構(gòu)相對于通過MALDI-T0F在N-糖苷酶F處理的樣品中鑒定的全部糖結(jié)構(gòu)(例如分別是復(fù)合、雜合以及寡甘露糖和高甘露糖結(jié)構(gòu))的百分比(見實施例10)。與其親本<EGFR>和/或〈IGF-1R〉抗體相比，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性〈EGFR-IGF-1R〉抗體表現(xiàn)出EGFR和IGF-IR受體的內(nèi)在化降低。因此，在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方式中，雙特異性〈EGFR-IGF-1R〉抗體是用糖鏈在Asn297糖基化的(IgGl或IgG3亞類，優(yōu)選地IgGl亞類)，其中所述糖鏈中巖藻糖的量是65%或更低(根據(jù)Kabat編號)。在另一個實施方式中所述糖鏈中的巖藻糖量在5 %至65 %之間，優(yōu)選地在20 %至40 %之間。根據(jù)本發(fā)明，“Asn297”指位于Fe區(qū)中約第297位的氨基酸天冬酰胺?；诳贵w較小的序列變異，Asn297也可位于第297位的上游或下游若干氨基酸處(通常不多于±3個氨基酸)，即在第294位和第300位之間。此類糖改造的抗體在本文中也稱為afocusylated抗體。根據(jù)本發(fā)明的afocusylated雙特異性抗體可在糖修飾的宿主細(xì)胞中表達(dá),該宿主細(xì)胞被改造使得以足以部分地巖藻糖化Fe區(qū)中的寡糖的量表達(dá)至少一個編碼具有GnTIII活性的多肽的核酸。在一個實施方式中，具有GnTIII活性的多肽是融合多肽。備選地，可以根據(jù)US 6，946，292降低或消除宿主細(xì)胞的α 1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性以生成糖修飾的宿主細(xì)胞?？贵w巖藻糖化的量可以預(yù)先確定，例如通過發(fā)酵條件(例如發(fā)酵時間)或通過至少兩個具有不同巖藻糖化量的抗體的組合。此類afocusylated抗體和相應(yīng)的糖改造方法在 WO 2005/044859、WO 2004/065540、W02007/031875、Umana，P.等人，Nature Biotechnol. 17(1999) 176-180、WO 99/154342,WO 2005/018572、WO 2006/116260、WO 2006/114700,WO 2005/011735, WO 2005/027966,WO 97/028267、US 2006/0134709, US2005/0054048、US 2005/0152894、WO 2003/035835、WO 2000/061739 中說明。這些糖改造的抗體具有增加的ADCC。產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的afocusylated抗體的其他糖改造方法在例如Niwa, R.等人，J. Immunol. Methods 306(2005) 151-160 ；Shinkawa, T.等人，J Biol Chem,278(2003)3466-3473 ;W003/055993 或 US 2005/0249722 中說明。一個實施方式是使用 WO 2005/044859、WO 2004/065540、WO 2007/031875、Umana, P.等人，Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180、WO 99/154342、WO 2005/018572、WO 2006/116260, WO 2006/114700, WO 2005/011735, WO 2005/027966, WO 97/028267、US2006/0134709、US 2005/0054048、US 2005/0152894、WO 2003/035835 或 WO 2000/061739中所述的方法制備IgGl或IgG3亞類的雙特異性抗體的方法，所述雙特異性抗體在Asn297被糖鏈糖基化，從而所述糖鏈中巖藻糖的量是65%或更低。
一個實施方式是使用 Niwa, R.等人，J. Immunol. Methods 306 (2005) 151-160 ；Shinkawa,T.等人，J Biol Chem, 278 (2003) 3466-3473 ；W0 03/055993 或 US 2005/0249722所述的方法制備IgGl或IgG3亞類的雙特異性抗體的方法，所述雙特異性抗體在Asn297被糖鏈糖基化，從而所述糖鏈中巖藻糖的量是65%或更低。根據(jù)本發(fā)明的抗體是用重組方法生產(chǎn)的。因此，本發(fā)明的一個方面是編碼根據(jù)本發(fā)明的抗體的核酸，而另一個方面是包含編碼根據(jù)本發(fā)明的抗體的所述核酸的細(xì)胞?，F(xiàn)有技術(shù)熟知重組生產(chǎn)的方法，包括在原核和真核細(xì)胞中表達(dá)蛋白質(zhì)，然后分離抗體并且通常純化到可藥用的純度。為在宿主細(xì)胞中表達(dá)上述抗體，通過標(biāo)準(zhǔn)方法將編碼各個經(jīng)修飾的輕鏈和重鏈的核酸插入表達(dá)載體。在適當(dāng)?shù)脑嘶蛘婧怂拗骷?xì)胞如CHO細(xì)胞、NSO細(xì)胞、SP2/0細(xì)胞、HEK293細(xì)胞、COS細(xì)胞、PER. C6細(xì)胞、酵母或大腸桿菌細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，并從細(xì)胞(上清液或裂解后的細(xì)胞)回收抗體?，F(xiàn)有技術(shù)熟知用于重組生產(chǎn)抗體的通用方法，并在例如綜述文獻(xiàn) Makrides，S. C.，Protein Expr· Purif. 17(1999) 183-202 ；Geisse, S.等人，Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282 ；Kaufman, R. J. , Mol.Biotechnol. 16 (2000) 151-161 ；fferner, R. G.，Drug Res. 48 (1998) 870-880 中描述。通過常規(guī)免疫球蛋白純化方法，如，例如蛋白A-瓊脂糖凝膠、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析，從培養(yǎng)基適當(dāng)?shù)胤蛛x根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體。用常規(guī)方法，容易地分離和測序編碼單克隆抗體的DNA和RNA。雜交瘤細(xì)胞可作為此類DNA和RNA的來源。一旦分離，就可以把DNA插入表達(dá)載體，然后將其轉(zhuǎn)染到否則不生產(chǎn)免疫球蛋白的宿主細(xì)胞(例如HEK293細(xì)胞、CHO細(xì)胞或雜交瘤細(xì)胞)中，以獲得在宿主細(xì)胞中合成重組單克隆細(xì)胞。通過向抗體DNA中引入適當(dāng)?shù)暮塑账岣淖?或通過核苷酸合成來制備雙特異性抗體的氨基酸序列變體(或突變體)。然而，此類修飾只能在非常有限的范圍內(nèi)進(jìn)行。例如，修飾不改變上述抗體的特征，例如IgG同種型和抗原結(jié)合，但可改善重組生產(chǎn)的產(chǎn)量、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性或便于純化。如本申請所用的術(shù)語“宿主細(xì)胞”指能被改造以生成根據(jù)本發(fā)明的抗體的任何種類的細(xì)胞系統(tǒng)。在一個實施方式中HEK293細(xì)胞和CHO細(xì)胞被用作宿主細(xì)胞。
如本文所用，表達(dá)法“細(xì)胞”、“細(xì)胞系”和“細(xì)胞培養(yǎng)物”被可互換地使用，全部此類命名包括后代。因此，詞語“轉(zhuǎn)化體”和“轉(zhuǎn)化的細(xì)胞”包括原代目標(biāo)細(xì)胞和源自其的培養(yǎng)物，無論轉(zhuǎn)移次數(shù)。也應(yīng)當(dāng)理解，由于故意或偶然的突變，后代的DNA內(nèi)容可能不全部地精確地相同。包括這樣的變體后代，所述變體后代具有與在初始轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中所篩選的相同的功能或生物活性。當(dāng)意指不同的命名時，可從上下文弄清楚。在NSO細(xì)胞中的表達(dá)在例如Barnes, L. Μ.等人，Cytotechnology32(2000) 109-123 ；Barnes, L. Μ.等人，Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270 中描述。瞬時表達(dá)由例如 Durocher, Y.，等人，Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9 描述。Orlandi, R.，等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837 ;Carter, P.等人，Proc. Natl. Acad. Sci.USA 89(1992)4285-4289 和 Norderhaug，L.等人，J. Immunol. Methods 204(1997)77-87描述了可變結(jié)構(gòu)域的克隆。Schlaeger, E. -J.,和 Christensen, K. , Cytotechnology30(1999)71-83 和 Schlaeger，E.-J.，J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199 描述了優(yōu)選的瞬時表達(dá)系統(tǒng)(HEK293)。適于例如原核細(xì)胞的控制序列包括啟動子，任選地操縱子序列和核糖體結(jié)合位·點。已知真核細(xì)胞利用啟動予、增強(qiáng)子和聚腺苷酸化信號。當(dāng)以功能性關(guān)系地放置核酸與另一核酸序列時，核酸是“有效連接”的。例如，如果前序列或分泌性引導(dǎo)物的DNA作為參與多肽分泌的前蛋白被表達(dá)，則它是與多肽的DNA有效連接的；如果啟動子或增強(qiáng)子影響序列的轉(zhuǎn)錄，則它是與編碼序列有效連接的；或者如果核糖體結(jié)合位點被定位以促進(jìn)翻譯，則它是與編碼序列有效連接的。通常，“有效連接”指被連接的DNA序列是鄰近的，在分泌性引導(dǎo)物的情況下，鄰近并在閱讀框內(nèi)。然而，增強(qiáng)子不必是鄰近的。連接是通過在方便的限制性位點連接完成的。如果不存在此類位點，根據(jù)常規(guī)實踐，使用合成的寡核苷酸接頭或連接頭。實施抗體純化以除去細(xì)胞組分或其他污染物，例如其他細(xì)胞核酸或蛋白質(zhì)，通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，包括堿/SDS處理、CsCl顯帶、柱層析、瓊脂糖凝膠電泳和其他本領(lǐng)域熟知的技術(shù)。參見 Ausubel, F.等人編著.Current Protocols in Molecular Biology, GreenePublishing and Wiley Interscience,New York(1987)。建立了不同的方法并普遍用于蛋白質(zhì)純化，如用微生物蛋白質(zhì)進(jìn)行親和層析(例如蛋白A或蛋白G親和層析)、離子交換層析(例如陽離子交換(羧甲基樹脂)、陰離子交換(氨基乙基樹脂)和混合模式交換)、親硫吸附(例如用巰基乙醇和其他SH配體)、疏水相互作用或芳族吸附層析(例如用苯基-瓊脂糖凝膠、aza-arenophilic樹脂或間-氨基苯基硼酸)、金屬螯合親和層析(例如用Ni (II)和Cu(II)親和材料)、大小排阻層析和電泳方法(例如凝膠電泳、毛細(xì)管電泳)(Vijayalakshmi, M. A.AppI.Biochem. Biotech. 75(1998)93-102)。如本文所用的術(shù)語“轉(zhuǎn)化”指將載體/核酸轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞內(nèi)的過程。如果使用沒有堅硬的細(xì)胞壁屏障的細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，用例如Graham，F(xiàn).L.，和van der Eb,A. J. , Virology 52 (1973) 456ff所述的磷酸鈣沉淀方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。然而，也可以使用將DNA引入細(xì)胞的其他方法，例如核注射或原生質(zhì)體融合。如果使用原核細(xì)胞或含有實質(zhì)的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的細(xì)胞，例如，一個轉(zhuǎn)染方法是用氯化鈣進(jìn)行鈣處理，如Cohen，F(xiàn). N等人，PNAS. 69 (1972) 71 IOff 所述。如本文所用，“表達(dá)”指核酸被轉(zhuǎn)錄為mRNA的過程和/或轉(zhuǎn)錄的mRNA (也稱為轉(zhuǎn)錄物)隨后被翻譯為肽、多肽或蛋白質(zhì)的過程。轉(zhuǎn)錄物和編碼的多肽被共同地稱為基因產(chǎn)物。如果多核苷酸源自基因組DNA，真核細(xì)胞中的表達(dá)可包括mRNA的剪切?！拜d體”是核酸分子，特別地是自我復(fù)制的核酸分子，它將插入的核酸分子轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞內(nèi)和/或在宿主細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移。術(shù)語包括主要起到將DNA或RNA插入到細(xì)胞內(nèi)(例如染色體整合)的功能的載體、主要起到復(fù)制DNA和RNA的功能的載體的復(fù)制，和起到轉(zhuǎn)錄和/或翻譯DNA或RNA的功能的表達(dá)載體。也包括提供多于一種上述功能的載體?！氨磉_(dá)載體”是這樣的多核苷酸，當(dāng)它被引入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞時，能被轉(zhuǎn)錄和翻譯為多肽。“表達(dá)系統(tǒng)”通常指由能起到產(chǎn)生所需表達(dá)產(chǎn)品的功能的表達(dá)載體組成的適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體具有有價值的特征如在哺乳動物細(xì)胞中良好的表達(dá)產(chǎn)量、穩(wěn)定性、生物或藥理學(xué)活性、藥物動力學(xué)性質(zhì)或毒性。例如，它們可用于治療如癌癥的疾病。根據(jù)本發(fā)明的抗體，特別是雙特異性〈IGF-1R-EGFR〉抗體表現(xiàn)出有高度價 值的性質(zhì)例如對表達(dá)IGF-IR和EGFR受體的癌細(xì)胞的生長抑制，以及抗腫瘤效力，為罹患癌癥的患者帶來益處。與其親本單特異性〈IGF-1R〉和<EGFR>抗體相比，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性〈IGF-1R-EGFR〉抗體表現(xiàn)出降低的IGF-IR和EGFR受體的內(nèi)在化。本發(fā)明的一個方面是包含根據(jù)本發(fā)明的抗體的藥物組合物。本發(fā)明的另一個方面是根據(jù)本發(fā)明的抗體用于制造藥物組合物的用途。本發(fā)明的其他方面是制造包含根據(jù)本發(fā)明的抗體的藥物組合物的方法。在另一個方面，本發(fā)明提供組合物，例如藥物組合物，所述組合物含有根據(jù)本發(fā)明的抗體，與藥用載體共同制劑。本發(fā)明的一個實施方式是用于治療癌癥的根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體。本發(fā)明的另一個方面是用于治療癌癥的所述藥物組合物。本發(fā)明的另一個方面是根據(jù)本發(fā)明的抗體用于制造用于治療癌癥的藥物的用途。本發(fā)明的另一個方面是通過對需要此類治療的患者施用根據(jù)本發(fā)明的抗體，來治療罹患癌癥的患者的方法。如本文所用，“藥用載體”包括任何和全部生理學(xué)上相容的溶劑、分散介質(zhì)、涂層、抗細(xì)菌和抗真菌劑、等滲和吸附延遲劑等。優(yōu)選地，載體適于靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、腸胃外、脊髓或表皮施藥(例如通過注射或灌注)。本發(fā)明的組合物可以用多種本領(lǐng)域已知的方法給藥。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，施藥的途徑和/或模式將根據(jù)所需的結(jié)果變化。為通過某些施藥途徑施用本發(fā)明的化合物，用防止其失活的材料涂覆化合物或與化合物共同施用可能是必需的。例如，化合物可以在適當(dāng)?shù)妮d體，例如脂質(zhì)體或稀釋劑中對受試者施藥?？伤幱玫南♂寗┌}水和水性緩沖溶液。藥用載體包括無菌水溶液或分散液和用于臨時制備無菌可注射溶液或分散液的無菌粉末。本領(lǐng)域熟知此類介質(zhì)和活性劑用于藥用活性物質(zhì)的用途。如本文所用的用語“腸胃外施藥”和“腸胃外地施藥”指除了腸和局部施藥外的施藥模式，通常通過注射，包括但不限于靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眶內(nèi)、心臟內(nèi)、皮膚內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、囊下、蛛網(wǎng)膜下、脊髓內(nèi)、硬膜上和胸骨內(nèi)注射和灌注。如本文所用的術(shù)語癌癥指增生性疾病，例如淋巴瘤、淋巴細(xì)胞白血病、肺癌、非小細(xì)胞肺(NSCL)癌、細(xì)支氣管肺泡細(xì)胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭或頸部癌、皮膚或眼內(nèi)黑素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門區(qū)癌、胃癌(stomach cancer)、胃癌(gastriccancer)、結(jié)腸癌、乳腺癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、陰道癌、陰戶癌、霍奇金病、食道癌、小腸癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、膀胱癌、腎或輸尿管癌、腎細(xì)胞癌、腎盂癌、間皮瘤、肝細(xì)胞癌、膽癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)腫瘤、脊柱軸(spinal axis)腫瘤、腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤、多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、神經(jīng)鞘瘤、室管膜瘤、髓母細(xì)胞瘤、腦膜瘤、鱗狀細(xì)胞癌、垂體腺瘤和尤文氏肉瘤，包括任何上述癌的難治性形式或一個或多個上述癌癥的組合。這些組合物也可含有佐劑，例如防腐劑、濕潤劑、乳化劑和分散劑?？梢酝ㄟ^如上所述的滅菌程序和通過包括多種抗細(xì)菌和抗真菌劑，例如對羥苯甲酸酯、氯丁醇、酚、山梨酸等確保防止微生物存在。組合物中也可以理想地包括等滲劑，例如糖、氯化鈉等。此外，可以通過包括延遲吸收的活性劑例如單硬脂酸鋁和明膠，導(dǎo)致可注射的藥用形式的延長的吸收。無論選擇何種施藥途徑，通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的常規(guī)方法，將可以適當(dāng)?shù)乃闲问绞褂玫谋景l(fā)明的化合物，和/或本發(fā)明的藥物組合物制劑為可藥用的劑型?！?br> 本發(fā)明的藥物組合物中活性成分的實際劑量水平可以變化以獲得能有效地實現(xiàn)特定患者、組合物和施藥模式所需的治療應(yīng)答，而不對患者有毒性的活性成分的量。選擇的劑量水平將取決于多個藥物動力學(xué)因素，包括使用的本發(fā)明的特定組合物的活性、施藥途徑、施藥時間、使用的特定組合物的排泄速率、治療的持續(xù)時間、與使用的特定組合物組合使用的其他藥物、化合物和/或材料、受治療的患者的年齡、性別、體重、病況、總體健康狀況和既往病史，以及醫(yī)療領(lǐng)域熟知的類似因素。組合物必須是無菌的并且是流體，使得能夠用注射器遞送。除了水，載體優(yōu)選地是等滲緩沖的鹽水溶液。例如通過使用涂層如卵磷脂，通過在分散劑的情況下維持所需的顆粒大小和通過使用表面活性劑，能夠維持適當(dāng)?shù)牧鲃有?。在許多情況下，優(yōu)選地在組合物中包括等滲劑，例如糖、多元醇如甘露醇或山梨糖醇以及氯化鈉。氨基酸序列描述SEQ ID NO 1<IGF-1R> 重鏈，0A-Akl8-scFab_GA201 (+WT)SEQ ID NO :2〈IGF_1R> 輕鏈，0A-Akl8-scFab_GA201 (+WT)SEQ ID NO 30A-Akl8-scFab-GA201的<EGFR>肽連接的重鏈和輕鏈，二硫化物穩(wěn)定 VH 44/VL100SEQ ID NO 40A-Akl8-scFab-GA201_WT 的 <EGFR> 肽連接的重鏈和輕鏈SEQ ID NO :5〈EGFR> 重鏈，0A-GA201-scFab_Akl8 (+WT)SEQ ID NO :6〈EGFR> 輕鏈，0A-GA201-scFab_Akl8 (+WT)SEQ ID NO 7<IGF-1R>肽連接的重鏈和輕鏈，二硫化物穩(wěn)定VH44/VL100-0A-GA201-scFab-Akl8SEQ ID NO 80A-GA201-scFab-Akl8_WT 的 <IGF_1R> 肽連接的重鏈和輕鏈SEQ ID NO 9<VEGF> 重鏈，Ang2_VEGF 0A-Ava-N_scFabLC06 (+SS)SEQ ID NO 10<VEGF> 輕鏈，Ang2-VEGF0A-Ava-N-scFabLC06 (+SS)SEQ ID NO :11 Ang2_VEGF 0A-Ava-N_scFabLC06SS 的 <ANG_2> 肽連接的重鏈和輕鏈，二硫化物穩(wěn)定VH 44/VL100SEQ ID NO : 12〈ANG-2>Ang2_VEGF 0A-Ava-N_scFabLC06 的 <ANG_2> 肽連接的重鏈和輕鏈SEQ ID NO : 13 人 EGFRSEQ ID N0:14 人 IGF-1RSEQ ID NO : 15 人 VEGFSEQ ID N0:16 人 ANG-2提供以下實施例、序列表和附圖以幫助理解本發(fā)明，本發(fā)明的實際范圍在權(quán)利要求書中說明。應(yīng)當(dāng)理解，可以在不離開本發(fā)明的精神的情況下對所述方法進(jìn)行修改?！?br> 實驗方法
實施例材料和方法重組DNA技術(shù)用標(biāo)準(zhǔn)方法操作DNA,如 Sambrook, J.等人，Molecular cloning Alaboratorymanual ；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989所述。根據(jù)制造商的說明使用分子生物學(xué)試劑。DNA和蛋白質(zhì)序列分析和序列數(shù)據(jù)管理關(guān)于人免疫球蛋白輕鏈和重鏈的核苷酸序列的一般信息在Kabat，E.A.等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版，NIHPublicationNo 91-3242中給出?？贵w鏈的氨基酸是根據(jù)EU編碼(Edelman，G. Μ.等人，PNAS63(1969)78-85 ;Kabat, Ε. Α.等人，(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第 5 版· ,NIH Publication No 91-3242)來編碼的。用 GCG(Genetics ComputerGroup, Madison, Wisconsin)的軟件包版本 10. 2 和 Infomax 的 Vector NTI 高級套裝版本
8.O進(jìn)行序列產(chǎn)生、作圖、分析、注釋和圖解。DNA 測序DNA序列是通過在 SequiServe (Vaterstetten,德國)和 Geneart AG (Regensburg,德國)實施的雙鏈測序測序確定的?；蚝铣伤璧幕蚱问怯蒅eneart AG (Regensburg,德國)通過自動基因合成從合成的寡核苷酸和PCR產(chǎn)物制備的。編碼攜帶S354C和T366W突變的“knobs-in-hole”抗體重鏈以及在CH3結(jié)構(gòu)域與未修飾的VH結(jié)構(gòu)域或scFab抗體片段的組合中攜帶Y349C、T366S、L368A和Y407V突變的“knobs-in-hole”抗體重鏈，以及抗體輕鏈的基因片段的側(cè)翼有單數(shù)個限制性內(nèi)切酶切割位點(BamHI-XbaI或BamHI-KpnI)并被克隆到pGA18 (ampR)質(zhì)粒中。從經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌純化質(zhì)粒DNA并用UV光譜學(xué)確定濃度。通過DNA測序確認(rèn)亞克隆的基因片段的DNA序列。所有構(gòu)建體都被設(shè)計為具有編碼前導(dǎo)肽(MGWSCIILFLVATATGVHS)的5’端DNA序列，該前導(dǎo)肽在真核細(xì)胞中靶向分泌的蛋白質(zhì)。構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒使用Roche表達(dá)載體用于構(gòu)建全部編碼“knobs-in-hole”重鏈和抗體輕鏈的表達(dá)質(zhì)粒。載體由以下元件組成-潮霉素抗性基因，作為選擇標(biāo)志物，-EB病毒(EBV)的復(fù)制起點oriP，-來自載體pUC18的復(fù)制起點,其允許該質(zhì)粒在大腸桿菌中復(fù)制-β -內(nèi)酰胺酶基因，其賦予大腸桿菌氨芐霉素抗性，-來自人巨細(xì)胞病毒(HCMV)的早早期增強(qiáng)子和啟動子，-人I-免疫球蛋白聚腺苷酸(“polyA”)信號序列，和-獨特的BamHI和XbaI限制性位點。
·
包含具有未修飾的VH結(jié)構(gòu)域或scFab片段的“knobs-in-hole”重鏈，和未修飾的輕鏈的免疫球蛋白基因是用基因合成制備的，并按說明克隆進(jìn)入pGA18(ampR)質(zhì)粒中。用BamHI 和 XbaI 或 BamHI 和 KpnI 限制性酶(Roche Molecular Biochemicals)消化攜帶合成的DNA片段的pG18 (ampR)質(zhì)粒和Roche表達(dá)載體,并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。然后將經(jīng)純化的、編碼“knobs-into-hole”重鏈和未修飾的輕鏈的DNA片段與分離的Roche表達(dá)載體BamHI/Xbal或BamHI/Kpnl片段連接，得到最終表達(dá)載體。將最終表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌細(xì)胞中，分離表達(dá)質(zhì)粒DNA (Minipr印)并對其進(jìn)行限制性酶分析和DNA測序。在150mlLB-Amp培養(yǎng)基中培養(yǎng)正確的克隆，然后再次分離質(zhì)粒DNA(Maxiprep)并通過DNA測序確定序列完整性。在HEK293細(xì)胞中瞬時表達(dá)雙特異性抗體重組雙特異性抗體是通過根據(jù)制造商的說明用FreeStyle 293表達(dá)系統(tǒng)(Invitrogen,美國)瞬時轉(zhuǎn)染人胚胎腎293-F細(xì)胞表達(dá)的。簡而言之，在FreeStyle 293表達(dá)培養(yǎng)基中，37°C /8% CO2下培養(yǎng)FreeStyle 293-F細(xì)胞的懸液，并且在轉(zhuǎn)染當(dāng)天將細(xì)胞以1-2χ106活細(xì)胞/ml的密度接種到新鮮培養(yǎng)基中。在Opti-MEM I培養(yǎng)基(Invitrogen,美國)中，用 325 μ I 的 293fectin (Invitrogen,德國)和 250 μ g 的‘Knobs-into-hole”重鏈I和2和輕鏈質(zhì)粒DNA以I : I : I或I : 2 : I的摩爾比制備‘Knobs-into-hole”DNA_293fectin復(fù)合物，終轉(zhuǎn)染體積為250ml。在轉(zhuǎn)染7天后通過在14000g離心30分鐘收集合有抗體的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液，并通過無菌過濾器(0. 22 μ m)過濾。將上清液儲存在_20°C直到純化。純化雙特異性抗體通過用蛋白A-瓊脂糖凝膠 (GE Healthcare,瑞典)親和層析和Superdex200大小排阻層析從細(xì)胞培養(yǎng)物上清液純化雙特異性抗體。簡而言之，將無菌過濾的細(xì)胞培養(yǎng)物上清施用到用 PBS 緩沖液(IOmMNa2HPO4UmM KH2PO4U37mM NaCl 和 2. 7mM KCl, pH 7. 4)平衡的HiTrap ProteinA HP (5ml)柱上。用平衡緩沖液洗去未結(jié)合的蛋白質(zhì)。用O. IM pH2. 8的檸檬酸緩沖液洗脫抗體和抗體變體，并用O. Iml IM TrispH8. 5中和含有蛋白質(zhì)的部分。然后混合洗脫的蛋白質(zhì)部分，用Amicon Ultra離心過濾裝置(MWC0 :30K, Millipore)濃縮到體積為3ml并上樣到用20mM組氨酸、140mM NaCl, pH6. O平衡的Superdex200 HiLoad120ml 16/60凝膠過濾柱(GE Healthcare，瑞典)?；旌虾芯哂猩儆?%高分子量聚集物的純化的雙特異性抗體的部分并作為1.0mg/ml的等分試樣儲存在_80°C。分析純化的蛋白質(zhì)使用基于氨基酸序列計算出的摩爾消光系數(shù)，通過測量280nm處的光密度(OD)來測定純化的蛋白質(zhì)樣品的蛋白質(zhì)濃度。雙特異性和對照抗體的純度和分子量是通過在存在或不存在還原劑(5mM 1，4-二硫蘇糖醇)的條件下的SDS-PAGE和用考馬斯亮藍(lán)染色分析的。根據(jù)制造商的說明使用NllPAGE 預(yù)制凝膠系統(tǒng)(Invitrogen, USA) (4-20%Tris-甘氨酸凝膠)。用Superdex 200分析性大小排阻柱(GE Healthcare,瑞典)，通過高效SEC，在25°C的200mM KH2PO4,250mM KCl，pH 7· O的運行緩沖液中分析雙特異性和對照抗體樣品的聚集物成分。以O(shè). 5ml/min的流速將25 μ g蛋白質(zhì)注入柱中并等度洗脫50分鐘。為進(jìn)行穩(wěn)定性分析，在4°C和40°C孵育lmg/ml濃度的純化的蛋白質(zhì)7天，然后用高效SEC評估。在通過用肽-N-糖苷酶F(Roche Molecular Biochemicals)酶促處理來移除N-多糖后，通過NanoElectrospray Q-TOF質(zhì)譜儀驗證還原的雙特異性抗體輕鏈和重鏈的氨基酸骨架的完整性。表面等離子體共振結(jié)合親和性是用標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合測定(例如表面等離子體共振技術(shù)(BIAcore ,GE-Healthcare Uppsala，瑞典))在25°C確定的。為進(jìn)行親和性測量，用標(biāo)準(zhǔn)胺偶聯(lián)和封閉化學(xué)作用在SPR設(shè)備(Biacore T100)上將30yg/ml的抗Fe Y抗體(來自山羊，JacksonImmuno Research)偶聯(lián)到CM-5傳感器芯片的表面。綴合后,在25°C以5 μ L/min的流速注射單或雙特異性Her3/cMet抗體，然后以30 μ L/min進(jìn)行人HER3或c_Met ECD的系列稀釋(OnM至IOOOnM)。用PBS/0. 1% BSA作為結(jié)合實驗的運行緩沖液。然后用IOmM甘氨酸-HCl，pH 2. O溶液的60s脈沖再生芯片。EGFR/IGF-1R表面等離子體共振使用Biacore TlOO 裝置(GE Healthcare Biosciences AB, Uppsala,瑞典)進(jìn)行SPR實驗。使用標(biāo)準(zhǔn)胺的偶聯(lián)化學(xué)，將IGF-IR或EGFR固定在CM5生物傳感器芯片比表面。用固定化引導(dǎo)程序?qū)GF-IR或EGFR以I μ g/ml注射到醋酸鈉，pH5.0中，目標(biāo)是200RU(IGF-IR)或lOORU(EGFR)。以相同方法處理參考對照流動池，但只使用載體緩沖液。在 IxPBS pH7. 4,0. 05% Tween20 (Roche Diagnostics GmbH)中稀釋抗體并以 30 μ l/min 的流速，在3. 125和50nM之間增加的濃度注射抗體。接觸時間(締合階段)是3min (EGFR結(jié)合)和 5min (IGF-1R 結(jié)合)，解離時間是 IOmin (EGFR)和 3min (IGF-IR)。用以 5 μ l/min 的流速注射O. 85%的磷酸達(dá)30s來再生EGFR結(jié)合。用以5 μ l/min的流速注射氯化鎂Imin再生IGF-IR結(jié)合。通過使用Biaevaluation軟件中的I : ILangmuir結(jié)合模型來計算動力學(xué)速率常數(shù)和平衡解離常數(shù)。為證明同時結(jié)合，將雙特異性抗體以25nM，5 μ l/min流速注射到EGFR表面達(dá)lmin。在將抗體捕獲到EGFR表面后，以30 μ l/min的流速，在2. 5和80nM之間增加的濃度注射IGF-1R。用以5μ l/min的流速注射O. 85%的磷酸達(dá)30s來再生表面。通過使用Biaevaluation軟件中的I : ILangmuir結(jié)合模型來計算動力學(xué)速率常數(shù)和平衡解離常數(shù)。ANG-2結(jié)合表面等離子體共振(Biacore)使用BIACORE TlOO 裝置(GE Healthcare Biosciences AB, Uppsala,瑞典)，通過表面等離子體共振研究抗體與抗原(例如人ANG-2)的結(jié)合。簡而言之，為進(jìn)行親和性測量，將山羊〈hlgG-Fc Y〉多克隆抗體通過胺偶聯(lián)固定在CM5芯片上，用于呈遞針對人ANG-2的抗體(圖 6B)。在 HBS 緩沖液(IOmM HEPESU50mM NaCl.O. 005% Tween 20, ph 7. 4)，25°C下測量結(jié)合。將純化的ANG-2-His(或內(nèi)部純化的)以6. 25nM和200nM之間的多種濃度加入溶液中。通過注射ANG-2達(dá)3分鐘測量締合；通過用HBS緩沖液洗滌芯片表明達(dá)3分鐘進(jìn)行測量解離，并用I : I Langmuir結(jié)合模型估計KD值。由于ANG-2制劑的異質(zhì)性，不能觀察到I : I結(jié)合；因此KD值只是相對估計值。從樣品曲線減去陰性對照數(shù)據(jù)(例如緩沖液曲線)，用于修正系統(tǒng)內(nèi)在基線位移和降低噪音信號。使用Biacore TlOO評估軟件版本I. I. I進(jìn)行傳感圖分析和用于親和性數(shù)據(jù)計算。備選地，經(jīng)由五組氨酸抗體，以2000-1700RU的捕獲水平捕獲Ang-2，所述五組氨酸抗體是經(jīng)由胺偶聯(lián)(無BSA)固定在CM5芯片上的(PentaHis-Ab 無 BSA, Qiagen No. 34660)(見下文)。VEGF結(jié)合表面等離子體共振(Biacore)在Biacore TlOO儀器上根據(jù)以下方法用表面等離子體共振技術(shù)分析雙特異性<VEGF-Ang-2>抗體的VEGF結(jié)合并使用TlOO軟件包分析簡而言之，經(jīng)由與山羊抗人IgGCJIR 109-005-098)，在CM5芯片上捕獲<VEGF>抗體。使用如下的標(biāo)準(zhǔn)氨基偶聯(lián)通過氨基偶聯(lián)固定捕獲抗體=HBS-N緩沖液作為運行緩沖液，活化是EDC/NHS的混合物完成的，其目標(biāo)是700RU的配體濃度。在偶聯(lián)緩沖液NaAc，pH 5.0, c = 2μ g/mL中稀釋捕獲抗體，最后通過注射IM乙醇胺封閉仍然活化的羧基。Mabs〈VEGF>抗體的捕獲是在5 μ L/min的 流動和c (Mabs〈VEGF>) = IOnM,用運行緩沖液+lmg/mL BSA稀釋的條件下完成的；應(yīng)當(dāng)達(dá)到約30RU的捕獲水平。使用rhVEGF((rhVEGF，R&D-Systems貨號293-VE)作為分析物。VEGF結(jié)合<VEGF>抗體的動力學(xué)表征是在37°C下，在作為運行緩沖液的PBS+0. 005% (v/v)Tween20中完成的。以50L/min的流動和80sec的締合時間以及1200sec的解離時間，和從300-0. 29nM的rhVEGF的濃度系列注射樣品。在每個分析物循環(huán)后，用IOmM甘氨酸pH I. 5，以及60秒的接觸時間，進(jìn)行自由捕獲抗體表面的再生。用通常的雙參考方法(對照參考rhVEGF結(jié)合以捕獲山羊抗人IgG分子，測量流動池空白，rhVEGF濃度“0”，模型I :Langmui結(jié)合I : I)(由于捕獲分子結(jié)合，Rmax被設(shè)定為局部)來計算動力學(xué)常數(shù)。生成HEK293_Tie2 細(xì)胞系為確定血管生成素-2抗體與ANG2刺激的Tie2磷酸化和ANG2與Tie2結(jié)合對細(xì)胞的干擾，生成了重組HEK293_Tie細(xì)胞系。簡而言之，使用Fugene (Roche Applied Science)作為轉(zhuǎn)染劑，將編碼在CMV啟動子控制下的全長人Tie2 (SEQ ID 108)和新霉素抗性標(biāo)志物的、基于pcDNA3 的質(zhì)粒(RB22-pcDNA3 Topo hTie2)轉(zhuǎn)染到HEK293 細(xì)胞(ATCC)中并在DMEM10% FCS, 500 μ g/ml G418中選擇抗性細(xì)胞。通過克隆柱分離單個克隆，然后通過FACS分析Tie2表達(dá)。鑒定出克隆22具有高和穩(wěn)定的Tie2表達(dá)，即使缺少G418 (HEK293_Tie2克隆22)。然后用HEK293-Tie2克隆22進(jìn)行細(xì)胞測定ANG2誘導(dǎo)的Tie2磷酸化和ANG2細(xì)胞配體結(jié)合測定。VEGF誘導(dǎo)的HUVEC增殖測定選擇VEGF誘導(dǎo)的HUVEC(人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，Promocel 1#C_12200)增殖以測量VEGF抗體的細(xì)胞功能。簡而言之，在用膠原蛋白I涂覆的BDBiocoat Collagen I微量滴定板(BD#354407/35640)中的100 μ I饑餓培養(yǎng)基(ΕΒΜ-2內(nèi)皮基本培養(yǎng)基2，Promocell#C-22211,0. 5 % FCS,青霉素/鏈霉素)中孵育每96孔5000個HUVEC細(xì)胞(低傳代數(shù)值，(5次傳代)過夜。將不同濃度的抗體與rhVEGF混合(30ngl/ml終濃度，BD#354107)并在室溫預(yù)孵育15分鐘。然后將混合物添加到HUVEC細(xì)胞，并且在37°C，5%CO2孵育它們72h。在分析當(dāng)天將板平衡至室溫達(dá)30min，然后根據(jù)手冊用CellTiter-GloTM發(fā)光細(xì)胞活力測定試劑盒(Promega，#G7571/2/3)確定細(xì)胞活力/增殖。在分光光度計中測定發(fā)光。ANG2誘導(dǎo)的Tie2磷酸化測定根據(jù)以下測定原理測量雙特異性〈ANG2-VEGF〉抗體對ANG2誘導(dǎo)的Tie2磷酸化的抑制。在不存在或存在〈ANG2-VEGF〉抗體的情況下，用ANG2刺激HEK293_Tie2克隆22達(dá)5分鐘并用夾心ELISA對P-Tie2進(jìn)行定量。簡而言之，在聚D-賴氨酸涂覆的96孔微量滴定板上，在 100 μ 1DMEM, 10% FCS, 500 μ g/ml Geneticin 中培養(yǎng)每孔 2x105 個 HEK293_Tie2克隆22細(xì)胞過夜。第二天在微量滴定板中制備〈ANG2-VEGF〉抗體的滴定行(4倍濃縮，75 μ I 終體積 / 孔，兩份)并與 75 μ I 的 ANGPT2 (R&D systems#623-AN)稀釋液(3. 2 μ g/ml作為4倍濃縮溶液)混合。將抗體和ANG2在室溫預(yù)孵育15min。將100 μ I混合物添加至HEK293-Tie2 克隆 22 細(xì)胞(用 ImM NaV3O4, Sigma#S6508 預(yù)孵育 5min)并在 37°C孵育 5min。然后，每孔用200 μ I的冰冷的PBS+lmM NaV3O4洗滌細(xì)胞并通過每孔添加120 μ I的裂解緩沖液(20mM Tris, pH 8· O、137mMNaCl、I % NP-40、10%甘油、2mM EDTAUmM NaV304、lmM PMSF 和10 μ g/ml抑酶肽)在冰上裂解細(xì)胞。在4°C在微量滴定板搖床上裂解細(xì)胞30min，然后將100 μ I裂解液直接轉(zhuǎn)移到P-Tie2 ELISA微量滴定板(R&DSystems，R&D#DY990)而不用預(yù)先離心，也不用進(jìn)行測定總蛋白質(zhì)。根據(jù)制造商的說明定量P_Tie2并使用Excel的XLfit4分析插件測定抑制的IC50值(劑量應(yīng)答單址(one site)，模型205)。細(xì)胞滴度發(fā)光測定用細(xì)胞滴度發(fā)光測定(Promega)定量細(xì)胞活力和增殖。根據(jù)制造商的說明進(jìn)行測定。簡而言之，將細(xì)胞以IOOyL的總體積在96孔板內(nèi)培養(yǎng)所需的時間。為進(jìn)行增殖測定，將細(xì)胞從培養(yǎng)箱中移出并在室溫放置30min。加入100 μ L細(xì)胞滴度發(fā)光試劑并將多孔板放在定軌搖床上達(dá)2min。15min后在微板閱讀儀(Tecan)上對發(fā)光定量。實施例Ia表達(dá)&純化雙特異性二價〈VEGF-ANG-2〉抗體分子根據(jù)上文材料和方法所述的過程，表達(dá)和純化雙特異性二價〈VEGF-ANG-2〉抗體分子 Ang2-VEGF 0A-Ava-N-scFabLC06SS 和 Ang2_VEGF 0A-Ava-N_scFabLC06。<VEGF>部分的VH和VL基于貝伐珠單抗。<ANG2>部分的VH和VL基于ANG2i_LC06的VH和VL(在PCT申請?zhí)朠CT/EP2009/007182中說明，是通過噬菌體展示獲得的)。這些雙特異性二價抗體的相關(guān)輕鏈和重鏈氨基酸序列在SEQ ID NO :9、SEQID N0:10、SEQ ID NO 11 (Ang2-VEGF 0A-Ava-N_scFabLC06SS)，和 SEQ ID NO :9、SEQ ID NO:
10、SEQ ID NO 12 (Ang2-VEGF0A-Ava-N_scFabLC06)中給出。通過蛋白質(zhì)印跡確認(rèn)Ang2-VEGF0A-Ava-N-scFabLC06SS 和 Ang2-VEGF 0A-Ava-N-scFabLC06 的表達(dá)。Ang2_VEGF0A-Ava-N-scFabLC06SS 和 Ang2-VEGF0A-Ava-N_scFabLC06 的純化導(dǎo)致以下產(chǎn)量。
權(quán)利要求
1.雙特異性抗體，包含 a)特異性結(jié)合第一個抗原的第一個全長抗體的重鏈和輕鏈； b)特異性結(jié)合第二個抗原的第二個全長抗體的重鏈和輕鏈，其中重鏈的N端通過多肽接頭連接到輕鏈的C端。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的抗體，其特征在于 a)的全長抗體的重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域和b)的全長抗體的重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域各自在包含抗體CH3結(jié)構(gòu)域之間的原界面中的改變的界面處交匯； 其中，i)在一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域 氨基酸殘基被具有較大側(cè)鏈體積的氨基酸殘基取代，從而在一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)生成凸起，該凸起可置于另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)的腔中并且其中 )在另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域中 氨基酸殘基被具有較小側(cè)鏈體積的氨基酸殘基取代，從而在第二個CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)生成腔，第一個CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)的凸起可置于該腔中。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的抗體，其特征在于 所述具有較大側(cè)鏈體積的氨基酸殘基選自精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)和 所述具有較小側(cè)鏈體積的氨基酸殘基選自丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、纈氨酸(V)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2至3的抗體，其特征在于 通過引入半胱氨酸(C)作為每個CH3結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)位置的氨基酸，兩個CH3結(jié)構(gòu)域都被進(jìn)一步改變，使得兩個CH3結(jié)構(gòu)域之間能形成二硫橋。
5.根據(jù)權(quán)利要求I至4的抗體，其特征在于 b)的第二個全長抗體的重鏈和輕鏈的抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)是通過在以下位置之間引入二硫鍵，由二硫化物穩(wěn)定的 i)重鏈可變結(jié)構(gòu)域第44位至輕鏈可變結(jié)構(gòu)域第100位， )重鏈可變結(jié)構(gòu)域第105位至輕鏈可變結(jié)構(gòu)域第43位，或 iii)重鏈可變結(jié)構(gòu)域第101位至輕鏈可變結(jié)構(gòu)域第100位。
6.根據(jù)權(quán)利要求I至5的雙特異性抗體，其中抗體包含IgGl的恒定區(qū)。
7.根據(jù)權(quán)利要求I的雙特異性抗體，其特征在于 a)第一個全長抗體特異性地結(jié)合IGF-IR并包含具有SEQID NO: I的氨基酸序列的重鏈，和具有SEQ ID NO 2的氨基酸序列的輕鏈，并且 b)第二個全長抗體特異性地結(jié)合EGFR并包含通過肽接頭與輕鏈連接的重鏈，其中所述肽連接的重鏈和輕鏈具有SEQ ID NO 3的氨基酸序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求I的雙特異性抗體，其特征在于 a)第一個全長抗體特異性地結(jié)合IGF-IR并包含具有SEQID NO : I的氨基酸序列的重鏈，和具有SEQ ID NO 2的氨基酸序列的輕鏈，并且 b)第二個全長抗體特異性地結(jié)合EGFR并包含通過肽接頭與輕鏈連接的重鏈，其中所述肽連接的重鏈和輕鏈具有SEQ ID NO 4的氨基酸序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求I的雙特異性抗體，其特征在于 a)第一個全長抗體特異性地結(jié)合EGFR并包含具有SEQID NO :5的氨基酸序列的重鏈，和具有SEQ ID NO 6的氨基酸序列的輕鏈，并且 b)第二個全長抗體特異性地結(jié)合IGF-IR并包含通過肽接頭與輕鏈連接的重鏈，其中所述肽連接的重鏈和輕鏈具有SEQ ID NO 7的氨基酸序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求I的雙特異性抗體，其特征在于 a)第一個全長抗體特異性地結(jié)合EGFR并包含具有SEQID NO :5的氨基酸序列的重鏈，和具有SEQ ID NO 6的氨基酸序列的輕鏈，并且 b)第二個全長抗體特異性地結(jié)合IGF-IR并包含通過肽接頭與輕鏈連接的重鏈，其中所述肽連接的重鏈和輕鏈具有SEQ ID NO 8的氨基酸序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求I的雙特異性抗體，其特征在于 a)第一個全長抗體特異性地結(jié)合VEGF并包含具有SEQID NO :9的氨基酸序列的重鏈，和具有SEQ ID NO 10的氨基酸序列的輕鏈，并且 b)第二個全長抗體特異性地結(jié)合ANG-2并包含通過肽接頭與輕鏈連接的重鏈，其中所述連接的重鏈和輕鏈具有SEQ ID NO : 11的氨基酸序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求I的雙特異性抗體，其特征在于 a)第一個全長抗體特異性地結(jié)合VEGF并包含具有SEQID NO :9的氨基酸序列的重鏈，和具有SEQ ID NO 10的氨基酸序列的輕鏈，并且 b)第二個全長抗體特異性地結(jié)合ANG-2并包含通過肽接頭與輕鏈連接的重鏈，其中所述連接的重鏈和輕鏈具有SEQ ID NO 12的氨基酸序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求6至10的雙特異性抗體，其中用糖鏈在Asn297糖基化抗體，其中糖鏈中巖藻糖的量是65%或更低。
14.包含根據(jù)權(quán)利要求I至13的抗體的藥物組合物。
15.根據(jù)權(quán)利要求I至13任一項的雙特異性抗體，其用于治療癌癥。
16.根據(jù)權(quán)利要求I至13任一項的雙特異性抗體用于制備治療癌癥的藥物中的用途。
17.通過向需要此類治療的患者施用根據(jù)權(quán)利要求I至13任一項的抗體，治療罹患癌癥的患者的方法。
18.編碼根據(jù)權(quán)利要求I至13任一項的雙特異性抗體的鏈的核酸分子。
19.含有根據(jù)權(quán)利要求18所述的核酸的表達(dá)載體，所述表達(dá)載體能在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)所述核酸。
20.包含根據(jù)權(quán)利要求19的載體的原核或真核宿主細(xì)胞。
21.制備根據(jù)權(quán)利要求I至13的雙特異性抗體的方法 包括以下步驟 a)用包含核酸分子的載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，核酸分子編碼 aa)特異性結(jié)合第一個抗原的第一個全長抗體的重鏈和輕鏈；和 ab)特異性結(jié)合第二個抗原的第二個全長抗體的重鏈和輕鏈，其中重鏈的N端通過肽接頭連接到輕鏈的C端；和 b)在允許合成所述抗體分子的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞；和 c)從所述培養(yǎng)物回收所述抗體分子。
22.特異性結(jié)合人IGF-IR和人EGFR的雙特異性抗體，其特征在于包含SEQID No :1、SEQ ID No 2和SEQ ID No 3的氨基酸序列。
23.特異性結(jié)合人IGF-IR和人EGFR的雙特異性抗體，其特征在于包含SEQID No :1、SEQ ID No 2和SEQ ID No 4的氨基酸序列。
24.特異性結(jié)合人IGF-IR和人EGFR的雙特異性抗體，其特征在于包含SEQID No :5、SEQ ID No 6和SEQ ID No 7的氨基酸序列。
25.特異性結(jié)合人IGF-IR和人EGFR的雙特異性抗體，其特征在于包含SEQID No :5、SEQ ID No 6和SEQ ID No 8的氨基酸序列。
26.根據(jù)權(quán)利要求22至25的雙特異性抗體，其中用糖鏈在Asn297糖基化抗體，其中糖鏈中巖藻糖的量是65%或更低。
27.特異性結(jié)合人VEGF和人ANG-2的雙特異性抗體，其特征在于包含SEQID No :9、SEQ ID No 10和SEQ ID No 11的氨基酸序列。
28.特異性結(jié)合人VEGF和人ANG-2的雙特異性抗體，其特征在于包含SEQID No :9、SEQ ID No 10和SEQ ID No 12的氨基酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及雙特異性抗體、其生產(chǎn)方法、含有所述抗體的藥物組合物及其用途。
文檔編號C07K16/28GK102946902SQ201180016218
公開日2013年2月27日 申請日期2011年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月26日
發(fā)明者U·布林克曼, R·克羅斯代爾, H·杜爾, C·克萊因, E·科佩茨基, W·勞, J·T·雷古拉, J·M·尚策, P·烏馬納, K·瓦薩 申請人:羅切格利卡特公司