專利名稱：在家蠶細胞內(nèi)表達人源化糖蛋白轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)座載體及構(gòu)建法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及將PiggyBac轉(zhuǎn)座載體應用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因家蠶細胞系。具體地講,本發(fā)明涉及構(gòu)建一個用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因家蠶細胞系的新型piggyBac轉(zhuǎn)座載體。該載體可用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因家蠶細胞系，并通過Bac-to-Bac系統(tǒng)表達人源化糖蛋白。該載體包括一個GFP的報告基因和/或一個Neomycin的抗性篩選基因，以及1_4個糖基轉(zhuǎn)移酶基因(GnT2，GalT,ST3, ST6)。
背景技術(shù)：
piggyBac (以前叫作IFP2)轉(zhuǎn)座子，是一個來源于鱗翅目昆蟲的DNA型轉(zhuǎn)座子，在結(jié)構(gòu)上與II型短的插入重復因子相關(guān)，在分類上屬于第二類型，這一類型的因子包括hobo、hermers、mariner、P、Tcl 和 AC 因子。piggyBac 轉(zhuǎn)座子最初是在桿狀病毒(Baculovirus)侵染 Trichoplusia ni 昆蟲 TN-368 細胞株系時，從 Galleria mellonella (GmMNPV)或Autographa californica (AcMNPV)核多角體病毒內(nèi)首次分離得到的。piggyBac轉(zhuǎn)座子是一個自主因子，長2476bp，含有一個RNA聚合酶II啟動子區(qū)和一個聚腺苷酸信號，該信號的側(cè)面是一個可讀編碼框(0RF)，編碼I個單一的長約2.1kb的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，即I個68kD的轉(zhuǎn)座酶，該轉(zhuǎn)座酶是轉(zhuǎn)座子高頻率的切出和轉(zhuǎn)座所需的。piggyBac轉(zhuǎn)座子的末端是長13bp的反向重復序列(ITR),其內(nèi)側(cè)各有一段間隔區(qū)(spacer),但并不對稱(左端長3bp，右端長31bp)，再靠內(nèi)側(cè)是各長19bp的對稱的亞末端反向重復(STR)。piggyBac轉(zhuǎn)座子反向重復序列的5’末端以2_3個C堿基結(jié)束，3’末端的G堿基在切出位點的選擇過程中起作用。PiggyBac轉(zhuǎn)座子總是在TTAA目標位點處插入，因而被歸納為TTAA-特殊的可轉(zhuǎn)移因子家族。

目前，piggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)已成為在昆蟲中使用最廣的轉(zhuǎn)座子,它已被證明能夠在
5個目(鱗翅目、雙翅目、膜翅目、鞘翅目和直翅目)的20多種昆蟲中轉(zhuǎn)座。piggyBac轉(zhuǎn)座主要用于昆蟲的轉(zhuǎn)基因研究，其攜帶的基因大多為可見的報告基因，如ZsGFP，DsRedl，EYFP等熒光標記。它們受位置影響比較小，可以很方便地測試轉(zhuǎn)座效率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種可用于家蠶細胞內(nèi)表達人源化糖蛋白的轉(zhuǎn)基因新型轉(zhuǎn)座載體及其制備方法。為了解決上述技術(shù)問題,本發(fā)明利用piggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)，將一個GFP的報告基因和/或一個Neomycin的抗性篩選基因，以及4個人源化糖基轉(zhuǎn)移酶基因(即GnT2、β 4GalT、ST3和ST6)，轉(zhuǎn)座至家蠶細胞基因組上以獲得一株新型的家蠶細胞系，并進一步利用Bac-to-Bac系統(tǒng),在該新型細胞系內(nèi)表達人源化的糖蛋白。作為本發(fā)明的在家蠶細胞內(nèi)表達人源化糖蛋白的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)座載體的一種改進該載體中包含一個GFP報告基因以及以下4個糖基轉(zhuǎn)移酶基因中的至少2個GnT2、β 4GalT、ST3 和 ST6。
該載體的構(gòu)建方法為將GFP報告基因以及以下4個糖基轉(zhuǎn)移酶基因中的至少2個GnT2、β 4GalT、ST3和ST6分別通過酶切方式克隆進pXL-BacII載體中。作為本發(fā)明的在家蠶細胞內(nèi)表達人源化糖蛋白的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)座載體的另一種改進該載體包含一個Neomycin篩選基因以及以下4個糖基轉(zhuǎn)移酶基因中的至少2個GnT2、β 4GalT,ST3 和 ST6。該載體的構(gòu)建方法為將Neomycin篩選基因以及以下4個糖基轉(zhuǎn)移酶基因中的至少2個GnT2、β 4GalT、ST3和ST6分別通過酶切方式克隆進pXL-BacII載體中。作為本發(fā)明建立轉(zhuǎn)基因家蠶細胞系的另一種改進將上述構(gòu)建所得的兩種載體與Helper質(zhì)粒按按照3 :3 1的質(zhì)量比轉(zhuǎn)染家蠶細胞，通過G418篩選，形成細胞單克隆化的克隆島，再經(jīng)傳代培養(yǎng)，構(gòu)成轉(zhuǎn)基因家蠶細胞系。綜上所述,本發(fā)明的優(yōu)點如下，構(gòu)建新型的piggyBac轉(zhuǎn)座載體，能應用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因家蠶細胞。該載體具有高效性和穩(wěn)定性，并且具有一個GFP的報告基因或一個Neomycin的抗性篩選基因,便于檢測和篩選。
·
備注說明GnT2 (beta-1, 2_N_ 乙酸葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶，beta-1, 2-N_acetylglucosaminyltransferase),β 4GalT (beta-1, 4_ 半乳糖轉(zhuǎn)移酶，beta-1, 4-galactosy I transferase),ST3 (alpha-2, 3_ 唾液酸轉(zhuǎn)移酶 4, alpha-2, 3-sialyltransferase 4)，ST6 (alpha-2, 6_ 唾液酸轉(zhuǎn)移酶 I, alpha-2, 6-sialyltranferase I)。


下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式
作進一步詳細說明。圖1 是 pXL-BacII_GalT/GFP/ST6 轉(zhuǎn)座載體示意圖；圖2 是 pXL-BacII_Neo/ST3/GnT2 轉(zhuǎn)座載體示意圖；圖3是轉(zhuǎn)座載體轉(zhuǎn)染家蠶細胞后I天的熒光圖；圖4是細胞單克隆化后的克隆島圖；圖5是表達人源化糖蛋白的家香轉(zhuǎn)基因細胞系圖；A :正常細胞，白光；B:正常細胞，熒光；C :轉(zhuǎn)基因細胞，白光；D:轉(zhuǎn)基因細胞，熒光。
具體實施例方式本發(fā)明通過以下實施例作進一步闡述。下述實施例中的通過酶切方式克隆可按照《分子克隆實驗指南》告知的常規(guī)技術(shù)進行操作。實施例1、pXL-BacII_GalT/GFP/ST6轉(zhuǎn)座載體的構(gòu)建1、β 4GalT、ST6、A3啟動子、SV40PolyA終止子基因擴增引物設計根據(jù)已知的人的MGalT和ST6基因序列，通過Primer 5. O軟件設計引物(SEQID NO I 4)，根據(jù)pSL1180-A3質(zhì)粒和pSilencer 4. l-CMV-neo質(zhì)粒分別設計兩對引物擴增 A3，一對引物擴增 SV40PolyA (SEQ ID NO 3，4)。
具體如下@4GalT基因擴增引物序列β 4GalT-F CTAATTCAAGATGAGGCTTCGGGAGCCGCTCCβ 4GalT-R TCGAAATCTCCTAGCTCGGTGTCCCGATGTCCACTGST6基因擴增引物序列ST6-F GCGGCCGCATGATTCACACCAACCTGST6-R CCGCGGTTAGCAGTGAATGGTCCGA3啟動子基因擴增引物序列A3-F CCGGAATTCTGCGCGTTACCATATATGGTGAA3-R GAAGCCTCATCTTGAATTAGTCTGCAAGAAAAG2、0 4GalT、ST6、A3 啟動子、SV40PolyA 終止子基因克隆本實驗中，大腸桿菌Escherichia coli TGl為本實驗室保存,人胚肺成纖維細胞HFL-1購自上海中科院細胞庫，pSL1180-A3、pSL1180及pXL-BacII質(zhì)粒為本實驗室保存，pSilencer 4. l-CMV-neo 質(zhì)粒購自 Applied Biosystems。以抽提得到的人胚肺成纖維細胞HFL-1細胞總RNA為模板，取1. 5 mL Eppendof管，加入總 RNA 4 μ g, oligo d(T) 18 primer I μ L, dNTP Mixture I μ L 加 DEPC 水至 10μ L，輕輕混勻，離心30秒 后，65°C水浴5 min，迅速置于冰上冷卻30秒，離心3_5秒，力口5XPrimeScript II Buffer 4 μ L, RNase inhibitor (40 U/μ L) I μ L, PrimeScript IIRTase I μ L(200 U/μ I )，再加水補齊至20 μ L。輕輕混勻，42°C水浴60 min，然后70 V水浴15 min，冰上冷卻，所得的產(chǎn)物即為cDNA，置于_20°C保存。以上述cDNA及pSL1180-A3質(zhì)?；騪Silencer 4. l-CMV-neo質(zhì)粒為模板，采用上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成的引物，進行PCR反應，分別擴增β 4GalT、ST6、A3啟動子、SV40PolyA終止子基因。3、將報告基因GFP及兩個糖基轉(zhuǎn)移酶基因(β 4GalT和ST6)分別通過酶切方式克隆進pXL-BacII載體中。具體構(gòu)建步驟如下分別以0 4GalT、A3啟動子、SV40PolyA終止子基因擴增引物，PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)1. 0%瓊脂糖凝膠電泳得到A3，GalT, PolyA。割膠回收，再用BamHI和XbaI雙酶切，并將之連入經(jīng)相同酶酶切處理的pXL-BacII載體中，得pXL-BacII/A3-GALT-PolyA，記為pXL-1II ；XbaI和NotI雙酶切pMD_18T/A3 (ST6)及pSL1180質(zhì)粒，然后分別回收A3片段及pSL1180載體片段，并用T4連接酶將兩者連接起來，過夜，轉(zhuǎn)化TGl感受態(tài)細胞，挑取單克隆，酶切鑒定得質(zhì)粒PSL/A3 (ST6);再用XhoI和SacII雙酶切pMD-18T/PolyA，將切下的PolyA片段按上述方法連入經(jīng)同樣酶切處理的pSL/A3(ST6)載體，得pSL/A3 (ST6)-PolyA質(zhì)粒。再用NotI和SacII雙酶切pMD-18T/ST6，將切下的ST6片段連入經(jīng)同樣酶切得pSL/A3(ST6)-PolyA 質(zhì)粒中，得 pSL/A3(ST6)-ST6-PolyA 質(zhì)粒；最后用 XbaI 和 XhoI 酶切 pSL/A3 (ST6) -ST6-P01yA質(zhì)粒，將切下的片段連入經(jīng)同樣酶切得pXL_BacII質(zhì)粒中，得到質(zhì)粒pXL-BacII/A3(ST6)- ST6_PolyA，記為 pXL-1V ；將XhoI和XbaI雙酶切得到的小片段連入經(jīng)同樣酶切的pXL_III中得載體pXL-1I1-1V ；BamHI單切質(zhì)粒pXL-BacII_GFP釋放GFP表達框，將之連入pXL-1I1-1V中得載體 pXL-1I1-1V -GFP,即 pXL-BacII_GalT/GFP/ST6 轉(zhuǎn)座載體(如圖1)。實施例2、pXL-BacI1-Neo/ST3/GnT2轉(zhuǎn)座載體的構(gòu)建1、Gnt2、ST3、A3啟動子、SV40PoIyA終止子基因擴增弓丨物設計根據(jù)已知的人的GnT2和ST3基因序列，通過Primer 5. O軟件設計引物(SEQ IDNO 5，6)，根據(jù)本實驗室保存的pSL1180-A3質(zhì)粒和pSilencer 4. l-CMV-neo質(zhì)粒分別設計兩對引物擴增A3，一對引物擴增SV40PolyA (SEQ ID NO 3，4)。2、GanT2、ST3、A3啟動子、SV40PolyA終止子基因克隆本實驗中，大腸桿菌Escherichia coli TGl為本實驗室保存,人胚肺成纖維細胞HFL-1購自上海中科院細胞庫，pSL1180-A3、pSL1180及pXL-BacII質(zhì)粒為本實驗室保存，pSilencer 4. l-CMV-neo 質(zhì)粒購自 Applied Biosystems。以抽提得到的人胚肺成纖維細胞HFL-1細胞總RNA為模板，取1. 5 mL Eppendof管，加入總 RNA 4 μ g, oligo d(T) 18 primer I μ L, dNTP Mixture I μ L 加 DEPC 水至 10μ L，輕輕混勻，離心30秒后，65°C水浴5 min，迅速置于冰上冷卻30秒，離心3_5秒，力口5XPrimeScript II Buffer 4 μ L, RNase inhibitor (40 U/μ L) I μ L, PrimeScript IIRTase I μ L(200 U/μ I)，再加水補齊至20 μ L。輕輕混勻，42°C水浴60 min，然后70 V水浴15 min，冰上冷卻，所得的產(chǎn)物即為cDNA，置于_20°C保存。以上述cDNA及pSL1180-A3質(zhì)?；騪Silencer 4. l-CMV-neo質(zhì)粒為模板，采用上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合`成的引物，進行PCR反應，分別擴增GanT2、ST3、A3啟動子、SV40PolyA終止子基因。3、將篩選基因Neomycinlr及兩個糖基轉(zhuǎn)移酶基因(GanT2和ST3)分別通過酶切方式克隆進PXL-BacII載體中。具體構(gòu)建步驟如下EcoRV和NheI雙酶切pMD_18T/A3 (GnT2) 及pSL1180質(zhì)粒，然后分別回收A3 (GnT2)片段及pSL1180載體片段，并用T4連接酶將兩者連接起來，過夜，轉(zhuǎn)化TGl感受態(tài)細胞，挑取單克隆，酶切鑒定得質(zhì)粒PSL/A3 (GnT2);再用XhoI和HpaI雙酶切pMD_18T/PolyA,將切下的PolyA片段按上述方法連入經(jīng)同樣酶切處理的pSL/A3 (GnT2)載體，得pSL/A3 (GnT2)-PolyA質(zhì)粒。再用NheI和HpaI雙酶切pMD_18T/GnT2,將切下的GnT2片段連入經(jīng)同樣酶切得pSL/A3 (GnT2) -PolyA質(zhì)粒中，得pSL/A3 (GnT2) -GnT2_PolyA質(zhì)粒；最后用EcoRV和XhoI酶切PSL/A3(GnT2)-GnT2-PolyA質(zhì)粒，將切下的片段連入經(jīng)同樣酶切得pXL-BacII 質(zhì)粒中，得到質(zhì)粒 pXL_BacII/A3 (GnT2)-GnT2_PolyA，記為 pXL-1。以 A3 (ST3)-F/R, ST3 (ST3) _F/R，PolyA (ST3)-F/R 為引物，pMD_18T/A3 (GnT2)，PMD-18T/ST3，pMD-18T/PolyA為模板，PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)1. 0%瓊脂糖凝膠電泳得到A3(ST3)，ST3 (ST3)，PolyA (ST3)?；厥者@三條帶，再以 A3 (ST3) -F 為上游引物，PolyA (ST3) -R為下游引物，三條帶的回收產(chǎn)物各O. 5微升為模板，再次PCR擴增，割膠回收，再用BamHI和XbaI雙酶切，并將之連入經(jīng)相同酶酶切處理的pXL-BacII載體中，得pXL-BacII/A3-ST3-PolyA，記為 pXL-1I。BamHI和XbaI雙酶切pXL_II得到的小片段連入經(jīng)同樣酶切的pXL_I中得載體pXL-1-1I ；EcoRI 單切質(zhì)粒 pigA3GFP-hIGF-1e_neo 釋放 Neo 表達框，將之連入 pXL-1-1I中得載體 pXL-1-11-Neo，即 pXL-BacII_Neo/ST3/GnT2 轉(zhuǎn)座載體(如圖 2)。實施例3、轉(zhuǎn)基因家蠶細胞系構(gòu)建策略1、將實施例1和實施例2中構(gòu)建所得的載體與Helper質(zhì)粒按一定比例轉(zhuǎn)染家蠶細胞系將正常家蠶細胞鋪于6孔板中，于2ml加有10%胎牛血清(四季青)的TC-100培養(yǎng)基中，28°C進行培養(yǎng)，在細胞密度達到90%以上后，將實施例1和實施例2中構(gòu)建所得的載體與Helper質(zhì)粒按照3 :3 :1(質(zhì)量比)的比例共轉(zhuǎn)染正常家蠶細胞，于2ml無血清的TC-100培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，6小時后換完全培養(yǎng)基(B卩加有10%胎牛血清的TC-100培養(yǎng)基)培養(yǎng)，24h后可檢測到綠色熒光蛋白表達(如圖3);說明轉(zhuǎn)染成功，質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染進細胞中。備注說明為得到一個穩(wěn)定的細胞系，一方面需要Neomycin篩選基因的抗氨基糖苷類抗生素G418能力，即有該基因的轉(zhuǎn)基因細胞能在加有G418的培養(yǎng)基中生存，而不具有該基因的細胞(即未轉(zhuǎn)入該基因的細胞)則不能生存，這樣就可以將少量的轉(zhuǎn)有外源基因的轉(zhuǎn)基因細胞從大量的非·轉(zhuǎn)基因細胞中篩選出來。而GFP由于其可觀察性(即在熒光顯微鏡下隨時可觀察其熒光情況，從而間接反應轉(zhuǎn)基因的情況)，所以通常轉(zhuǎn)基因研究中加上該標記基因。當兩個基因(GFP，Neomycin)分別位于兩個載體上時，實施例1和實施例2中構(gòu)建所得的載體必須共同使用；當然也可以考慮將這兩個基因與其他糖基轉(zhuǎn)移酶基因構(gòu)建在同一個載體上，這樣轉(zhuǎn)染時就只需要一個轉(zhuǎn)座載體和一個helper質(zhì)粒了。2、建立轉(zhuǎn)基因家蠶細胞系轉(zhuǎn)座載體轉(zhuǎn)染細胞后，次日將細胞傳至24孔板中，孔中設有2ml培養(yǎng)基，于加有10%胎牛血清(四季青)的TC-100培養(yǎng)基中，28°C條件下進行培養(yǎng)，待細胞貼壁后，加上述確定的最佳篩選濃度(1000 ug/mL)的G418開始篩選(培養(yǎng)條件同上)。4_5天換一次培養(yǎng)基并加G418 (保持G418的濃度為1000 ug/mL)，篩選2周，形成細胞單克隆化的克隆島(如圖4)。2周后，用完全培養(yǎng)基懸浮細胞，計數(shù)，將細胞按每孔I個細胞傳至96孔板中，此時開始用特殊培養(yǎng)基(將正常細胞于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，待細胞匯合度達到80%時，換液，培養(yǎng)過夜之后收集培養(yǎng)液，通過濾器消毒，和新鮮的培養(yǎng)液按1:1混合，這樣得到的培養(yǎng)基命名為特殊培養(yǎng)基；此為公知技術(shù))培養(yǎng)細胞，同時G418濃度減半。待96孔板內(nèi)長滿細胞后，將之傳至48孔，待48孔板內(nèi)長滿后，將之傳至24孔板，以此類推，依次傳至12孔板，6孔板，最后傳至細胞培養(yǎng)瓶中，構(gòu)成轉(zhuǎn)基因家蠶細胞系(如圖5)。實施例4、利用具備N-糖基化途徑的轉(zhuǎn)基因家蠶細胞系表達糖基化蛋白上述轉(zhuǎn)入4個人源化糖基轉(zhuǎn)移酶基因的家蠶轉(zhuǎn)基因細胞的基礎上，通過糖基化蛋白表達和糖型鑒定的方法來驗證轉(zhuǎn)基因細胞的功能。在糖蛋白表達和檢測方面，利用正常BmN細胞和轉(zhuǎn)基因細胞分別表達糖基化蛋白一人丁酰膽堿酯酶(hBchE)，并利用基質(zhì)輔助激光解吸附飛行時間質(zhì)譜法(MALD1-T0F-MS)檢測細胞總糖糖型，來比較兩種細胞的差異，以達到驗證其糖基化作用的目的。結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因家蠶細胞可以與正常家蠶細胞一樣表達外源糖基化蛋白-人丁酰膽堿酯酶(hBchE);轉(zhuǎn)基因細胞和正常BmN細胞表達人丁酰膽堿酯酶后的細胞總糖糖型存在差異，正常BmN細胞有糖型結(jié)構(gòu)8種，轉(zhuǎn)基因細胞在此基礎上多了 5種糖型，其中3種是雜合型或復雜型，2種是高甘露糖型，說明轉(zhuǎn)基因細胞中的雜合型和復雜型N-糖鏈更接近于哺乳動物水平。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導出或聯(lián)想到的所有變形 ，均應認為是本發(fā)明的保護范圍。
<110〉浙江大學
<120>在家蠶細胞內(nèi)表達人源化糖蛋白轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)座載體及構(gòu)建法
<160〉 12
<210〉 I<211〉 32〈212〉 DNA<213>人T:序列
<220>
<223〉β 4GalT 基因擴增引物 β 4GalT-F<400〉 I
ctaattcaag atgauLiclic gggagccgct cc
<210> 2<211> 36<2i2> DNA<213〉人工序列
<220〉
<223> β 4GalT 基因擴增引物 β 4GalT-R<400〉 2
tcgaaatctc cta^ctciiizt gtccciiatet ccact^i
C*C5C/C5 OC
<210〉 3<211〉 26<212〉 DNA<213〉人工序列
<220>
<223〉ST6基Ud擴增引物序列ST6-F<400〉 3
gcggccgcat gattcacacc aacctg2o
<210〉 4<211〉 24

權(quán)利要求
1.在家蠶細胞內(nèi)表達人源化糖蛋白的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)座載體，其特征是該載體中包含一個GFP報告基因和/或一個Neomycin抗性篩選基因，還包含以下4個糖基轉(zhuǎn)移酶基因中的至少一個GnT2、β 4GalT、ST3 和 ST6。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在家蠶細胞內(nèi)表達人源化糖蛋白的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)座載體，其特征是該載體中包含一個GFP報告基因以及以下4個糖基轉(zhuǎn)移酶基因中的至少2個GnT2、β 4GalT,ST3 和 ST6。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在家蠶細胞內(nèi)表達人源化糖蛋白的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)座載體，其特征是該載體包含一個Neomycin篩選基因以及以下4個糖基轉(zhuǎn)移酶基因中的至少2個GnT2、β 4GalT, ST3 和 ST6。
4.如權(quán)利要求2所述的在家蠶細胞內(nèi)表達人源化糖蛋白的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)座載體的構(gòu)建方法，其特征是將GFP報告基因以及以下4個糖基轉(zhuǎn)移酶基因中的至少2個GnT2、β 4GalT、ST3和ST6分別通過酶切方式克隆進pXL_BacII載體中。
5.如權(quán)利要求3所述的在家蠶細胞內(nèi)表達人源化糖蛋白的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)座載體的構(gòu)建方法，其特征是將Neomycin篩選基因以及以下4個糖基轉(zhuǎn)移酶基因中的至少2個GnT2、β 4GalT、ST3和ST6分別通過酶切方式克隆進pXL_BacII載體中。
6.含人源化糖基轉(zhuǎn)移酶基因的家蠶轉(zhuǎn)基因細胞系，其特征是將權(quán)利要求2和權(quán)利要求3所述的兩種載體與Helper質(zhì)粒按照3 3 1的質(zhì)量比轉(zhuǎn)染家蠶細胞,通過G418篩選,形成細胞單克隆化的克隆島，再經(jīng)傳代培養(yǎng)，構(gòu)成轉(zhuǎn)基因家蠶細胞系。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種在家蠶細胞內(nèi)表達人源化糖蛋白的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)座載體，該載體中包含一個GFP報告基因和/或一個Neomycin抗性篩選基因，還包含以下4個糖基轉(zhuǎn)移酶基因中的至少一個GnT2、β4GalT、ST3和ST6。本發(fā)明還公開了含人源化糖基轉(zhuǎn)移酶基因的家蠶轉(zhuǎn)基因細胞系，將上述載體與Helper質(zhì)粒按照331的質(zhì)量比轉(zhuǎn)染家蠶細胞，通過G418篩選，形成細胞單克隆化的克隆島，再經(jīng)傳代培養(yǎng)，構(gòu)成轉(zhuǎn)基因家蠶細胞系。
文檔編號C12N15/66GK103045645SQ201210527989
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月5日
發(fā)明者繆云根, 胡嘉彪, 楊華軍, 周芳 申請人:浙江大學