專利名稱：：化學(xué)合成的HSV2病毒gD糖蛋白胞外區(qū)基因片段及其表達、應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明化學(xué)合成的HSV2病毒gD糖蛋白胞外區(qū)基因片段及其表達、應(yīng)用涉及的是化學(xué)合成的HSV2病毒gD糖蛋白胞外區(qū)的全新基因片段，利用基因工程技術(shù)，制備重組HSV2病毒gD糖蛋白。通過計算機分析，篩選出含強抗原表位的HSV2病毒的gD糖蛋白胞外區(qū)片段，選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，化學(xué)合成全新的基因序列，利用基因工程技術(shù)表達，表達的蛋白可用于疫苗及HSV2病毒抗體或抗原的檢測等，本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)、疫苗和診斷試劑領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：單純皰疹病毒(Herpessimplexvirus,HSV)是最早發(fā)現(xiàn)的人類皰疹病毒，容易導(dǎo)致復(fù)發(fā)性感染和潛伏感染，對人體危害嚴重，分為HSV-1及HSV-2兩個血清型。1型單純皰疹病毒主要引起口面部感染、眼部感染和皰疹性腦炎等；而2型主要引起生殖器感染，并且和女性宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)。近年HSV2的感染顯著增多，約占該病的10%40%。目前藥物治療HSV感染時常出現(xiàn)相應(yīng)耐藥性，所以研制疫苗是切實可行的有效方法，它能使機體在抗HSV感染免疫中，發(fā)揮體液免疫和細胞免疫功能來消除HSV感染。至今已研制了多種HSV疫苗，已有兩種HSV糖蛋白疫苗進入III期臨床試驗，即Chiron公司研制的重組gD2/gB2糖蛋白與MF59佐劑配伍而成的疫苗以及GlaxoSmithKline(GSK)公司開發(fā)的重組gD2糖蛋白與另一佐劑(3-de-0-?；瘑瘟姿犷愔珹和明礬)配伍而成的疫苗，這兩種疫苗均有一定的保護作用，但臨床效果有限。國內(nèi)目前對HSV疫苗的研究，主要集中在DNA核酸疫苗的探索研究方面。目前認為HSV基因組有34個基因，編碼70多種蛋白質(zhì)，其中胞膜糖蛋白正式命名的有12種，它們以獨特或復(fù)合體的形式在HSV復(fù)制循環(huán)及病毒的感染致病中發(fā)揮不同的作用。其中g(shù)D由HSV的US6基因編碼，是病毒胞膜的主要成分，對于病毒與細胞穩(wěn)定結(jié)合具有重要意義，促進病毒胞膜和細胞間的溶解，介導(dǎo)病毒的胞間擴散、釋放。同時gD蛋白在病毒的復(fù)制和剌激中和抗體的產(chǎn)生中起重要作用，也是宿主細胞免疫和體液免疫反應(yīng)的主要耙標之一，因此HSV2gD糖蛋白是構(gòu)建HSV基因疫苗理想的目的基因。HSV2病毒gD糖蛋白基因全長1185bp，編碼312個氨基酸序列的胞外區(qū)、54個氨基酸序列的跨膜區(qū)、28氨基酸序列的胞內(nèi)區(qū)。研究表明，為增強編碼抗原蛋白的免疫原性，可去除其部分功能性編碼序列，特別在完整抗原蛋白對宿主具有毒性或免疫抑制作用的情況下，對抗原蛋白進行截短表達就尤其重要。而截短后的gD基因構(gòu)建的疫苗，與用完整gD基因構(gòu)建的疫苗對HSV2病毒攻擊具有相同的保護作用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的針對上述不足之處提供一種化學(xué)合成的HSV2病毒gD糖蛋白胞外區(qū)基因片段及其表達、應(yīng)用，是化學(xué)合成的HSV2病毒gD糖蛋白胞外區(qū)的全新基因片段，利用基3因工程技術(shù)，制備重組HSV2病毒gD糖蛋白胞外區(qū)片段。通過計算機分析，篩選出含強抗原表位的HSV2病毒gD糖蛋白胞外區(qū)片段，第1個氨基酸到第286個氨基酸，共286個氨基酸，選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，化學(xué)合成全新的基因序列，利用基因工程技術(shù)表達該基因。表達的蛋白可用于疫苗、HSV2病毒抗體或抗原的檢測及用于免疫制備抗HSV2病毒單抗和多抗等。化學(xué)合成的HSV2病毒gD糖蛋白胞外區(qū)基因片段及其表達、應(yīng)用是采取以下步驟實施的1.HSV2病毒gD糖蛋白胞外區(qū)抗原表位的篩選及其基因片段的化學(xué)合成利用ANTHEWIN等軟件，通過計算機分析HSV2病毒gD糖蛋白的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)gD糖蛋白的N端(第l氨基酸到第286氨基酸)含有較強的抗原決定簇。選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，化學(xué)合成全新的基因序列，并且在5'端增加了HindIII酶切位點(下畫線部分)，轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列(GCCGCCACC)，起始密碼子(ATG)，人IgGk輕鏈信號肽(波浪線部分)，8XHis標簽及TEV蛋白酶酶切位點(gaaaacctgtacttccagggt)，在3'端增加了終止密碼子(TAA)和BamHI酶切位點(下畫線部分)，使該基因片段易于克隆至質(zhì)粒pCEP4內(nèi)的HindIII和BamHI酶切位點內(nèi)，并且使gD蛋白更易于表達和純化。篩選的HSV2病毒gD糖蛋白內(nèi)的抗原表位氨基酸序列(第l個氨基酸到第286個氨基酸):LysTyrAlaLeuAlaAspProSerLeuLysMetAlaAspProAsnArgPheArgGlyLysAsnLeuProValLeuAspGinLeuThrAspProProGlyValLysArgValTyrHislieGinProSerLeuGluAspProPheGinProProSerlieProlieThrValTyrTyrAlaValLeuGluArgAlaCysArgSerValLeuLeuHisAlaProSerGluAlaProGinlieValArgGlyAlaSerAspGluAlaArgLysHisThrTyrAsnLeuThrlieAlaTrpTyrArgMetGlyAspAsnCysAlalieProlieThrValMetGluTyrThrGluCysProTyrAsnLysSerLeuGlyValCysProlieArgThrGinProArgTrpSerTyrTyrAspSerPheSerAlaValSerGluAspAsnLeuGlyPheLeuMetHisAlaProAlaPheGluThrAlaGlyThrTyrLeuArgLeuValLyslieAsnAspTrpThrGlulieThrGinPhelieLeuGluHisArgAlaArgAlaSerCysLysTyrAlaLeuProLeuArglieProProAlaAlaCysLeuThrSerLysAlaTyrGinGlnGlyValThrValAspSerlieGlyMetLeuProArgPhelieProGluAsnGinArgThrValAlaLeuTyrSerLeuLyslieAlaGlyTrpHisGlyProLysProProTyrThrSerThrLeuLeuProProGluLeuSerAspThrThrAsnAlaThrGinProGluLeuValProGluAspProGluAspSerAlaLeuLeuGluAspProAlaGlyThrVal化學(xué)合成的含HSV2病毒gD糖蛋白胞外區(qū)抗原表位基因的DNA序列(987bp)AAGCTTGCCGCCACCATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGACATCATCACCATCACCATCACCATGAAMCCTGTACTTCCAGGGTAAGTACGCTCTGGCCGATCCTAGCCTGAAGATGGCTGATCCTAACCGCTTCAGAGGTAAGMCCTGCCTGTGCTGGACCAGCTGACCGACCCTCCTGGCGTGAAGAGAGTGTACCACATTCAGCCTAGCCTGGAGGACCCTTTCCAGCCTCCTAGCATTCCTATCACCGTGTACTACGCCGTGCTGGAGAGAGCCTGTCGCAGCGTGCTGCTGCACGCTCCTAGCGAGGCTCCTCAGATCGTGAGAGGTGCT4AGCGACGMGCCAGGAAGCACACCTACAACCTGACCATCGCCTGGTACAGGATGAACTGTGCTATCCCTATCACCGTGATGGAGTACACCGAGTGTCCCTACAACMGGGCGTGTGTCCTATCCGCACCCAGCCTAGGTGGAGCTACTACGACAGCTTCAGCAGCGAGGACAACCTGGGCTTCCTGATGCACGCTCCTGCCTTCGAGACCGCTGGCCTGAGGCTGGTGAAGATCAACGACTGGACCGAGATCACCCAGTTCATCCTGGAGGCC綠GCCAGCTGTAAGTACGCTCTGCCTCTGAGAATCCCTCCTGCCGCTTGTTCCMGGCCTACCAGCAAGGCGTGACCGTGGACAGCATCGGTATGCTGCCTCGCCCTGAGAACCAGAGGACCGTGGCTCTGTACAGCCTGAAGATCGCTGGCTGGCACAAGCCTCCTTACACCAGCACTCTGCTGCCTCCTGAGCTGAGCGACACCACCAACCAGCCTGAGCTGGTGCCTGAGGACCCTGAGGACAGCGCTCTGCTGGAGGACCCTACCGTGTAAGGATCC2.表達HSV2病毒gD糖蛋白胞外區(qū)片段重組質(zhì)粒的構(gòu)建提取質(zhì)粒pCEP4，用HindIII和BamHI雙酶切，電泳后回收酶切的質(zhì)粒大片段，溶于去離子水內(nèi)。同樣用HindIII和BamHI雙酶切化學(xué)合成的HSV2病毒gD糖蛋白基因片段，電泳回收后，溶于去離子水內(nèi)。取等摩爾濃度的上述兩種酶切后DNA片段，在同一離心管內(nèi)用T4DNA連接酶連接，使HSV2病毒gD糖蛋白基因片段插入到真核質(zhì)粒pCEP4內(nèi)的HindIII和BamHI位點之間，構(gòu)成重組真核表達載體pCEP4-gD2。3.重組質(zhì)粒的篩選與鑒定將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，涂布含氨芐青霉素(100ug/ml)LB平板，置37°C過夜。次日隨機挑取轉(zhuǎn)化菌落和1個對照菌(質(zhì)粒pCEP4轉(zhuǎn)化菌)，分別提取質(zhì)粒，以提取的質(zhì)粒為模板，PCR擴增HSV2病毒gD糖蛋白胞外區(qū)基因片段，含HSV2病毒gD糖蛋白胞外區(qū)基因片段的陽性重組質(zhì)粒，應(yīng)擴增出長約987bp的基因片段。將含有外源基因的質(zhì)粒進行DNA序列分析，序列分析證實重組質(zhì)粒含有合成的HSV2病毒gD糖蛋白基因片段，序列完全lH確AAGCTTGCCGCCACCATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGACATCATCACCATCACCATCACCATGMAACCTGTACTTCCAGGGTAAGTACGCTCTGGCCGATCCTAGCCTGAAGATGGCTGATCCTMCCGCTTCAGAGGTAAGAACCTGCCTGTGCTGGACCAGCTGACCGACCCTCCTGGCGTGAAGAGAGTGTACCACATTCAGCCTAGCCTGGAGGACCCTTTCCAGCCTCCTAGCATTCCTATCACCGTGTACTACGCCGTGCTGGAGAGAGCCTGTCGCAGCGTGCTGCTGCACGCTCCTAGCGAGGCTCCTCAGATCGTGAGAGGTGCTAGCGACGMGCCAGGAAGCACACCTACMCCTGACCATCGCCTGGTACAGGATGGGTGACAACTGTGCTATCCCTATCACCGTGATGGAGTACACCGAGTGTCCCTACAACAAGAGCCTGGGCGTGTGTCCTATCCGCACCCAGCCTAGGTGGAGCTACTACGACAGCTTCAGCGCTGTGAGCGAGGACAACCTGGGCTTCCTGATGCACGCTCCTGCCTTCGAGACCGCTGGCACCTACCTGAGGCTGGTGAAGATCAACGACTGGACCGAGATCACCCAGTTCATCCTGGAGCACAGAGCCAGAGCCAGCTGTAAGTACGCTCTGCCTCTGAGAATCCCTCCTGCCGCTTGTCTGACCTCCAAGGCCTACCAGCAAGGCGTGACCGTGGACAGCATCGGTATGCTGCCTCGCTTCATCCCTGAGAACCAGAGGACCGTGGCTCTGTACAGCCTGAAGATCGCTGGCTGGCACGGTCCTMGCCTCCTTACACCAGCACTCTGCTGCCTCCTGAGCTGAGCGACACCACCAACGCCACTCAGCCTGAGCTGGTGCCTGAGGACCCTGAGGACAGCGCTCTGCTGGAGGACCCTGCTGGTACCGTGTAAGGATCC構(gòu)建的重組質(zhì)粒表達HSV2的病毒gD糖蛋白胞外區(qū)片段(286個氨基酸)，在其N端添加了8XHis標簽(8個氨基酸)及TEV蛋白酶酶切位點(7個氨基酸)，全長301個氨基酸，其氨基酸序列如下<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>4.重組質(zhì)粒的真核轉(zhuǎn)染與細胞表達上清的蛋白檢測提取陽性重組質(zhì)粒pCEP4-gD2，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法對HEK293細胞進行轉(zhuǎn)染，37t:，5%C02溫箱培養(yǎng)48小時后，收集細胞上清進行SDS-PAGE電泳檢測，同時以1:10000稀釋的anti-His抗體對帶有His標簽的蛋白的表達情況進行WesternBlot檢測，轉(zhuǎn)染細胞表達相對分子量約為46kDa的HSV2病毒gD重組糖蛋白，而陰性對照質(zhì)粒pCEP4無此蛋白帶。5.表達的HSV2病毒gD糖蛋白的純化將Ni-S印harose6FastFlow親和層析柱連接至常壓層析系統(tǒng)，先用平衡液沖洗平衡，細胞上清液加Ni-S印harose6FastFlow凝膠室溫結(jié)合，上柱后收集穿透液。用平衡緩沖液洗滌柱子，接著用含500mM咪唑的洗脫緩沖液洗脫目的蛋白，SDS-PAGE電泳及WesternBlot檢測目的蛋白。6.ELISA檢測純化的HSV2病毒gD糖蛋白的抗原性將純化的重組蛋白用PBS倍比稀釋，并將陰性對照以同樣濃度稀釋后包被酶聯(lián)板，羊抗HSV2+HSV2多抗作為一抗，兔抗山羊IgG-HRP作為二抗，間接酶聯(lián)免疫法檢測純化蛋白gD2的抗原性和特異性。結(jié)果顯示(表1)表達的重組蛋白具有較好的抗原性和特異性。7.ELISA檢測純化的HSV2病毒gD糖蛋白的免疫原性1)HSV2病毒gD糖蛋白抗血清的制備將純化的重組蛋白與福氏佐劑混合后分別于第1，3周腹腔注射免疫小鼠(陰性對照組注射PBS)，并于第3，5周眼眶采血。血液37。C放置lh后4。C過夜，2000rpm離心20分鐘，取上清，4°C，12000rpm離心20分鐘，取上清即得HSV2病毒gD糖蛋白的抗血清。2)HSV2病毒gD糖蛋白抗血清效價檢測將純化的重組蛋白用PBS按1:IOO稀釋后包被酶聯(lián)板，抗血清梯度稀釋后作為一抗，二抗用羊抗小鼠IgG-HRP，間接酶聯(lián)免疫法測抗血清效價，陽性血清能與HSV2病毒gD糖蛋白反應(yīng)，陰性血清則不能。間接ELISA結(jié)果顯示(表2)表達的重組蛋白具有較好的免疫原性。8.將表達的HSV2病毒gD糖蛋白片段，用于疫苗、HSV2病毒抗體或抗原的檢測及用于免疫制備抗HSV2病毒單抗和多抗等。9.將合成的HSV2病毒gD糖蛋白基因片段與其他基因片段連接，以融合蛋白的形式進行表達、制備。上述方法制備的HSV2病毒gD糖蛋白胞外區(qū)片段在制備HSV2病毒亞單位疫苗及檢測試劑中的應(yīng)用。化學(xué)合成的HSV2病毒gD糖蛋白胞外區(qū)的基因片段，可利用細菌、酵母細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞及轉(zhuǎn)基因動植物進行重組表達、制備。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有的優(yōu)點1.本發(fā)明表達的HSV2病毒gD糖蛋白胞外區(qū)片段用作抗原，制備HSV2病毒抗體的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，具有生產(chǎn)較安全、成本低、與其他病毒交叉反應(yīng)少等優(yōu)點。2.HSV2病毒的gD糖蛋白是病毒胞膜的主要成分，在病毒的復(fù)制和剌激中和抗體的產(chǎn)生中起重要作用，也是宿主細胞免疫和體液免疫反應(yīng)的主要靶標之一，因此HSV2病毒gD糖蛋白是構(gòu)建HSV疫苗理想的目的基因。本發(fā)明選擇了其強抗原表位，利用基因工程技術(shù)表達制備，為研制基因工程疫苗奠定基礎(chǔ)?；蚬こ桃呙绨踩⒊杀镜?。3.本研究采用真核細胞表達系統(tǒng)，表達的蛋白產(chǎn)物能正確地完成折疊、磷酸化、糖基化、二硫鍵形成、?；?、蛋白酶加工等蛋白質(zhì)翻譯后加工過程，得到的重組蛋白有較高的生物學(xué)活性。4.本發(fā)明根據(jù)篩選出的HSV2病毒的gD糖蛋白胞外區(qū)片段氨基酸序列，選用真核及原核細胞均偏愛的密碼子，化學(xué)合成全新的基因序列，并且在N端添加人IgGk輕鏈信號肽，適宜在哺乳動物細胞中高表達。5.本發(fā)明構(gòu)建的表達的HSV2病毒的gD糖蛋白的工程細胞，蛋白表達量高，可溶性好，易于純化，并且具有較好的抗原性和免疫原性。以下將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步說明圖1是表達HSV2病毒的gD糖蛋白的重組質(zhì)粒構(gòu)建流程圖。圖2是1%的Agarose凝膠檢測4個重組子的PCR擴增產(chǎn)物。Lane1:以化學(xué)合成含HSV2病毒gD糖蛋白胞外區(qū)抗原表位基因的DNA序列為模板PCR擴增產(chǎn)物，陽性對照；Lane2:以空質(zhì)粒pCEP4為模板PCR擴增產(chǎn)物，陰性對照；Lane3-6:1-4號轉(zhuǎn)化子PCR擴增產(chǎn)物，其中1，2，3，4號轉(zhuǎn)化子均擴增出987bp的目的基因片段，即圖內(nèi)箭頭標示的位置；LaneM:DL2000Marker(TaKaRa)。圖3是1%的Agarose凝膠檢測陽性重組子的PCR擴增產(chǎn)物和酶切鑒定產(chǎn)物。Lane7M:250bpMarker(TaKaRa)Lane1:3號陽性重組子質(zhì)粒電泳;Lane2:3號陽性重組子酶切鑒定產(chǎn)物；。圖4是表達重組HSV2病毒gD糖蛋白的細胞上清WesternBlot檢測。LaneM:標準分子量蛋白Marker;Lane1:Multiple-tag，陽性對照；Lane2:空質(zhì)粒pCEP4轉(zhuǎn)染的細胞上清，陰性對照；Lane3:轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pCEP4-gD2的細胞上清。圖5是純化的重組HSV2病毒gD糖蛋白WesternBlot檢測。LaneM:標準分子量蛋白Marker;Lane1:純化后的重組HSV2病毒gD糖蛋白；Lane2:空質(zhì)粒pCEP4轉(zhuǎn)染的細胞上清，陰性對照。具體實施例方式本發(fā)明實施方式的詳細說明HSV2病毒的gD糖蛋白抗原表位的分析、基因合成及載體構(gòu)建通過計算機分析HSV2病毒的gD糖蛋白的全部氨基酸序列，篩選出HSV2病毒gD糖蛋白內(nèi)的強抗原表位，選用原核及真核均偏愛的密碼子，化學(xué)合成HSV2病毒的gD糖蛋白含強抗原表位的全新基因片段。將基因片段克隆至質(zhì)粒pCEP4內(nèi)的HindIII/BamHI位點，構(gòu)建重組真核表達載體pCEP4-gD2。材料與方法1.菌種與質(zhì)粒大腸桿菌DH5a及真核表達載體pCEP4由本實驗室保存。2.試劑和儀器PrimerSTARHSDNAPolymerase,dNTP，HindIII，BamHI，T4DNA連接酶，質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒為TaKaRa公司產(chǎn)品。TAE電泳緩沖液、SDS-PAGE蛋白電泳試劑等由本室配制(配方參考《精編分子生物學(xué)實驗指南》)。PCR擴增儀；高速冷凍離心機(美國Beckman公司)；瓊脂糖凝膠電泳裝置；蛋白電泳裝置(Bio-Rad公司)；脫色搖床(江蘇興化市分析儀器廠)。3.基因片段的合成由公司幫助合成。4.表達HSV2病毒gD糖蛋白胞外區(qū)片段重組質(zhì)粒的構(gòu)建提取質(zhì)粒pCEP4，用HindIII和BamHI雙酶切，電泳后回收酶切的質(zhì)粒大片段，溶于去離子水內(nèi)。同樣用HindIII和BamHI雙酶切化學(xué)合成的HSV2病毒gD糖蛋白基因片段，電泳回收后，溶于去離子水內(nèi)。取等摩爾濃度的上述兩種酶切后DNA片段，在同一離心管內(nèi)用T4DNA連接酶連接，使HSV2病毒gD糖蛋白基因片段插入到真核質(zhì)粒pCEP4內(nèi)的HindIII和BamHI位點之間，構(gòu)成重組真核表達載體pCEP4-gD2。5.重組質(zhì)粒的篩選與鑒定將上步連接的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布含氨芐青霉素(100ug/ml)的固體LB培養(yǎng)基上，置37t:培養(yǎng)過夜。次日隨機挑選4個轉(zhuǎn)化子菌落(分別標記為1-4號)和1個對照菌(質(zhì)粒pCEP4轉(zhuǎn)化菌)，分別接種到含3ml液體LB培養(yǎng)基(含氨芐青霉素100ug/ml)的試管內(nèi)，置37t:振蕩培養(yǎng)5小時，取菌液lml，離心收菌。分別用50ul去離子水懸浮菌體，沸水煮5分鐘，4t:，12000rpm離心5分鐘，取上清8(內(nèi)有質(zhì)粒)2ul用作PCR模板，PCR擴增插入載體內(nèi)的HSV2病毒gD糖蛋白胞外區(qū)基因片段，PCR反應(yīng)濃度為質(zhì)粒模板2ul、HSV2病毒gD糖蛋白胞外區(qū)基因片段的正鏈引物PI(GCAAGCTTGCCGCCACCATGGAA)和負鏈引物P2(GCGGATCCTTACACGGTACCAGCAGGGTC)各lul、10Xpyrobestbuffer2.0ul、2.5mmol/LdNTP2.Oul、PrimerSTARHSDNA聚合酶0.5ul(1.25U)、去離子水11.5ul，總體積20ul。擴增條件為98。C預(yù)變性1分鐘，98。C10秒、55t:10秒、72t:l分鐘，30個循環(huán)，最后72t:延伸7分鐘。取PCR擴增產(chǎn)物5ul，用1.0%的Agarose凝膠檢測，陽性轉(zhuǎn)化子應(yīng)能擴增出9S7bp的目的片段，而空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌無此帶。用HindIII和BamHI酶雙酶切，重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物應(yīng)切處981bp的基因條帶。6.DNA序列分析用QIAGEN公司質(zhì)粒純化試劑盒純化質(zhì)粒，用DNA全自動測序儀測序。結(jié)果1.HSV2病毒的gD糖蛋白抗原表位篩選及基因片段的合成利用ANTHEWIN等軟件，通過計算機分析HSV2病毒的gD糖蛋白的全部氨基酸序列(GeneBank，登錄號NP_044536)，篩選出HSV2病毒的gD糖蛋白內(nèi)的強抗原表位，即從第1個氨基酸到第286個氨基酸，其氨基酸序列如下LysTyrAlaLeuAlaAspProSerLeuLysMetAlaAspProAsnArgPheArgGlyLysAsnLeuProValLeuAspGinLeuThrAspProProGlyValLysArgValTyrHislieGinProSerLeuGluAspProPheGinProProSerlieProlieThrValTyrTyrAlaValLeuGluArgAlaCysArgSerValLeuLeuHisAlaProSerGluAlaProGinlieValArgGlyAlaSerAspGluAlaArgLysHisThrTyrAsnLeuThrlieAlaTrpTyrArgMetGlyAspAsnCysAlalieProlieThrValMetGluTyrThrGluCysProTyrAsnLysSerLeuGlyValCysProlieArgThrGinProArgTrpSerTyrTyrAspSerPheSerAlaValSerGluAspAsnLeuGlyPheLeuMetHisAlaProAlaPheGluThrAlaGlyThrTyrLeuArgLeuValLyslieAsnAspTrpThrGlulieThrGinPhelieLeuGluHisArgAlaArgAlaSerCysLysTyrAlaLeuProLeuArglieProProAlaAlaCysLeuThrSerLysAlaTyrGinGlnGlyValThrValAspSerlieGlyMetLeuProArgPhelieProGluAsnGinArgThrValAlaLeuTyrSerLeuLyslieAlaGlyTrpHisGlyProLysProProTyrThrSerThrLeuLeuProProGluLeuSerAspThrThrAsnAlaThrGinProGluLeuValProGluAspProGluAspSerAlaLeuLeuGluAspProAlaGlyThrVal根據(jù)篩選的HSV2病毒gD糖蛋白內(nèi)的抗原表位氨基酸序列，選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，化學(xué)合成全新的基因序列，并且在5'端增加了HindIII酶切位點(下畫線部分)，轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列(GCCGCCACC)，起始密碼子(ATG)，人IgGk輕鏈信號肽(波浪線部分)，8XHis標簽及TEV蛋白酶酶切位點(gaaaacctgtacttccagggt)，在3，端增加了終止密碼子(TAA)和BamHI酶切位點(下畫線部分)，使該基因片段易于克隆至質(zhì)粒pCEP4內(nèi)的HindIII和BamHI酶切位點內(nèi)，并且使gD蛋白更易于表達和純化?；瘜W(xué)合成的含HSV2病毒gD糖蛋白抗原表位基因的DNA序列(987bp)如下AAGCTTGCCGCCACCATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGACATCATCACCATCACCATCACCATGAAMCCTGTACTTCCAGGGTAAGTACGCTCTGGCCGATCCTAGCCTGAAGATGGCTGATCCTAACCGCTTCAGAGGTAAGMCCTGCCTGTGCTGGACCAGCTGACCGACCCTCCTGGCGTGMGAGAGTGTACCACATTCAGCCTAGCCTGGAGGACCCTTTCCAGCCTCCTAGCATTCCTATCACCGTGTACTAC'GCCGTGCTGGAGAGAGCCTGTCGCAGCGTGCTGCTGCACGCTCCTAGCGAGGCTCCTCAGATCGTGAGAGGTGCTAGCGACGMGCCAGGAAGCACACCTACAACCTGACCATCGCCTGGTACAGGATGGGTGACAACTGTGCTATCCCTATCACCGTGATGGAGTACACCGAGTGTCCCTACAACMGAGCCTGGGCGTGTGTCCTATCCGCACCCAGCCTAGGTGGAGCTACTACGACAGCTTCAGCGCTGTGAGCGAGGACAACCTGGGCTTCCTGATGCACGCTCCTGCCTTCGAGACCGCTGGCACCTACCTGAGGCTGGTGAAGATCAACGACTGGACCGAGATCACCCAGTTCATCCTGGAGCACAGAGCCAGAGCCAGCTGTAAGTACGCTCTGCCTCTGAGAATCCCTCCTGCCGCTTGTCTGACCTCCAAGGCCTACCAGCAAGGCGTGACCGTGGACAGCATCGGTATGCTGCCTCGCTTCATCCCTGAGAACQVGAGGACCGTGGCTCTGTACAGCCTGAAGATCGCTGGCTGGCACGGTCCTAAGCCTCCTTACACCAGCACTCTGCTGCCTCCTGAGCTGAGCGACACCACCAACGCCACTCAGCCTGAGCTGGTGCCTGAGGACCCTGAGGACAGCGCTCTGCTGGAGGACCCTGCTGGTACCGTGTAAGGATCC2.表達HSV2病毒gD糖蛋白胞外區(qū)截短形式片段重組質(zhì)粒的構(gòu)建將目的基因克隆到pCEP4載體的HindIII和BamHI酶切位點之間，構(gòu)成重組真核表達載體pCEP4-gD2。(構(gòu)建流程見圖1)。3.重組質(zhì)粒的篩選與鑒定第1、2、3、4號4個轉(zhuǎn)化子擴增出987bp的目的基因片段，而含質(zhì)粒pCEP4的對照菌沒有擴增出該基因片段(見圖2)。提取3號重組子的質(zhì)粒，用HindIII和BamHI酶雙酶切，酶切產(chǎn)物出現(xiàn)981bp的目的基因條帶，與預(yù)期大小相符(見圖3)。提取3號重組子的質(zhì)粒，測定質(zhì)粒內(nèi)的HSV2病毒gD糖蛋白基因序列，DNA序列分析證實，重組質(zhì)粒含有合成的HSV2病毒gD糖蛋白基因片段，序列完全正確:AAGCTTGCCGCCACCATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGACATCATCACCATCACCATCACCATGAAAACCTGTACTTCCAGGGTAAGTACGCTCTGGCCGATCCTAGCCTGAAGATGGCTGATCCTAACCGCTTCAGAGGTAAGMCCTGCCTGTGCTGGACCAGCTGACCGACCCTCCTGGCGTGAAGAGAGTGTACCACATTCAGCCTAGCCTGGAGGACCCTTTCCAGCCTCCTAGCATTCCTATCACCGTGTACTACGCCGTGCTGGAGAGAGCCTGTCGCAGCGTGCTGCTGCACGCTCCTAGCGAGGCTCCTCAGATCGTGAGAGGTGCTAGCGACGAAGCCAGGAAGCACACCTACAACCTGACCATCGCCTGGTACAGGATGGGTGACAACTGTGCTATCCCTATCACCGTGATGGAGTACACCGAGTGTCCCTACAACAAGAGCCTGGGCGTGTGTCCTATCCGCACCCAGCCTAGGTGGAGCTACTACGACAGCTTCAGCGCTGTGAGCGAGGACAACCTGGGCTTCCTGATGCACGCTCCTGCCTTCGAGACCGCTGGCACCTACCTGAGGCTGGTGAAGATCAACGACTGGACCGAGATCACCCAGTTCATCCTGGAGCACAGAGCCAGAGCCAGCTGTAAGTACGCTCTGCCTCTGAGAATCCCTCCTGCCGCTTGTCTGACCTCCMGGCCTACCAGCAAGGCGTGACCGTGGACAGCATCGGTATGCTGCCTCGCTTCATCCCTGAGAACCAGAGGACCGTGGCTCTGTACAGCCTGMGATCGCTGGCTGGCACGGTCCTAAGCCTCCTTACACCAGCACTCTGCTGCCTCCTGAGCTGAGCGACACCACCAACGCCACTCAGCCTGAGCTGGTGCCTGAGGACCCTGAGGACAGCGCTCTGCTGGAGGACCCTGCTGGTACCGTGTAA構(gòu)建的重組質(zhì)粒表達HSV2的病毒gD糖蛋白片段(286個氨基酸)，在其N端添加了8XHis標簽(8個氨基酸)及TEV蛋白酶酶切位點(7個氨基酸)，全長301個氨基酸，其氨基酸序列如下HisHisHisHisHisHisHisHisGluAsnLeuTyrPheGinGlyLysTyrAlaLeuAlaAspProSerLeuLysMetAlaAspProAsnArgPheArgGlyLysAsnLeuProValLeuAspGlnLeuThrAspProProGlyValLysArgValTyrHislieGinProSerLeuGluAspProPheGlnProProSerlieProlieThrValTyrTyrAlaValLeuGluArgAlaCysArgSerValLeuLeuHisAlaProSerGluAlaProGinlieValArgGlyAlaSerAspGluAlaArgLysHisThrTyrAsnLeuThrlieAlaTrpTyrArgMetGlyAspAsnCysAlalieProlieThrValMetGluTyrThrGluCysProTyrAsnLysSerLeuGlyValCysProlieArgThrGlnProArgTrpSerTyrTyrAspSerPheSerAlaValSerGluAspAsnLeuGlyPheLeuMetHisAlaProAlaPheGluThrAlaGlyThrTyrLeuArgLeuValLyslieAsnAspTrpThrGlulieThrGinPhelieLeuGluHisArgAlaArgAlaSerCysLysTyrAlaLeuProLeuArglieProProAlaAlaCysLeuThrSerLysAlaTyrGinGinGlyValThrValAspSerlleGlyMetLeuProArgPhelieProGluAsnGinArgThrValAlaLeuTyrSerLeuLyslleAlaGlyTrpHisGlyProLysProProTyrThrSerThrLeuLeuProProGluLeuSerAspThrThrAsnAlaThrGinProGluLeuValProGluAspProGluAspSerAlaLeuLeuGluAspProAlaGlyThrVal重組質(zhì)粒的真核轉(zhuǎn)染、細胞表達上清的蛋白檢測與純化提取陽性重組質(zhì)粒pCEP4-gD2，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法對HEK293細胞進行轉(zhuǎn)染。收集細胞上清，根據(jù)表達HSV2病毒gD糖蛋白的氨基酸序列，分析其理化特性，確定適當?shù)募兓椒?。我們所表達的HSV2病毒gD糖蛋白在N端添加了8XHis標簽，可很方便用鎳瓊脂糖凝膠分離，因此我們決定采用親和層析法，用NiS印harose6FastFlow凝膠進行純化。具體步驟如下材料和方法1.主要試劑Lipofectamine2000為invitrogen公司產(chǎn)品，NiS印harose6FastFlow凝膠為GEHeathcare公司產(chǎn)品，小鼠抗His單抗、羊抗小鼠IgG-HRP為金斯特公司產(chǎn)品。其它試劑為國產(chǎn)或進口分析純試劑。2.重組質(zhì)粒pCEP4-gD2真核轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前一天以0.5-2X107孔的密度接種HEK293細胞至24孔板，37°C，5%C02溫箱培養(yǎng)過夜，使其達到孔底面積90-95%時進行轉(zhuǎn)染。取重組質(zhì)粒pCEP4-gD25ul(200ng/ul)稀釋于50ul無血清DMEM培養(yǎng)基中(設(shè)對照空質(zhì)粒pCEP4)，溫和混勻。取Lipofectamine20002ul稀釋于50ul無血清DMEM培養(yǎng)基中，溫和混勻，室溫靜置5分鐘。將稀釋的重組質(zhì)粒和脂質(zhì)體溫和混勻，室溫靜置20分鐘后加入到含有HEK293細胞的24孔板中，100ul/孑L溫和混勻，37°C，5%C02溫箱培養(yǎng)48小時后，收集細胞上清進行檢測。3.WesternBlot檢測表達重組HSV2病毒gD糖蛋白的細胞上清收集轉(zhuǎn)染細胞上清進行SDS-PAGE電泳，PVDF膜濕轉(zhuǎn)，100V，1小時，4。C封閉過夜(5%milk-PBST)。PBST洗膜3次，每次10分鐘，小鼠抗His單抗(lmg/ml)l:10000稀釋11于封閉液中，室溫孵育2小時，洗膜3X10分鐘，羊抗小鼠IgG-HRP1:10000稀釋于封閉液中，室溫孵育1小時，洗膜3X10分鐘，加發(fā)光底物反應(yīng)3分鐘，暗室中壓片曝光。4.重組HSV2病毒gD糖蛋白的純化上清溶液加已經(jīng)平衡的NiS印harose6FastFlow凝膠3ml，混勻后4°C結(jié)合過夜，上樣，收集穿透液。用十倍柱床體積的平衡液(IXPBS，O.5mol/LNaCl+，20mmo1/Limidazole,pH7.4)洗滌柱子，接著將lml洗脫液(1XPBS，0.5mol/LNaCl，500mmol/Limidazole,pH7.4)加入膠體中，靜置20分鐘后洗脫目的蛋白，即為純化的HSV2病毒gD糖蛋白胞外區(qū)片段。5.WesternBlot檢測純化的重組HSV2病毒gD糖蛋白對純化的重組HSV2病毒gD糖蛋白進行12%SDS-PAGE膠電泳，19mA，80分鐘。PVDF膜濕轉(zhuǎn)，IOOV，1小時，4t:封閉過夜(5%milk-PBST)。PBST洗膜3次，每次10分鐘，小鼠抗His單抗(lmg/ml)1:10000稀釋于封閉液中，室溫孵育2小時，洗膜3X10分鐘，羊抗小鼠IgG-HRPl:10000稀釋于封閉液中，室溫孵育1小時，洗膜3X10分鐘，加發(fā)光底物反應(yīng)3分鐘，暗室中壓片曝光。結(jié)果1.WesternBlot檢測表達重組HSV2病毒gD糖蛋白的細胞上清經(jīng)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HEK293細胞明顯表達出重組HSV2病毒gD糖蛋白，表達產(chǎn)物以可溶性形式存在于細胞上清中，分子量約46kDa，與預(yù)期大小相符。結(jié)果表明，重組HSV2病毒gD糖蛋白表達成功(見圖4)。2.WesternBlot檢測純化的重組HSV2病毒gD糖蛋白將從NiS印harose6FastFlow凝膠柱上洗脫的蛋白進行WesternBlot分析，蛋白帶分子量約46kDa，與預(yù)期大小相符。結(jié)果表明，重組HSV2病毒gD糖蛋白純化成功(見圖5)。純化HSV2病毒的gD糖蛋白的鑒定及應(yīng)用將純化的重組HSV2病毒gD糖蛋白抗原，通過間接ELISA試驗方法檢測，以鑒定表達的HSV2病毒gD糖蛋白的抗原性和特異性。再用純化的重組HSV2病毒gD糖蛋白抗原免疫小鼠，通過間接ELISA試驗方法檢測小鼠血清中抗體濃度，以鑒定表達的HSV2病毒gD糖蛋白的免疫原性。材料和方法1.主要試劑及材料山羊抗HSV1+HSV2多抗為Abcam公司產(chǎn)品，兔抗山羊IgG-HRP為博士德公司產(chǎn)品，完全福氏佐劑和不完全福氏佐劑為SIGMA公司產(chǎn)品。其它試劑為國產(chǎn)或進口分析純試劑。實驗動物4周齡雄性昆明小鼠，SPF級，購自北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院實驗動物中心。2.重組HSV2病毒gD糖蛋白的鑒定采用間接ELISA檢測重組HSV2病毒gD糖蛋白的抗原性?；静襟E為用1XPBS(pH7.4)按1:25-1:400倍比稀釋純化的重組HSV2病毒gD糖蛋白，包被酶聯(lián)板(陰性對照取正常HEK293細胞上清)，每孔100ul，4t:過夜。次日用封閉液(1XPBS，1%小牛血清)封閉，每孔130ul，室溫2小時。將山羊抗HSV1+HSV2多抗，用樣本稀釋液(1XPBS，o.1%小牛血清)1:500稀釋后，分別加至封閉后的酶聯(lián)板孔內(nèi)，每孔iooui，37t:反應(yīng)i小時，用PBST液(IXPBS，O.5%吐溫-20)洗5遍后，加1:40000稀釋的兔抗山羊IgG-HRP，每孔100ul，37。C反應(yīng)30分鐘，PBST洗5遍，加底物TMB溶液，每孔100ul，37。C避光顯色10分鐘，每孔加50ul1N鹽酸終止反應(yīng)，用酶聯(lián)儀測定A450值。3.HSV2病毒gD糖蛋白抗血清的制備將純化的重組HSV2病毒gD糖蛋白與福氏佐劑等體積混合后分別于第1，3周(第1周用完全福氏佐劑，第3周用不完全福氏佐劑)腹腔注射免疫小鼠，1.25ug/只/次(陰性對照組注射等體積PBS)，并于第3，5周眼眶采血。血液37t:放置1小時后fC過夜，2000rpm離心20分鐘，取上清，4°C，12000rpm離心20分鐘，取上清即得HSV2病毒gD糖蛋白的抗血清。4.HSV2病毒gD糖蛋白抗血清效價檢測采用間接ELISA檢測重組HSV2病毒gD糖蛋白的免疫原性?；静襟E為用1XPBS按l:100稀釋純化的重組HSV2病毒gD糖蛋白，包被酶聯(lián)板，每孔100ul，4t:過夜。次日用封閉液封閉酶聯(lián)板，每孔130ul，室溫2小時。將抗血清用樣本稀釋液按l:50，1:500，1:5000稀釋后，分別加至封閉后的酶聯(lián)板孔內(nèi)，每孔100ul，37t:反應(yīng)l小時，用PBST洗5遍后，力口l:IOOOO稀釋的羊抗小鼠IgG-HRP，每孔100ul，37。C反應(yīng)30分鐘，PBST洗5遍，加底物TMB溶液每孔100ul，37t:避光顯色10分鐘，加50ul1N鹽酸終止反應(yīng)，用酶聯(lián)儀測定A450值。陽性血清應(yīng)能與HSV2病毒gD糖蛋白反應(yīng)，陰性血清則不能。結(jié)果1.重組HSV2病毒gD糖蛋白抗原性鑒定用間接ELISA法檢測純化的重組蛋白的抗原性，結(jié)果顯示(表l)蛋白濃度與其OD值之間有良好的線性關(guān)系，說明表達的重組HSV2病毒gD糖蛋白有較好的抗原性和特異性。2.重組HSV2病毒gD糖蛋白免疫原性鑒定用間接ELISA法檢測純化的重組蛋白的免疫原性，結(jié)果顯示(表2)第一次免疫后抗體水平較低，第二次免疫后抗體水平明顯上升，第三次免疫后抗體水平與第二次持平，說明表達的重組HSV2病毒gD糖蛋白有良好的免疫原性，為的研制奠定了基礎(chǔ)。表1表達蛋白抗原性檢測的ELISA實驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>化學(xué)合成的HSV2病毒gD糖蛋白胞外區(qū)基因片段序列表〈110〉李越?！?20〉化學(xué)合成的HSV2病毒gD糖蛋白胞外區(qū)基因片段及其表達、應(yīng)用〈160>2〈210>1〈211>858〈212>DNA〈213>人工序列〈220〉〈221>CDS〈222〉(1).(858)〈223〉人工合成的全新基因片段，編碼含強抗原表位的HSV2病毒gD糖蛋白胞外區(qū)286個氨基酸片段?！?00〉1MGTAGGCTCTGGCCGATCCTAGCCTGAAGATGGCTGATCCTAACCGCTTCAGAGGTAAG60MCCTGCCTGTGCTGGACCAGCTGACCGACCCTCCTGGCGTGAAGAGAGTGTACCACATT120CAGCCTAGCCTGGAGGACCCTTTCCAGCCTCCTAGCATTCCTATCACCGTGTACTACGCC180GTGCTGGAGAGAGCCTGTCGCAGCGTGCTGCTGCACGCTCCTAGCGAGGCTCCTCAGATC240GTGAGAGGTGCTAGCGACGAAGCCAGGAAGCACACCTACMCCTGACCATCGCCTGGTAC300AGGATGGGTGACAACTGTGCTATCCCTATCACCGTGATGGAGTACACCGAGTGTCCCTAC360MCMGAGCCTGGGCGTGTGTCCTATCCGCACCCAGCCTAGGTGGAGCTACTACGACAGC420TTCAGCGCTGTGAGCGAGGACMCCTGGGCTTCCTGATGCACGCTCCTGCCTTCGAGACC■GCTGGCACCTACCTGAGGCTGGTGAAGATCAACGACTGGACCGAGATCACCCAGTTCATC540CTGGAGCACAGAGCCAGAGCCAGCTGTAAGTACGCTCTGCCTCTGAGAATCCCTCCTGCC600GCTTGTCTGACCTCCMGGCCTACCAGCMGGCGTGACCGTGGACAGCATCGGTATGCTG660CCTCGCTTCATCCCTGAGMCCAGAGGACCGTGGCTCTGTACAGCCTGMGATCGCTGGC720TGGCACGGTCCTAAGCCTCCTTACACCAGCACTCTGCTGCCTCCTGAGCTGAGCGACACC780ACCMCGCCACTCAGCCTGAGCTGGTGCCTGAGGACCCTGAGGACAGCGCTCTGCTGGAG840GACCCTGCTGGTACCGTG0136]〈210〉2:0137]<211>2860138]〈212>PRT:0139]〈213〉HSV2病毒gD蛋白胞外區(qū)片段:0140]〈220〉:0141]〈223〉含強抗原表位的HSV2病毒gD糖蛋白胞外區(qū)片段，第1個氨基酸_第286個氨基酸，共286個氨基酸。:0142]0143]GlyLys0144]200145]Hislie0146]40:0147]TyrAla:0148]60:0149]Ginlie:0150]800151]TrpTyr0152]000153]ProTyr0154]20:0155]AspSer:0156]400157]GluThr〈400>2LysTyrAlaLeu1AsnLeuProVal21GinProSerLeu41ValLeuGluArg61ValArgGlyAla81ArgMetGlyAsp101AsnLysSerLeu121Phe141SerAlaValAlaAspProSerLeuLysMetAlaAsp510LeuAspGinLeuThrAspProProGly2530GluAspProPheGinProProSerlie4550AlaCysArgSerValLeuLeuHisAla6570SerAspGluAlaArgLysHisThrTyr8590AsnCysAlalieProlieThrValMet105110GlyValCysProlieArgThrGinPro125130SerGluAspAsnLeuGlyPheLeuMet145150ProAsnArgPheArg15ValLysArgValTyr35ProlieThrValTyr55ProSerGluAlaPro75AsnLeuThrlieAla95GluTyrThrGluCys115ArgTrpSerTyrTyr135HisAlaProAlaPhe155160Phelie180ProAla200MetLeu220AlaGly240AspThr260LeuGlu280AlaGlyThrTyrLeuArg161165LeuGluHisArgAlaArg181185LeuValLyslieAsnAspTrpThrGlulieThrGin170175AlaSerCysLysTyrAlaLeuProLeuArgliePro190195AlaCysLeuThrSerLysAlaTyrGinGinGlyValThrValAspSerlieGly201205210215ProArgPhelieProGluAsnGinArgThrValAlaLeuTyrSerLeuLyslie221225230235TrpHisGlyProLysProProTyrThrSerThrLeuLeuProProGluLeuSer241245250255ThrAsnAlaThrGinProGluLeuValProGluAspProGluAspSerAlaLeu261265AspProAlaGlyThrVal28127027權(quán)利要求一種化學(xué)合成的HSV2病毒gD糖蛋白胞外區(qū)基因片段，該基因片段編碼含強抗原表位的HSV2病毒的gD糖蛋白胞外區(qū)片段，即第1個氨基酸至第286個氨基酸，共286個氨基酸，化學(xué)合成的基因序列全長858bp，序列如下AAGTACGCTCTGGCCGATCCTAGCCTGAAGATGGCTGATCCTAACCGCTTCAGAGGTAAGAACCTGCCTGTGCTGGACCAGCTGACCGACCCTCCTGGCGTGAAGAGAGTGTACCACATTCAGCCTAGCCTGGAGGACCCTTTCCAGCCTCCTAGCATTCCTATCACCGTGTACTACGCCGTGCTGGAGAGAGCCTGTCGCAGCGTGCTGCTGCACGCTCCTAGCGAGGCTCCTCAGATCGTGAGAGGTGCTAGCGACGAAGCCAGGAAGCACACCTACAACCTGACCATCGCCTGGTACAGGATGGGTGACAACTGTGCTATCCCTATCACCGTGATGGAGTACACCGAGTGTCCCTACAACAAGAGCCTGGGCGTGTGTCCTATCCGCACCCAGCCTAGGTGGAGCTACTACGACAGCTTCAGCGCTGTGAGCGAGGACAACCTGGGCTTCCTGATGCACGCTCCTGCCTTCGAGACCGCTGGCACCTACCTGAGGCTGGTGAAGATCAACGACTGGACCGAGATCACCCAGTTCATCCTGGAGCACAGAGCCAGAGCCAGCTGTAAGTACGCTCTGCCTCTGAGAATCCCTCCTGCCGCTTGTCTGACCTCCAAGGCCTACCAGCAAGGCGTGACCGTGGACAGCATCGGTATGCTGCCTCGCTTCATCCCTGAGAACCAGAGGACCGTGGCTCTGTACAGCCTGAAGATCGCTGGCTGGCACGGTCCTAAGCCTCCTTACACCAGCACTCTGCTGCCTCCTGAGCTGAGCGACACCACCAACGCCACTCAGCCTGAGCTGGTGCCTGAGGACCCTGAGGACAGCGCTCTGCTGGAGGACCCTGCTGGTACCGTG。2.權(quán)利要求1所述的化學(xué)合成的HSV2病毒gD糖蛋白胞外區(qū)基因片段，利用細菌、酵母細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞及轉(zhuǎn)基因動植物進行重組表達，制備HSV2病毒的gD糖蛋白胞外區(qū)286個氨基酸蛋白片段，序列如下LysTyrAlaLeuAlaAspProSerLeuLysMetAlaAspProAsnArgPheArgGlyLysAsnLeuProValLeuAspGinLeuThrAspProProGlyValLysArgValTyrHislieGinProSerLeuGluAspProPheGinProProSerlieProlleThrValTyrTyrAlaValLeuGluArgAlaCysArgSerValLeuLeuHisAlaProSerGluAlaProGinlieValArgGlyAlaSerAspGluAlaArgLysHisThrTyrAsnLeuThrlieAlaTrpTyrArgMetGlyAspAsnCysAlaIleProlieThrValMetGluTyrThrGluCysProTyrAsnLysSerLeuGlyValCysProlieArgThrGinProArgTrpSerTyrTyrAspSerPheSerAlaValSerGluAspAsnLeuGlyPheLeuMetHisAlaProAlaPheGluThrAlaGlyThrTyrLeuArgLeuValLyslieAsnAspTrpThrGlulieThrGinPheIleLeuGluHisArgAlaArgAlaSerCysLysTyrAlaLeuProLeuArglieProProAlaAlaCysLeuThrSerLysAlaTyrGinGinGlyValThrValAspSerlleGlyMetLeuProArgPhelieProGluAsnGinArgThrValAlaLeuTyrSerLeuLyslieAlaGlyTrpHisGlyProLysProProTyrThrSerThrLeuLeuProProGluLeuSerAspThrThrAsnAlaThrGinProGluLeuValProGluAspProGluAspSerAlaLeuLeuGluAspProAlaGlyThrVal。3.權(quán)利要求2所述方法制備的HSV2病毒gD糖蛋白胞外區(qū)片段在制備HSV2病毒疫苗及檢測試劑中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明化學(xué)合成的HSV2病毒gD糖蛋白胞外區(qū)基因片段及其表達、應(yīng)用涉及基因工程技術(shù)、疫苗和診斷試劑領(lǐng)域。本發(fā)明通過計算機分析，篩選出含強抗原表位的HSV2病毒gD糖蛋白胞外區(qū)片段，第1個氨基酸至第286個氨基酸，共286個氨基酸，選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，化學(xué)合成抗原表位的全新基因序列，利用基因工程技術(shù)表達該基因片段、制備HSV2病毒gD糖蛋白的強抗原表位片段及HSV2病毒gD糖蛋白的抗血清。表達的HSV2病毒gD糖蛋白可用于疫苗、HSV2病毒抗體或抗原的檢測及用于免疫制備抗HSV2病毒單抗和多抗等。文檔編號G01N33/53GK101787371SQ20091003467公開日2010年7月28日申請日期2009年9月7日優(yōu)先權(quán)日2009年9月7日發(fā)明者李琳,李素芹,李越希,潘明潔,潘英,王忠燦,王正茂,管文燕申請人:李越希