專利名稱：：化學(xué)合成的HSV1病毒gD糖蛋白胞外區(qū)基因片段及其表達(dá)、應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明是化學(xué)合成的HSVl病毒gD糖蛋白胞外區(qū)的全新基因片段，利用基因工程技術(shù)，制備重組HSVl病毒gD糖蛋白。通過計(jì)算機(jī)分析，篩選出含強(qiáng)抗原表位的HSVl病毒的gD糖蛋白胞外區(qū)片段，選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，化學(xué)合成全新的基因序列，利用基因工程技術(shù)表達(dá)，表達(dá)的蛋白可用于疫苗及HSV1病毒抗體或抗原的檢測(cè)等，本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)、疫苗和診斷試劑領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：?jiǎn)渭儼捳畈《?Herpessimplexvirus,HSV)是最早發(fā)現(xiàn)的人類皰疹病毒，容易導(dǎo)致復(fù)發(fā)性感染和潛伏感染，對(duì)人體危害嚴(yán)重，分為HSV-l及HSV-2兩個(gè)血清型。l型單純皰疹病毒主要引起口面部感染、眼部感染和皰疹性腦炎等；而2型主要引起生殖器感染，并且和女性宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)。近年HSV1的感染顯著增多，約占該病的10%40%。目前藥物治療HSV感染時(shí)常出現(xiàn)相應(yīng)耐藥性，所以研制疫苗是切實(shí)可行的有效方法，它能使機(jī)體在抗HSV感染免疫中，發(fā)揮體液免疫和細(xì)胞免疫功能來(lái)消除HSV感染。至今已研制了多種HSV疫苗，已有兩種HSV糖蛋白疫苗進(jìn)入III期臨床試驗(yàn)，即Chiron公司研制的重組gD2/gB2糖蛋白與MF59佐劑配伍而成的疫苗以及GlaxoSmithKline(GSK)公司開發(fā)的重組gD2糖蛋白與另一佐劑(3-de-0-酰化單磷酸類脂A和明礬)配伍而成的疫苗，這兩種疫苗均有一定的保護(hù)作用，但臨床效果有限。國(guó)內(nèi)目前對(duì)HSV疫苗的研究，主要集中在DNA核酸疫苗的探索研究方面。目前認(rèn)為HSV基因組有34個(gè)基因，編碼70多種蛋白質(zhì)，其中胞膜糖蛋白正式命名的有12種，它們以獨(dú)特或復(fù)合體的形式在HSV復(fù)制循環(huán)及病毒的感染致病中發(fā)揮不同的作用。其中g(shù)D由HSV的US6基因編碼，是病毒胞膜的主要成分，對(duì)于病毒與細(xì)胞穩(wěn)定結(jié)合具有重要意義，促進(jìn)病毒胞膜和細(xì)胞間的溶解，介導(dǎo)病毒的胞間擴(kuò)散、釋放。同時(shí)gD蛋白在病毒的復(fù)制和刺激中和抗體的產(chǎn)生中起重要作用，也是宿主細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)的主要靶標(biāo)之一，因此HSVlgD糖蛋白是構(gòu)建HSV基因疫苗理想的目的基因。HSVl病毒gD糖蛋白基因全長(zhǎng)1185bp，編碼312個(gè)氨基酸序列的胞外區(qū)、54個(gè)氨基酸序列的跨膜區(qū)、28氨基酸序列的胞內(nèi)區(qū)。研究表明，為增強(qiáng)編碼抗原蛋白的免疫原性，可去除其部分功能性編碼序列，特別在完整抗原蛋白對(duì)宿主具有毒性或免疫抑制作用的情況下，對(duì)抗原蛋白進(jìn)行截短表達(dá)就尤其重要。而截短后的gD基因構(gòu)建的疫苗，與用完整gD基因構(gòu)建的疫苗對(duì)HSV1病毒攻擊具有相同的保護(hù)作用。故本研究通過計(jì)算機(jī)分析，我們篩選出含強(qiáng)抗原表位的HSVl病毒的gD糖蛋白胞外區(qū)片段，選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，化學(xué)合成全新的基因序列，利用基因工程技術(shù)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物具有較好的抗原性和免疫原性，表達(dá)的蛋白可用于疫苗及HSV1病毒抗體或抗原的檢測(cè)及用于免疫制備抗HSV1病毒單抗和多抗等。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明是化學(xué)合成的HSV1病毒gD糖蛋白胞外區(qū)的全新基因片段，利用基因工程技術(shù)，制備重組HSVl病毒gD糖蛋白胞外區(qū)片段。通過計(jì)算機(jī)分析，篩選出含強(qiáng)抗原表位的HSV1病毒gD糖蛋白胞外區(qū)片段，第1個(gè)氨基酸到第284個(gè)氨基酸，共284個(gè)氨基酸，選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，化學(xué)合成全新的基因序列，利用基因工程技術(shù)表達(dá)該基邁。表達(dá)的蛋白可用于疫苗、HSV1病毒抗體或抗原的檢測(cè)及用于免疫制備抗HSV1病毒單抗和多抗等。化學(xué)合成的HSV1病毒gD糖蛋白胞外區(qū)基因片段及其表達(dá)、應(yīng)用是采取以下步驟實(shí)施的1.HSV1病毒gD糖蛋白胞外區(qū)抗原表位的篩選及其基因片段的化學(xué)合成利用ANTHEWIN等軟件，通過計(jì)算機(jī)分析HSV1病毒gD糖蛋白的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)gD糖蛋白的N端(第1氨基酸到第284氨基酸)含有較強(qiáng)的抗原決定簇。選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，化學(xué)合成全新的基因序列，并且在5'端增加了Hindin酶切位點(diǎn)(下畫線部分)，轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列(GCCGCCACC),起始密碼子(ATG)，人IgGk輕鏈信號(hào)肽(波浪線部分)，8XHis標(biāo)簽及TEV蛋白酶酶切位點(diǎn)(gaaaacctgtacttccagggt)，在3'端增加了終止密碼子(TAA)和BamHI酶切位點(diǎn)(下畫線部分)，使該基因片段易于克隆至質(zhì)粒pCEP4內(nèi)的HindIII和BamHI酶切位點(diǎn)內(nèi)，并且使gD蛋白更易于表達(dá)和純化。篩選的HSV1病毒gD糖蛋白內(nèi)的抗原表位氨基酸序列(第1個(gè)氨基酸到第284個(gè)氨基酸)Lys丁yrAlaLeuAlaAspAlaSerLeuLysMetAlaAspProAsnArgPheArgGlyLysAspLeuProValLeuAspProLeuThrAspProProGlyValArgArgValTyrHislieGinAlaGlyLeuProAspProPheGinProProSerteuProlieThrValTyrTyrAlaValLeuGluArgAlaCysArgSerValLeuLeuAsnAlaProSerGluAlaProGinlieValArgGyAlaSerGluAspValArgLysGinProTyrAsnLeuThrlieAlaTrpPheArgMetGlyGlyAsnCysAlalieProlieThrValMetGluTyrThrGluCysSerTyrAsnLysSerLeuGlyAlaCysProlieArgThrGinProArgTrpAsnTyrTyrAspSerPheSerAlaValSerGluAspAsnLeuGlyPheLeuMetHisAlaProAlaPheGluThrAlaGlyThrTyrLeuArgLeuValLyslieAsnAspTrpThrGlulieThrGinPhelieLeuGluHisArgAlaLysGySerCysLysTyrAlaLeuProLeuArglieProProSerAlaCysLeuSerProGinAlaTyrGinGinGlyValThrValAspSerlieGlyMetLeuProArgPhelieProGluAsnGinArgThrValAlaValTyrSerLeuLyslieAlaGlyTrpHisGlyProLysAlaProTyrThrSerThrLeuLeuProProGluLeuSerGluThrProAsnAlaThrGinProGluLeuAlaProGluAspProGluAspSerAlaLeuLeuGluAspProValGly化學(xué)合成的含HSV1病毒gD糖蛋白胞外區(qū)抗原表位基因的DNA序列(981bp):A虹TTGCCGCCACCATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGACATCATCACCATCACCATCACCATGAAAACCTGTACTTCCAGGGTAAGTAC^5T^"^:GATGCTAGCCTGAAGATGGCTGATCCTAACCGCTTCAGAGGTAAGGACCTGCCTGTGCTGGACCAGCTGACCGACCCTCCTGGCGTGCGCAGAGTGTACCACATTCAGGCTGGTCTGCCTGACCCTTTCCAGCCTCCTAGCCTGCCTATCACCGTGTACTACGCCGTGCTGGAGAGAGCCTGTCGCAGCGTGCTGCTGAACGCTCCTAGCGAGGCTCCTCAGATCGTGAGAGGTGCTAGCGAAGACGTGAGGAAGCAGCCTTACAACCTGACCATCGCCTGGTTCAGGATGGGTGGTAACTGTGCTATCCCTATCACCGTGATGGAGTACACCGAGTGTTCTTACAACAAGAGCCTGGGCGCTTGTCCTA丁CCGCACCCAGCCTAGGTGGAACTACTACGACAGCTTCAGCGCTGTGAGCGAGGACAACCTGGGCTTCCTGATGCACGCTCCTGCCTTCGAGACCGCTGGCACCTACCTGAGGCTGGTGAAGATCAACGACTGGACCGAGATCACCCAGTTCATCCTGGAGCACAGAGCCAAGGGTAGCTGTAAGTACGCTCTGCCTCTGAGAATCCCTCCTAGCGCTTGTCTGAGCCCTCAGGCCTACCAGCAAGGCGTGACCGTGGACAGCATCGGTATGCTGCCTCGCTTCATCCCTGAGAACCAGAGGACCGTGGCTGTGTACAGCCTGAAGATCGCTGGCTGGCACGGTCCTAAGGCTCCTTACACCAGCACTCTGCTGCCTCCTGAGCTGAGCGAGACCCCTAACGCCACTCAGCCTGAGCTGGCTCCTGAGGACCCTGAGGACAGCGCTCTGCTGGAGGACCCTGTGGGTTAAGGATCC2.表達(dá)HSVl病毒gD糖蛋白胞外區(qū)片段重組質(zhì)粒的構(gòu)建提取質(zhì)粒pCEP4,用HindIII和BamHI雙酶切，電泳后回收酶切的質(zhì)粒大片段，溶于去離子水內(nèi)。同樣用HindIII和BamHI雙酶切化學(xué)合成的HSVl病毒gD糖蛋白基因片段，電泳回收后，溶于去離子水內(nèi)。取等摩爾濃度的上述兩種酶切后DNA片段，在同一離心管內(nèi)用T4DNA連接酶連接，使HSVl病毒gD糖蛋白基因片段插入到真核質(zhì)粒pCEP4內(nèi)的HindIII和BamHI位點(diǎn)之間，構(gòu)成重組真核表達(dá)載體pCEP4-gDl。3.重組質(zhì)粒的篩選與鑒定將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，涂布含氨芐青霉素(100ug/ml)LB平板，置37'C過夜。次日隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化菌落和1個(gè)對(duì)照菌(質(zhì)粒pCEP4轉(zhuǎn)化菌)，分別提取質(zhì)粒，以提取的質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增HSV1病毒gD糖蛋白胞外區(qū)基因片段，含HSV1病毒gD糖蛋白胞外區(qū)基因片段的陽(yáng)性重組質(zhì)粒，應(yīng)擴(kuò)增出長(zhǎng)約981bp的基因片段。將含有外源基因的質(zhì)粒進(jìn)行DNA序列分析，序列分析證實(shí)重組質(zhì)粒含有合成的HSVl病毒gD糖蛋白基因片段，序列完全正確AAGCTTGCCGCCACCATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGACATCATCACCATCACCATCACCATGAAAACCTGTACTTCCAGGGTAAGTACGCTCTGGCCGATGCTAGCCTGAAGATGGCTGATCCTAACCGCTTCAGAGGTAAGGACCTGCCTGTGCTGGACCAGCTGACCGACCCTCCTGGCGTGCGCAGAGTGTACCACATTCAGGCTGGTCTGCCTGACCCTTTCCAGCCTCCTAGCCTGCCTATCACCGTGTACTACGCCGTGCTGGAGAGAGCCTGTCGCAGCGTGCTGCTGAACGCTCCTAGCGAGGCTCCTCAGATCGTGAGAGGTGCTAGCGAAGACGTGAGGAAGCAGCCTTACAACCTGACCATCGCCTGGTTCAGGATGGGTGGTAACTGTGCTATCCCTATCACCGTGATGGAGTACACCGAGTGTTCTTACAACAAGAGCCTGGGCGCTTGTCCTATCCGCACCCAGCCTAGGTGGAACTACTACGACAGCTTCAGCGCTGTGAGCGAGGACAACCTGGGCTTCCTGATGCACGCTCCTGCCTTCGAGACCGCTGGCACCTACCTGAGGCTGGTGAAGATCAACGACTGGACCGAGATCACCCAGTTCATCCTGGAGCACAGAGCCAAGGGTAGCTGTAAGTACGCTCTGCCTCTGAGAATCCCTCCTAGCGCTTGTCTGAGCCCTCAGGCCTACCAGCAAGGCGTGACCGTGGACAGCATCGGTATGCTGCCTCGCTTCATCCCTGAGAACCAGAGGACCGTGGCTGTGTACAGCCTGAAGATCGCTGGCTGGCACGGTCCTAAGGCTCCTTACACCAGCACTCTGCTGCCTCCTGAGCTGAGCGAGACCCCTAACGCCACTCAGCCTGAGCTGGCTCCTGAGGACCCTGAGGACAGCGCTCTGCTGGAGGACCCTGTGGGTTAAGGATCC構(gòu)建的重組質(zhì)粒表達(dá)HSV1的病毒gD糖蛋白胞外區(qū)片段(284個(gè)氨基酸)，在其N端添加了8XHis標(biāo)簽(8個(gè)氨基酸)及TEV蛋白酶酶切位點(diǎn)(7個(gè)氨基酸)，全長(zhǎng)299個(gè)氨基酸,其氨基酸序列如下-HisHisHisHisHisHisHisHisGluAsnLeuTyrPheGinGlyLysTyrAlaLeuAlaAspAlaSerLeuLysMetAlaAspProAsnArgPheArgGlyLysAspLeuProValLeuAspProLeuThrAspProProGlyVaiArgArgValTyrHislieGinAlaGlyLeuProAspProPhe6GinProProSerteuProlieThrValTyrTyrAlaValLeuGluArgAlaCysArgSerValLeuL_euAsnAlaProSerGluAlaProGinlieValArgGlyAlaSerGluAspValArgLysGinProTyrAsnLeuThrlieAlaTrpPheArgMetGlyGlyAsnCysAlalieProlieThrValMetGluTyrThrGluCysSerTyrAsnLysSerLeuGlyAlaCysProlieArgThrGinProArgTrpAsnTyrTyrAspSerPheSerAlaValSerGluAspAsnLeuGlyPheLeuMetHisAlaProAlaPheGluThrAlaGlyThrTyrLeuArgL>euVal匕yslieAsnAspTrpThrGlulieThrGinPhelieLeuGluHisArgAlaLysGlySerCysLysTyrAlaLeuProLeuArglieProProSerAlaCysLeuSerProGinAlaTyrGinGinGlyValThrValAspSerlieGlyMetLeuProArgPhelieProGluAsnGinArgThrValAlaValTyrSerLeuL>yslieAlaGlyTrpHisGlyProLysAlaProTyrThrSerThrLeuLeuProProGluLeuSerGluThrProAsnAlaThrGinProGluLeuAlaProGluAspProGluAspSerAlaLeuLeuGluAspProValGly4.重組質(zhì)粒的真核轉(zhuǎn)染與細(xì)胞表達(dá)上清的蛋白檢測(cè)-提取陽(yáng)性重組質(zhì)粒pCEP4-gDl，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法對(duì)HEK293細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，37°C，5%0)2溫箱培養(yǎng)48小時(shí)后，收集細(xì)胞上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，同時(shí)以1:10000稀釋的anti-His抗體對(duì)帶有His標(biāo)簽的蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行WesternBlot檢測(cè)，轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)相對(duì)分子量約為46kDa的HSV1病毒gD重組糖蛋白，而陰性對(duì)照質(zhì)粒pCEP4無(wú)此蛋白帶。5.表達(dá)的HSVl病毒gD糖蛋白的純化將Ni-S印harose6FastFlow親和層析柱連接至常壓層析系統(tǒng)，先用平衡液沖洗平衡，細(xì)胞上清液加Ni-S印harose6FastFlow凝膠室溫結(jié)合，上柱后收集穿透液。用平衡緩沖液洗條柱子，接著用含500mM咪唑的洗脫緩沖液洗脫目的蛋白，SDS-PAGE電泳及WesternBlot檢測(cè)目的蛋白。6.ELISA檢測(cè)純化的HSV1病毒gD糖蛋白的抗原性將純化的重組蛋白用PBS倍比稀釋，并將陰性對(duì)照以同樣濃度稀釋后包被酶聯(lián)板，羊抗HSV1+HSV2多抗作為一抗，兔抗山羊IgG-HRP作為二抗，間接酶聯(lián)免疫法檢測(cè)純化蛋白gDl的抗原性和特異性。結(jié)果顯示(表l)表達(dá)的重組蛋白具有較好的抗原性和特異性。7.ELISA檢測(cè)純化的HSV1病毒gD糖蛋白的免疫原性.1)HSVl病毒gD糖蛋白抗血清的制備將純化的重組蛋白與福氏佐劑混合后分別于第1,3，5周腹腔注射免疫小鼠(陰性對(duì)照組注射PBS)，并于第3，5，7周眼眶采血。血液37。C放置lh后4。C過夜，2000卬m離心20分鐘，取上清，4'C，12000rptn離心20分鐘，取上清即得HSV1病毒gD糖蛋白的抗血清。2)HSV1病毒gD糖蛋白抗血清效價(jià)檢測(cè)將純化的重組蛋白用PBS按1:100稀釋后包被酶聯(lián)板，抗血清梯度稀釋后作為一抗，二抗用羊抗小鼠IgG-HRP，間接酶聯(lián)免疫法測(cè)抗血清效價(jià)，陽(yáng)性血清能與HSVl病毒gD糖蛋白反應(yīng)，陰性血清則不能。間接ELISA結(jié)果顯示(表2)表達(dá)的重組蛋白具有較好的免疫原性。8.將表達(dá)的HSVl病毒gD糖蛋白片段，用于疫苗、HSV1病毒抗體或抗原的檢測(cè)及用于免疫制備抗HSV1病毒單抗和多抗等。9.將合成的HSV1病毒gD糖蛋白基因片段與其他基因片段連接，以融合蛋白的形式進(jìn)行表達(dá)、制備。上述方法制備的HSV1病毒gD糖蛋白胞外區(qū)基因片段在制備HSVl病毒亞單位疫苗中的應(yīng)用?；瘜W(xué)合成的HSV1病毒gD糖蛋白胞外區(qū)基因片段，可利用細(xì)菌、酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞及轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物進(jìn)行重組表達(dá)、制備。所述方法制備的化學(xué)合成的HSVl病毒gD糖蛋白胞外區(qū)基因片段在制備HSVl病毒疫苗及檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有的優(yōu)點(diǎn)1.本發(fā)明表達(dá)的HSVl病毒gD糖蛋白胞外區(qū)片段用作抗原，制備HSVl病毒抗體的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，具有生產(chǎn)較安全、成本低、與其他病毒交叉反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)。2.HSVl病毒的gD糖蛋白是病毒胞膜的主要成分，在病毒的復(fù)制和刺激中和抗體的產(chǎn)生中起重要作用，也是宿主細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)的主要靶標(biāo)之一，因此HSV1病毒gD糖蛋白是構(gòu)建HSV疫苗理想的目的基因。本發(fā)明選擇了其強(qiáng)抗原表位，利用基因工程技術(shù)表達(dá)制備，為研制基因工程疫苗奠定基礎(chǔ)?；蚬こ桃呙绨踩?、成本低。3.本研究采用真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)的蛋白產(chǎn)物能正確地完成折疊、磷酸化、糖基化、二硫鍵形成、酰基化、蛋白酶加工等蛋白質(zhì)翻譯后加工過程，得到的重組蛋白有較高的生物學(xué)活性。4.本發(fā)明根據(jù)篩選出的HSV1病毒的gD糖蛋白胞外區(qū)片段氨基酸序列，選用真核及原核細(xì)胞均偏愛的密碼子，化學(xué)合成全新的基因序列，并且在N端添加人IgGK輕鏈信號(hào)肽，適宜在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高表達(dá)。5.本發(fā)明構(gòu)建的表達(dá)的HSVl病毒的gD糖蛋白的工程細(xì)胞，蛋白表達(dá)量高，可溶性好，易于純化，并且具有較好的抗原性和免疫原性。以下將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明圖1是表達(dá)HSVl病毒的gD糖蛋白的重組質(zhì)粒構(gòu)建流程圖。圖2是1%的Agarose凝膠檢測(cè)8個(gè)重組子的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。Lane1:以化學(xué)合成含HSVl病毒gD糖蛋白胞外區(qū)抗原表位基因的DNA序列為模板PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，陽(yáng)性對(duì)照；Lane2:以空質(zhì)粒pCEP4為模板PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，陰性對(duì)照；Lane3-10:1-8號(hào)轉(zhuǎn)化子PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，其中2，4，5，7號(hào)轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增出981bp的目的基因片段，即圖內(nèi)箭頭標(biāo)示的位置；LaneM:DL2000Marker(TaKaRa)。圖3是1%的Agarose凝膠檢測(cè)陽(yáng)性重組子的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和酶切鑒定產(chǎn)物。Lane1:4號(hào)陽(yáng)性重組子PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；Lane2:4號(hào)陽(yáng)性重組子酶切鑒定產(chǎn)物；LaneM:DL2000Marker(TaKaRa)。200910184631.2說明書第6/14頁(yè)圖4是表達(dá)重組HSV1病毒gD糖蛋白的細(xì)胞上清WesternBlot檢測(cè)。LaneM:標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白Marker;Lane1:Multiple-tag,陽(yáng)性對(duì)照；Lane2:空質(zhì)粒pCEP4轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上清，陰性對(duì)照Lane3:轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pCEP4-gDl的細(xì)胞上清。圖5是純化的重組HSVl病毒gD糖蛋白WesternBlot檢測(cè)。Lane1:純化后的重組HSVl病毒gD糖蛋白；Lane2:空質(zhì)粒pCEP4轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上清，陰性對(duì)照；Lane3:標(biāo)Jt分子量蛋白Marker;Lane4:25ngMultiple-tag,陽(yáng)性對(duì)照。具體實(shí)施例方式本發(fā)明實(shí)施方式的詳細(xì)說明HSV1病毒的gD糖蛋白抗原表位的分析、基因合成及載體構(gòu)建通過計(jì)算機(jī)分析HSV1病毒的gD糖蛋白的全部氨基酸序列，篩選出HSV1病毒gD糖蛋白內(nèi)的強(qiáng)抗原表位，選用原核及真核均偏愛的密碼子，化學(xué)合成HSV1病毒的gD糖蛋白含強(qiáng)抗原表位的全新基因片段。將基因片段克隆至質(zhì)粒pCEP4內(nèi)的HindIII/BamHI位點(diǎn)，構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pCEP4-gDl。材料與方法1.菌種與質(zhì)粒大腸桿菌DH5a及真核表達(dá)載體pCEP4由本實(shí)驗(yàn)室保存。2.試劑和儀器PrimerSTARHSDNAPolymerase,d,,HindIII,B柳HI,T4DNA連接酶，質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒為TaKaRa公司產(chǎn)品。TAE電泳緩沖液、SDS-PAGE蛋白電泳試劑等由本室配制(配方參考《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》)。PCR擴(kuò)增儀；高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司)；瓊脂糖凝膠電泳裝置；蛋白電泳裝置(Bio-Rad公司)；脫色搖床(江蘇興化市分析儀器廠)。3.基因片段的合成由公司幫助合成。4.表達(dá)HSV1病毒gD糖蛋白胞外區(qū)片段重組質(zhì)粒的構(gòu)建提取質(zhì)粒pCEP4，用HindIII和BamHI雙酶切，電泳后回收酶切的質(zhì)粒大片段，溶于去離子水內(nèi)。同樣用HindIII和BamHI雙酶切化學(xué)合成的HSV1病毒gD糖蛋白基因片段，電泳回收后，溶f去離f水內(nèi)。取等摩爾濃度的上述兩種酶切后DNA片段，在同一離心管內(nèi)用T4DNA連接酶連接，使HSV1病毒gD糖蛋白基因片段插入到真核質(zhì)粒pCEP4內(nèi)的HindIII和BamHI位點(diǎn)之間，構(gòu)成重組真核表達(dá)載體pCEP4-gDl。5.重組質(zhì)粒的篩選與鑒定將上步連接的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a,將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布含氨芐青霉素(100ug/ml)的固體LB培養(yǎng)基上，置37'C培養(yǎng)過夜。次日隨機(jī)挑選8個(gè)轉(zhuǎn)化子菌落(分別標(biāo)記為l一8號(hào))和1個(gè)對(duì)照菌(質(zhì)粒pCEP4轉(zhuǎn)化菌)，分別接種到含3ml液體LB培養(yǎng)基(含氨芐青霉素100ug/ml)的試管內(nèi)，置37'C振蕩培養(yǎng)5小時(shí)，取菌液Iml，離心收菌。分別用50ul去離子水懸浮菌體，沸水煮5分鐘，4'C，12000rpm離心5分鐘，取上清(內(nèi)有質(zhì)粒)2ul用作PCR模板，PCR擴(kuò)增插入載體內(nèi)的HSVl病毒gD糖蛋白胞外區(qū)截短形式基因片段，PCR反應(yīng)濃度為-質(zhì)粒模板2ul、HSV1病毒gD糖蛋白胞外區(qū)基因片段的正鏈引物Pl(GCAAGCTTGCCGCCACCATGGAA)和負(fù)鏈引物P2(GCGGATCCTTAACCCACAGGGTC)各lul、10Xpyrobestbuffer2.Oul、2.5,1/LdNTP2.Oul、PrimerSTARHSDNA聚合酶0.5ul(1.25U)、去離子水11.5ul,總體積20ul。擴(kuò)增條件為98。C預(yù)變性l分鐘，98°C10秒、55°C10秒、72°C1分鐘，30個(gè)循環(huán)，最后72。C延伸7分鐘。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5ul，用1.0%的Agarose凝膠檢測(cè)，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子應(yīng)能擴(kuò)增出981bp的目的片段，而空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌無(wú)此帶。用HindIII和BamHI酶雙酶切，重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物應(yīng)在975bp、10200bp處出現(xiàn)條帶。6.DNA序列分析:用QIAGEN公司質(zhì)粒純化試劑盒純化質(zhì)粒，用DNA全自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)序。結(jié)果1.HSV1病毒的gD糖蛋白抗原表位篩選及基因片段的合成-利用ANTHEWIN等軟件，通過計(jì)算機(jī)分析HSV1病毒的gD糖蛋白的全部氨基酸序列(GeneBank，登錄號(hào)EF157320)，篩選出HSV1病毒的gD糖蛋白內(nèi)的強(qiáng)抗原表位，即從第1個(gè)氨基酸到第284個(gè)氨基酸，其氨基酸序列如下LysTyrAlaLeuAlaAspAlaSerLeuLysMetAlaAspProAsnArgPheArgGlyLysAspLeuProValLeuAspProLeuThrAspProProGlyValArgArgValTyrHislieGinAlaGlyLeuProAspProPheGinProProSerLeuProlieThrValTyrTyrAlaValLeuGluArgAlaCysArgSerVslLeuLeuAsnAlaProSerGluAlaProGinlieValArgGlyAlaSerGluAspValArgLysGinProTyrAsnLeuThrlieAlaTrpPheArgMetGlyGlyAsnCysAlalieProlieThrValMetGluTyrThrGluCysSerTyrAsnLysSerLeuGlyAlaCysProlieArgThrGinProArgTrpAsnTyrTyrAspSerPheSerAlaValSerGluAspAsnLeuGlyPheLeuMetHisAlaProAlaPheGlu丁hrA]aGlyThrTyrLeuArgLeuVallyslieAsnAspTrpThrGlulieThrGinPhelieLeuGuHisArgAlaLysGlySerCysLysTyrAlaLeuProleuArglieProProSerAlaCysLeuSerProGinAlaTyrGinGinGlyValThrValAspSerlieGlyMetLeuProArgPhelieProGluAsnGinArgThrValAlaValTyrSerLeuLyslieAlaGlyTrpHisGlyPro匕ysAlaProTyrThrSerThrLeuLeuProProGluLeuSerGluThrProAsnAlaThrGinProGluLeuAlaProGluAspProGluAspSerAlaLeuLeuGluAspProValGly根據(jù)篩選的HSV1病毒gD糖蛋白內(nèi)的抗原表位氨基酸序列，選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，化學(xué)合成全新的基因序列，并且在5'端增加了HindIII酶切位點(diǎn)(下畫線部分)，轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列(GCCGCCACC),起始密碼子(ATG),人IgGk輕鏈信號(hào)肽(波浪線部分)，8XHis標(biāo)簽及TEV蛋白酶酶切位點(diǎn)(gaaaacctgtacttccagggt)，在3'端增加了終止密碼子(TAA)和BamHI酶切位點(diǎn)(下畫線部分)，使該基因片段易于克隆至質(zhì)粒pCEP4內(nèi)的HindIII和BamH10I酶切位點(diǎn)內(nèi)，并且使gD蛋白更易于表達(dá)和純化。化學(xué)合成的含HSV1病毒gD糖蛋白抗原表位基因的DNA序列(981bp)如下AAGCTTGCCGCCACCATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGACATCATCACCATCACCATCACCATGAAAACCTGTACTTCCAGGGTAAGTACGCTCTGGCCGATGCTAGCCTGAAGATGGCTGATCCTAACCGCTTCAGAGGTAAGGACCTGCCTGTGCTGGACCAGCTGACCGACCC丁CCTGGCGTGCGCAGAGTGTACCACATTCAGGCTGGTCTGCCTGACCCTTTCCAGCCTCCTAGCCTGCCTATCACCGTGTACTACGCCGTGCTGGAGAGAGCCTGTCGCAGCGTGCTGCTGAACGCTCCTAGCGAGGCTCCTCAGATCGTGAGAGGTGCTAGCGAAGACGTGAGGAAGCAGCCTTACAACCTGACCATCGCCTGGTTCAGGATGGGTGGTAACTGTGCTA丁CCCTATCACCGTGA丁GGAGTACACCGAG丁GT丁CTTACAACAAGAGCCTGGGCGCTTGTCCTATCCGCACCCAGCC丁AGGTGGAACTACTACGACAGCTTCAGCGCTGTGAGCGAGGACAACCTGGGCTTCCTGATGCACGCTCCTGCCTTCGAGACCGCTGGCACCTACCTGAGGCTGGTGAAGATCAACGACTGGACCGAGATCACCCAGTTCATCCTGGAGCACAGAGCCAAGGGTAGCTGTAAGTACGCTCTGCCTCTGAGAATCCCTCCTAGCGCTTGTCTGAGCCCTCAGGCCTACCAGCAAGGCGTGACCGTGGACAGCATCGGTATGCTGCCTCGCTTCATCCCTGAGAACCAGAGGACCGTGGCTGTGTACAGCCTGAAGATCGCTGGCTGGCACGGTCCTAAGGCTCCTTACACCAGCACTCTGCTGCCTCCTGAGCTGAGCGAGACCCCTAACGCCACTCAGCCTGAGCTGGCTCCTGAGGACCCTGAGGACAGCGCTCTGCTGGAGGACCCTGTGGGTTAAGGATCC2.表達(dá)HSV1病毒gD糖蛋白胞外區(qū)片段重組質(zhì)粒的構(gòu)建-將目的基因克隆到pCEP4載體的HindIII和BamHI酶切位點(diǎn)之間，構(gòu)成重組真核表達(dá)載體pCEP4-gDl。(構(gòu)建流程見圖l)。3.重組質(zhì)粒的篩選與鑒定第2、4、5、7號(hào)4個(gè)轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增出981bp的目的基因片段，而含質(zhì)粒pCEP4的對(duì)照菌沒有擴(kuò)增出該基因片段(見圖2)。提取4號(hào)重組子的質(zhì)粒，用HindIII和BamHI酶雙酶切，酶切產(chǎn)物在約975bp、10200bp處出現(xiàn)條帶，與預(yù)期大小相符(見圖3)。提取4號(hào)重組子的質(zhì)粒，測(cè)定質(zhì)粒內(nèi)的HSVl病毒gD糖蛋白基因序列，DNA'序列分析證實(shí)，重組質(zhì)粒含有合成的HSV1病毒gD糖蛋白基因片段，序列完全正確AAGCTTGCCGCCACCATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGACATCATCACCATCACCATCACCATGAAAACCTGTACTTCCAGGGTAAGTACGCTCTGGCCGATGCTAGCCTGAAGATGGCTGATCCTAACCGCTTCAGAGGTAAGGACCTGCCTGTGCTGGACCAGCTGACCGACCCTCCTGGCGTGCGCAGAGTGTACCACATTCAGGCTGGTCTGCCTGACCCTncCAGCCTCCTAGCCTGCCTATCACCGTGTACTACGCCGTGCTGGAGAGAGCCTGTCGCAGCGTGCTGCTGAACGCTCCTAGCGAGGCTCCTCAGATCGTGAGAGGTGCTAGCGAAGACGTGAGGAAGCAGCCTTACAACCTGACCATCGCCTGGTTCAGGATGGGTGGTAACTGTGCTATCCCTATCACCGTGATGGAGTACACCGAGTGTTCTTACAACAAGAGCCTGGGCGCTTGTCCTATCCGCACCCAGCCTAGGTGGAACTACTACGACAGCTTCAGCGCTGTGAGCGAGGACAACCTGGGCTTCCTGATGCACGCTCCTGCCTTCGAGACCGCTGGCACCTACCTGAGGCTGGTGAAGATCAACGACTGGACCGAGATCACCCAGTTCA丁CCTGGAGCACAGAGCCAAGGGTAGCTGTAAGTACGCTCTGCCTCTGAGAATCCCTCCTAGCGCTTGTCTGAGCCCTCAGGCCTACCAGCAAGGCGTGACCGTGGACAGCATCGGTATGCTGCCTCGCTTCATCCCTGAGAACCAGAGGACCGTGGCTGTGTACAGCCTGAAGATCGCTGGCTGGCACGGTCCTAAGGCTCCTTACACCAGCACTCTGCTGCCTCCTGAGCTGAGCGAGACCCCTAACGCCACTCAGCCTGAGCTGGCTCCTGAGGACCCTGAGGACAGCGCTCTGCTGGAGGACCCTGTGGGTTAAGGATCC構(gòu)建的重組質(zhì)粒表達(dá)HSVl的病毒gD糖蛋白片段(284個(gè)氨基酸)，在其N端添加了8XHis標(biāo)簽(8個(gè)氨基酸)及TEV蛋白酶酶切位點(diǎn)(7個(gè)氨基酸)，全長(zhǎng)299個(gè)氨基酸，其氨基酸序列如下HisHisHisHisHisHisHisHisGluAsnLeuTyrPheGinGlyLysTyrAlaLeuAlaAspAlaSerLeuLysMetAlaAspProAsnArgPheArgGlyLysAspLeuProValLeuAspProleuThrAspProProGlyValArgArgValTyrHislieGinAlaGlyLeuProAspProPheGinProProSerLeuProlieThrVal丁yrTyrAlaValLeuGluArgAlaCysArgSerValLeuLeuAsnAlaProSerGluAlaProGinlieValArgGlyAlaSerGluAspValArgLysGinProTyrAsnLeuThrlieAlaTrpPheArgMetGlyGlyAsnCysAlalieProlieThrValMetGluTyrThrGluCysSerTyrAsnLysSerLeuGlyAlaCysProlieArgThrGinProArgTrpAsnTyrTyrAspSerPheSerAlaValSerGluAspAsnLeuGlyPheLeuMetHisAlaProAlaPheGluThrAlaGlyThrTyrLeuArgLeuValLyslieAsnAspTrpThrGlulieThrGinPhelieLeuGluHisArgAlaLysGlySerCysLysTyrAlaLeuProLeuArglieProProSerAlaCysLeuSerProGinAla丁yrGinGinGlyValThrValAspSerlieGlyMetLeuProArgPhelieProGluAsnGinArgThrValAlaValTyrSerLeuLyslieAlaGly丁rpHisGlyProLysAlaProTyrThrSerThrLeuLeuProProGluLeuSerGluThrProAsnAlaThrGinProGluLeuAlaProGluAspProGluAspSerMaLeuLeuGluAspProValGly重組質(zhì)粒的真核轉(zhuǎn)染、細(xì)胞表達(dá)上清的蛋白檢測(cè)與純化提取陽(yáng)性重組質(zhì)粒pCEP4-gDl，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法對(duì)HEK293細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。收集細(xì)胞上清，根據(jù)表達(dá)HSVl病毒gD糖蛋白的氨基酸序列，分析其理化特性，確定適當(dāng)?shù)募兓椒?。我們所表達(dá)的HSVl病毒gD糖蛋白在N端添加了8XHis標(biāo)簽，可很方便用鎳瓊脂糖凝膠分離，因此我們決定采用親和層析法，用NiS印harose6FastFlow凝膠進(jìn)行純化。具體步驟如下材料和方法1.主要試劑Lipofectamine2000為invitrogen公司產(chǎn)品，NiS印harose6FastFlow凝膠為GEHeathcare公司產(chǎn)品，小鼠抗His單抗、羊抗小鼠IgG-HRP為金斯特公司產(chǎn)品。其它試劑為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純?cè)噭?.重組質(zhì)粒pCEP4-gDl真核轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前一天以0.5-2X10V孔的密度接種HEK293細(xì)胞至24孔板，37°C，5%〔02溫箱培養(yǎng)過夜，使其達(dá)到孔底面積90-95%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。取重組質(zhì)粒pCEP4-gDl5ul(200ng/ul)稀釋于50ul無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基中(設(shè)對(duì)照空質(zhì)粒pCEP4)，溫和混勻。取Upofectamine20002ul稀釋于50ul無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基中，溫和混勻，室溫靜置5分鐘。將稀釋的重組質(zhì)粒和脂質(zhì)體溫和混勻，室溫靜置20分鐘后加入到含有HEK293細(xì)胞的24孔板中，100ul/孔，溫和混勻，37'C，5%0)2溫箱培養(yǎng)48小時(shí)后，收集細(xì)胞上清進(jìn)行檢測(cè)。3.WesternBlot檢測(cè)表達(dá)重組HSV1病毒gD糖蛋白的細(xì)胞上清12收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳，PVDF膜濕轉(zhuǎn)，100V,1小時(shí)，4'C封閉過夜(5%tnilk-PBST)。PBST洗膜3次，每次10分鐘，小鼠抗His單抗(lmg/ml)1:10000稀釋于封閉液中，室溫孵育2小時(shí)，洗膜3X10分鐘，羊抗小鼠IgG-HRPl:IOOOO稀釋于封閉液中，室溫孵育l小時(shí)，洗膜3X10分鐘，加發(fā)光底物反應(yīng)3分鐘，暗室中壓片曝光。4.重組HSVl病毒gD糖蛋白的純化上清溶液加已經(jīng)平衡的NiS印harose6FastFlow凝膠3ml，混勻后4'C結(jié)合過夜，上樣，收集穿透液。用十倍柱床體積的平衡液(1XPBS,0.5mol/LNaCl+，20,ol/Limidazole,pH7.4)洗滌柱子，接著將lml洗脫液(1XPBS，0.5mol/LNaCl，500mmol/Limidazole,pH7.4)加入膠體中，靜置20分鐘后洗脫目的蛋白，即為純化的HSVl病毒gD糖蛋白胞外區(qū)片段。5.WesternBlot檢測(cè)純化的重組HSV1病毒gD糖蛋白對(duì)純化的重組HSV1病毒gD糖蛋白進(jìn)行12%SDS-PAGE膠電泳，19mA，80分鐘。PVDF膜濕轉(zhuǎn)，100V,1小時(shí)，4'C封閉過夜(5%milk-PBST)。PBST洗膜3次，每次10分鐘，小鼠抗His單抗(1mg/ml)i:10000稀釋于封閉液中，室溫孵育2小時(shí)，洗膜3X10分鐘，羊抗小鼠IgG-HRP1:10000稀釋于封閉液中，室溫孵育l小時(shí)，洗膜3X10分鐘，加發(fā)光底物反應(yīng)3分鐘，暗室中壓片曝光。結(jié)果1.WesternBlot檢測(cè)表達(dá)重組HSV1病毒gD糖蛋白的細(xì)胞上清經(jīng)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞明顯表達(dá)出重組HSV1病毒gD糖蛋白，表達(dá)產(chǎn)物以可溶性形式存在于細(xì)胞上清中，分子量約46kDa,與預(yù)期大小相符。結(jié)果表明，重組HSV1病毒gD糖蛋白表達(dá)成功(見圖4)。2.WesternBlot檢測(cè)純化的重組HSV1病毒gD糖蛋白將從NiS印harose6FastFlow凝膠柱上洗脫的蛋白進(jìn)行WesternBlot分析，蛋白帶分子量約46kDa，與預(yù)期大小相符。結(jié)果表明，重組HSVl病毒gD糖蛋白純化成功(見圖5)。純化HSV1病毒的gD糖蛋白的鑒定及應(yīng)用將純化的重組HSV1病毒gD糖蛋白抗原，通過間接ELISA試驗(yàn)方法檢測(cè)，以鑒定表達(dá)的HSV1病毒gD糖蛋白的抗原性和特異性。再用純化的重組HSV1病毒gD糖蛋白抗原免疫小鼠，通過間接ELISA試驗(yàn)方法檢測(cè)小鼠血清中抗體濃度，以鑒定表達(dá)的HSV1病毒gD糖蛋白的免疫原性。材料和方法1.主要試劑及材料山羊抗HSV1+HSV2多抗為Abeam公司產(chǎn)品，兔抗山羊IgG-HRP為博士德公司產(chǎn)品，完全福氏佐劑和不完全福氏佐劑為SIGMA公司產(chǎn)品。其它試劑為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純?cè)噭?。?shí)驗(yàn)動(dòng)物4周齡雄性昆明小鼠，SPF級(jí)，購(gòu)自北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。2.重組HSV1病毒gD糖蛋白的鑒定釆用間接ELISA檢測(cè)重組HSV1病毒gD糖蛋白的抗原性?；静襟E為用1XPBS(pH7.4)按1:25-1:400倍比稀釋純化的重組HSV1病毒gD糖蛋白，包被酶聯(lián)板(陰性對(duì)照取正常HEK293細(xì)胞上清)，每孔100ul，4'C過夜。次日用封閉液(1XPBS，1%小牛血清)封閉，每孔130ul，室溫2小時(shí)。將山羊抗HSV1+HSV2多抗，用樣本稀釋液(1XPBS，0.1%小牛血清)1:500稀釋后，分別加至封閉后的酶聯(lián)板孔內(nèi)，每孔100ul，37'C反應(yīng)1小時(shí)，用PBST液(1XPBS,0.5%吐溫一20)洗5遍后，加l:40000稀釋的兔抗山羊IgG-HRP，每孔100ul，37。C反應(yīng)30分鐘，PBST洗5遍，加底物TMB溶液，每孔100ul，37'C避光顯色10分鐘，每孔加50ul1N鹽酸終止反應(yīng)，用酶聯(lián)儀測(cè)定A450值。3.HSV1病毒gD糖蛋白抗血清的制備-將純化的重組HSV1病毒gD糖蛋白與福氏佐劑等體積混合后分別于第1，3，5周(第1周用完全福氏佐劑，第3，5周用不完全福氏佐劑)腹腔注射免疫小鼠，1.25ug/只/次(陰性對(duì)照組注射等體積PBS),并于第3,5,7周眼眶采血。血液37。C放置1小時(shí)后4'C過夜，2000rpm離心20分鐘，取上清，4°C,12000rpm離心20分鐘，取上清即得HSV1病毒gD糖蛋白的抗血清。4.HSV1病毒gD糖蛋白抗血清效價(jià)檢測(cè)-采用間接ELISA檢測(cè)重組HSV1病毒gD糖蛋白的免疫原性?；静襟E為用1XPBS按1:IOO稀釋純化的重組HSVI病毒gD糖蛋白，包被酶聯(lián)板，每孔100ul,4'C過夜。次日用封閉液封閉酶聯(lián)板，每孔130ul，室溫2小時(shí)。將抗血清用樣本稀釋液按1:50，1:500,1:5000稀釋后，分別加至封閉后的酶聯(lián)板孔內(nèi)，每孔00ul，37'C反應(yīng)1小時(shí)，用PBST洗5遍后，加l:10000稀釋的羊抗小鼠IgG-HRP,每孔100ul，37'C反應(yīng)30分鐘，PBST洗5遍，加底物TMB溶液每孔100ul，37r避光顯色10分鐘，加50ul1N鹽酸終止反應(yīng)，用酶聯(lián)儀測(cè)定A450值。陽(yáng)性血清應(yīng)能與HSVl病毒gD糖蛋白反應(yīng)，陰性血清則不能。結(jié)果1.重組HSVl病毒gD糖蛋白抗原性鑒定用間接ELISA法檢測(cè)純化的重組蛋白的抗原性，結(jié)果顯示(表l)蛋白濃度與其OD值之間有良好的線性關(guān)系，說明表達(dá)的重組HSV1病毒gD糖蛋白有較好的抗原性和特異性。2.重組HSVl病毒gD糖蛋白免疫原性鑒定用間接ELISA法檢測(cè)純化的重組蛋白的免疫原性，結(jié)果顯示(表2)第一次免疫后抗體水平較低，第二次免疫后抗體水平明顯上升，第三次免疫后抗體水平與第二次持平，說明表達(dá)的重組HSV1病毒gD糖蛋白有良好的免疫原性，為的研制奠定了基礎(chǔ)。表1表達(dá)蛋白抗原性檢測(cè)的ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表2表達(dá)蛋白免疫原性檢測(cè)的ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果重組HSV1病毒gD糖蛋白抗血清陰性對(duì)照稀釋濃度1:501:5001:50001:501:5001:5000第一次免疫0.137一-0.125一一第二次免疫2.1992.0631.1040.0650.0460.018第三次免疫2.0501.8440.7410.0610.0230.02115化學(xué)合成的HSV1病毒gD糖蛋白胞外區(qū)基因片段序列表<110〉李越?！?20〉化學(xué)合成的HSVl病毒gD糖蛋白胞外區(qū)基因片段及其表達(dá)、應(yīng)用<■2<210〉1<211〉852<212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉<221〉CDS<222>(l)...(852)<223〉人工合成的全新基因片段，編碼含強(qiáng)抗原表位的HSVl病毒gD糖蛋白胞外區(qū)284個(gè)氨基酸片段。<400〉1AAGTACGCTCTGG(X'GATGCTAGCCTGAAGATGGCTGATCCTAACCGCTTCAGAGGTAAG60GACCTGCCTGTGCTGGACCAGCTGACCGACCCTCCTGGCGTGCGCAGAGTGTACCACATT120CAGGCTGGTCTGCCTGACCCTTTCCAGCCTCCTAGCCTGCCTATCACCGTGTACTACGCC180GTGCTGGAGAGAGCCTGTCGCAGCGTGCTGCTGAACGCTCCTAGCGAGGCTCCTCAGATC240GTGAGAGGTGCTAGCGAAGACGTGAGGAAGCAGCCTTACAACCTGACCATCGCCTGGTTC300AGGATGGGTGGTAACTGTGCTATCCCTATCACCGTGATGGAGTACACCGAGTGTTCTTAC360AACAAGAGCCTGGGCGCTTGTCCTATCCGCACCCAGCCTAGGTGGAACTACTACGACAGC420TTCAGCGCTGTGAGCGAGGACAACCTGGGCTTCCTGATGCACGCTCCTGCCTTCGAGACC480GTGGCACCTACCTGAGGCTGGTG,AAG,ATCAACGACTGGACCGAGATCACCCAGTTCATC540CTGGAGCACAGAGCCAAGGGTAGCTGTAAGTACGCTCTGCCTCTGAGAATCCCTCCTAGC600GCTTGTCTGAGCCCTCAGGCCTACCAGCAAGGCGTGACCGTGGACAGCATCGGTATGCTG660CCTCGCTTCATCCCTGAGAACCAGAGGACCGTGGCTGTGTACAGCCTGAAGATCGCTGGC720TGGCACGGTCCTAAGGCTCCTTACACCAGCACTCTGCTGCCTCCTGAGCTGAGCGAGACC780CCTAACGCCACTCAGCCTGAGCTGGCTCCTGAGGACCCTGAGGACAGCGCTCTGCTGGAG840GACCCTGTGGGT<210〉2<211>284〈212>PRT<213>HSV1病毒gD蛋白胞外區(qū)片段〈220〉〈223>含強(qiáng)抗原表位的HSV1病毒gD糖蛋白胞外區(qū)片段，第1個(gè)氨基酸一第284個(gè)氨基酸，共284個(gè)氨基酸。<400>2LysTyrAlaLeu1AspLeuProVal21GinAlaGlyLeu41ValLeuGluArg61ValArgGlyAla81ArgMetGlyGly101AsnLysSerLeu121PheSerAlaVal141AlaGlyThrTyr161LeuGluHisArg181AlaCysLeuSer201ProArgPhelie221TrpHisGlyPro241ProAsnAlaThr261AspProValGly,281AlaAspAlaSerLeuLysMet510LeuAspProLeu.ThrAspPro2530ProAspProPheGinProPro4550AlaCysArgSerValLeuLeu6570SerGluAspValArgLysGin8590AsnCysAlalieProlieThr105110GlyAlaCysProlieArgThr125130SerGluAspAsnLeuGlyPhe145150LeuArgLeuValLyslieAsn165170AlaLysGly■SerCysLysTyr185190ProGinAlaTyrGinGinGly205210ProGluAsnGinArgThrVal225230LysAlaProTyrThrSerThr245250GinProGluLeuAlaProGlu265270AlaAspProAsn15ProGlyValArg35SerLeuProlie55AsnAlaProSer75ProTyrAsnLeu95ValMetGluTyr115GinProArgTrp135LeuMetHisAla155AspTrpThrGlu175AlsLeuProLeu195ValThrValAsp215AlaValTyrSer235LeuLeuProPro255AspProGluAsp275ArgPheArgValThrValGluAlaThrlieThrGluAsnTyrProAlalieThrArglieSerlieLeuLysGluLeuSerAI3ArgGlyLys20TyrHislie40TyrTyrAla60ProGinlie80AlaTrpPhe100CysSerTyr120TyrAspSer140PheGluThr160GinPhelie180ProProSer200GlyMetLeu220lieAlaGly240SerGluThr260LeuLeuGlu280權(quán)利要求1.一種化學(xué)合成的HSV1病毒gD糖蛋白胞外區(qū)基因片段，該基因片段編碼含強(qiáng)抗原表位的HSV1病毒的gD糖蛋白胞外區(qū)片段，即第1個(gè)氨基酸至第284個(gè)氨基酸，共284個(gè)氨基酸，化學(xué)合成的基因序列全長(zhǎng)852bp，序列如下AAGTACGCTCTGGCCGATGCTAGCCTGAAGATGGCTGATCCTAACCGCTTCAGAGGTAAGGACCTGCCTGTGCTGGACCAGCTGACCGACCCTCCTGGCGTGCGCAGAGTGTACCACATTCAGGCTGGTCTGCCTGACCCTTTCCAGCCTCCTAGCCTGCCTATCACCGTGTACTACGCCGTGCTGGAGAGAGCCTGTCGCAGCGTGCTGCTGAACGCTCCTAGCGAGGCTCCTCAGATCGTGAGAGGTGCTAGCGAAGACGTGAGGAAGCAGCCTTACAACCTGACCATCGCCTGGTTCAGGATGGGTGGTAACTGTGCTATCCCTATCACCGTGATGGAGTACACCGAGTGTTCTTACAACAAGAGCCTGGGCGCTTGTCCTATCCGCACCCAGCCTAGGTGGAACTACTACGACAGCTTCAGCGCTGTGAGCGAGGACAACCTGGGCTTCCTGATGCACGCTCCTGCCTTCGAGACCGCTGGCACCTACCTGAGGCTGGTGAAGATCAACGACTGGACCGAGATCACCCAGTTCATCCTGGAGCACAGAGCCAAGGGTAGCTGTAAGTACGCTCTGCCTCTGAGAATCCCTCCTAGCGCTTGTCTGAGCCCTCAGGCCTACCAGCAAGGCGTGACCGTGGACAGCATCGGTATGCTGCCTCGCTTCATCCCTGAGAACCAGAGGACCGTGGCTGTGTACAGCCTGAAGATCGCTGGCTGGCACGGTCCTAAGGCTCCTTACACCAGCACTCTGCTGCCTCCTGAGCTGAGCGAGACCCCTAACGCCACTCAGCCTGAGCTGGCTCCTGAGGACCCTGAGGACAGCGCTCTGCTGGAGGACCCTGTGGGT2.權(quán)利要求l所述的化學(xué)合成的HSVl病毒gD糖蛋白胞外區(qū)基因片段，利用細(xì)菌、酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞及轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物進(jìn)行重組表達(dá)，制備HSV1病毒的gD糖蛋白胞外區(qū)284個(gè)氨基酸蛋白片段，序列如下LysTyrAlaLeuAlaAspAlaSerLeuLysMetAlaAspProAsnArgPheArgGlyLysAspleuProValLeuAspProLeuThrAspProProGlyValArgArgValTyrHislieGinAlaGlyLeuProAspProPheGinProProSerLeuProlieThrValTyrTyrAlaValLeuGluArgAlaCysArgSerValLeuLeuAsnAlaProSerGluAlaProGinlieValArgGlyAlaSerGluAspValArgLysGinProTyrAsnLeuThrlieAlaTrpPheArgMetGlyGlyAsnCysAlalieProlieThrValMetGluTyrThrGluCysSerTyrAsnLysSerleuGlyAlaCysProlieArgThrGinProArgTrpAsnTyrTyrAspSerPheSerAlaValSerGluAspAsnLeuGlyPheLeuMetHisAlaProAlaPheGluThrAlaGlyThrTyrLeuArgLeuValLyslieAsnAspTrpThrGlulieThrGinPhelieLeuGluHisArgAlaLysGlySerCysLysTyrAlaLeuProLeuArglieProProSerAlaCysLeuSerProGinAlaTyrGinGinGlyValThrValAspSerlieGlyMetLeuProArgPhelieProGluAsnGinArgThrValAlaValTyrSerLeuLyslieAlaGlyTrpHisGlyProLysAlaProTyrThrSerThrLeuLeuProProGluLeuSerGluThrProAsnAlaThrGinProGluLeuAlaProGluAspProGluAspSerAlaLeuLeuGluAspProValGly3.利要求2所述方法制備的化學(xué)合成的HSVl病毒gD糖蛋白胞外區(qū)基因片段在制備HSV1病毒疫苗及檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明化學(xué)合成的HSV1病毒gD糖蛋白胞外區(qū)基因片段及其表達(dá)、應(yīng)用涉及基因工程技術(shù)、疫苗和診斷試劑領(lǐng)域。本發(fā)明通過計(jì)算機(jī)分析，篩選出含強(qiáng)抗原表位的HSV1病毒gD糖蛋白胞外區(qū)片段，第1個(gè)氨基酸至第284個(gè)氨基酸，共284個(gè)氨基酸，選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，化學(xué)合成抗原表位的全新基因序列，利用基因工程技術(shù)表達(dá)該基因片段、制備HSV1病毒gD糖蛋白的強(qiáng)抗原表位片段及HSV1病毒gD糖蛋白的抗血清。表達(dá)的HSV1病毒gD糖蛋白可用于疫苗、HSV1病毒抗體或抗原的檢測(cè)及用于免疫制備抗HSV1病毒單抗和多抗等。文檔編號(hào)C12N15/38GK101643737SQ20091018463公開日2010年2月10日申請(qǐng)日期2009年8月27日優(yōu)先權(quán)日2009年8月27日發(fā)明者琳李,李素芹,李越希,英潘,潘明潔,王正茂,管文燕申請(qǐng)人:李越希