專利名稱：：一種與非小細胞肺癌預(yù)后相關(guān)的血清/血漿miRNA標志物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于基因工程及腫瘤學領(lǐng)域，涉及一種與非小細胞肺癌預(yù)后相關(guān)的血清/血漿miRNA標志物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：肺癌是人類最常見的惡性腫瘤，肺癌的主要病理類型包括非小細胞肺癌(NSCLC)和小細胞肺癌(SCLC)兩大類，其中非小細胞肺癌占肺癌總數(shù)的80~85%，位居全球范圍內(nèi)腫瘤發(fā)病率和死亡率的首位，目前全球范圍內(nèi)新發(fā)肺癌患者每年已經(jīng)超過100萬例。2002年全球共有135萬例肺癌新發(fā)病例，118萬人因肺癌而死亡。近年來，我國肺癌發(fā)病和死亡一直呈上升趨勢，2002年我國男性肺癌的發(fā)病率為42.4/10萬，女性為19.0/10萬，高于世界的平均水平并接近發(fā)達的工業(yè)化國家水平。2000年我國肺癌死亡率在40歲及以上人群中達到了71.5/10萬人年，遠遠高于肝癌、胃癌、食管癌和結(jié)直腸癌，而成為惡性腫瘤的首位死因。因此，肺癌是威脅全球及我國居民生命和健康的重要疾病之一，是亟待解決的重大公共衛(wèi)生問題。非小細胞肺癌主要包括鱗癌(squamouscellcancer,SCC)和腺癌(adenocarcinoma,AC),目前非小細胞肺癌的治療主要根據(jù)肺癌的臨床分期來進行，對I、II、IIIA期主要以手術(shù)切除為主，淋巴轉(zhuǎn)移顯著者，于手術(shù)前可輔以化療或放療。盡管近年來肺癌的診斷水平和治療水平不斷提高，但非小細胞肺癌的預(yù)后仍然較差，5年生存率在發(fā)展中國家不足9%，在美國也不到15%，因此對肺癌患者預(yù)后情況進行預(yù)測，并釆取針對性的個體化治療是提高治療效果的關(guān)鍵。盡管肺癌預(yù)后的判斷依據(jù)依然是臨床分期和病理組織學類型，然而，具有同樣臨床特征的肺癌患者的預(yù)后情況卻可能有很大的差異，僅僅利用當前的臨床分期系統(tǒng)對肺癌患者的預(yù)后情況進行預(yù)測是遠遠不夠的。我們亟需發(fā)現(xiàn)更加明確而有效的生物標志物，對不同特征的肺癌患者，尤其是早期患者的預(yù)后輔佐診斷和死亡風險評估，并對其采取科學的個體化治療方案，這將有助于改善生存質(zhì)量，延長患者的生存時間。MicroRNAs(即miRNAs)是近年來腫瘤分子生物學研究領(lǐng)域的一個熱點，它的成熟狀態(tài)是一類長約19-23個核苷酸的單鏈RNA分子，進化上具有高度保守性，可在轉(zhuǎn)3錄后水平上對基因表達進行調(diào)節(jié)，并參與哺乳動物幾乎所有的病理和生理活動，如個體發(fā)育、組織分化、細胞凋亡以及能量代謝等，與許多疾病的發(fā)生、發(fā)展存在著緊密的聯(lián)系。自發(fā)現(xiàn)參與調(diào)控線蟲時序發(fā)育的lin-4與let-7以來，miRNA分別在2002年和2003年兩度入選Science雜志年度十大科技突破。2005年預(yù)測miRNAs至少能調(diào)控5300個人類基因，也就是所有基因的30%,但隨著研究的深入，越來越多的miRNAs被發(fā)現(xiàn),這個比例還在不斷上升之中。近來，miRNA與腫瘤的關(guān)系越來越成為研究的重點，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)若干miRNAs通過負調(diào)控基因的表達與慢性淋巴細胞性白血病、肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等的發(fā)病和預(yù)后高度相關(guān)。有學者提出了"癌microRNAs"(OncomiRs)的觀點，即認為miRNAs的異常表達在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中充當了類似癌基因的角色。'最近的研究發(fā)現(xiàn)血清/血槳中存在上百種的miRNAs,這些小分子RNAs性質(zhì)穩(wěn)定、含量豐富、易于定量檢測，且存在顯著的疾病特異性。這一發(fā)現(xiàn)令人振奮，血清miRNAs作為一類非編碼調(diào)節(jié)性的小分子RNA有可能取代傳統(tǒng)的特異蛋白為代表的生物標志物，開拓了生物標志物的新境界。然而，目前還沒有關(guān)于血清/血漿miRNAs用于肺癌預(yù)后輔助判斷、危險度評價等方面的報道，若能篩選出肺癌預(yù)后特異或異常表達的血清/血漿miRNAs作為生物標志物，并研制相應(yīng)的疾病進展監(jiān)測、輔助診斷試劑盒，對我國肺癌的診治現(xiàn)狀必將是一次有力的推動，另外，研究這些異常表達的miRNAs對于肺癌細胞遷移、轉(zhuǎn)移能力的影響等，還有助于發(fā)現(xiàn)具有潛在治療價值的新型小分子藥物。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對上述技術(shù)問題，提出一種與非小細胞肺癌預(yù)后相關(guān)的血清/血漿miRNA標志物。本發(fā)明的另一個目的是提供上述血清/血漿miRNA標志物的引物。本發(fā)明還有一個目的是提供上述血清/血漿miRNA標志物及其引物在制備非小細胞肺癌預(yù)后輔助診斷、動態(tài)監(jiān)測的試劑盒以及在制備治療非小細胞肺癌的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明再有一個目的是提供用于非小細胞肺癌預(yù)后判斷和治療的診斷試劑盒及藥物。發(fā)明人通過分離和研究不同預(yù)后情況的I-IIIa期NSCLC患者血清/血漿中的miRNAs，尋找一組與NSCLC預(yù)后高度相關(guān)的高特異性和敏感性的miRNAs，并研制出可便于臨床應(yīng)用的肺癌的預(yù)后診斷和個體化治療輔助決策試劑盒，通過體外細胞實4驗，研究篩選出的miRNAs對于肺癌細胞遷移、轉(zhuǎn)移能力的影響，為發(fā)現(xiàn)具有潛在治療價值的新型小分子藥物提供數(shù)據(jù)支持。本發(fā)明的目的是通過下列技術(shù)方案實現(xiàn)的一種與非小細胞肺癌預(yù)后相關(guān)的血清/血槳miRNA標志物，該標志物為miR-486、miR30d、miR-l或miR-499中的一種或多種。所述的血清/血漿miRNA標志物，該標志物為miR-486、miR30d、miR-l或miR-499中二種以上的組合；優(yōu)選miR-l與miR-499組合，或者miR-486與miR30d組合；進一步優(yōu)選miR-486、miR30d、miR-l以及miR-499構(gòu)成的組合。所述的血清/血漿miRNA標志物在制備非小細胞肺癌預(yù)后輔助診斷試劑盒或治療非小細胞肺癌的藥物中的應(yīng)用。_miR-l或miR-499在制備抑制非小細胞肺癌轉(zhuǎn)移的藥物中的應(yīng)用；miR-486或miR-30d高表達患者中，抑制miR-486或miR-30d表達在制備抑制非小細胞肺癌轉(zhuǎn)移的藥物中的應(yīng)用。抑制miR-486或miR-30d表達可采用miR-486或miR-30d表達抑制劑(miRNA抑制物可從市場上購買得到)，或者其他抑制miR-486或miR-30d表達的方法。所述的血清/血漿miRNA標志物的引物，這些引物為miR-486的引物為SEQIDNo.23和SEQIDNo.24;miR30d的引物為SEQIDNo.15和SEQIDNo.16;miR-l的引物為SEQIDNo.7和SEQIDNo.8;miR-499的引物為SEQIDNo.25和SEQIDNo.26。上述的任意一對或多對血清/血漿miRNA標志物的引物在制備非小細胞肺癌預(yù)后輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。一種非小細胞肺癌預(yù)后輔助診斷試劑盒，該試劑盒含有血清/血漿miRNA中miR-486、miR30d、miR-l或miR-499—種或多種miRNA的引物。所述的診斷試劑盒，該試劑盒含有下列任意一對或多對血清/血漿miRNA標志物的引物:miR-486的引物為SEQIDNo.23和SEQIDNo.24;miR30d的引物為SEQIDNo.15和SEQIDNo.16;miR-l的引物為SEQIDNo.7和SEQIDNo.8;miR-499的引物為SEQIDNo.25和SEQIDNo.26。所述診斷試劑盒，該試劑盒還可以包括PCR反應(yīng)常用試劑，如逆轉(zhuǎn)錄酶，緩沖液，dNTPs，MgC12，DEPC水和Taq酶等；還可以含有標準品和/或?qū)φ掌?。具體地說，本發(fā)明解決問題的技術(shù)方案包括(1)建立統(tǒng)一標準的標本庫和數(shù)據(jù)庫以標準操作程序(SOP)采集符合標準的血液樣本，系統(tǒng)收集完整的人口學資料和臨床資料。(2)血清/血槳miRNA差異表達譜分析選擇不同預(yù)后情況的NSCLC患者檢測其血清/血漿miRNA表達譜及含量，分析不同人群血清/血漿miRNA的共性和特性，篩選差異表達miRNAs進行進一步大樣本多階段驗證。(3)篩選疾病特異血清/血漿miRNAs:對已篩選的血清/血漿差異表達miRNAs在大樣本人群中進行定量分析驗證，確定不同預(yù)后情況的NSCLC患者特異性血清/血漿miRNAs，能夠特異性指示NSCLC發(fā)展和預(yù)后的動態(tài)變化。(4)血清/血槳miRNA診斷試劑盒的研制根據(jù)不同預(yù)后情況的NSCLC特異血清/血漿miRNA開發(fā)miRNAs診斷試劑盒，實現(xiàn)NSCLC預(yù)后監(jiān)測和有效的個體化治療目的。(5)通過體外細胞試驗，研究篩選出的miRNA高/低表達對于肺癌細胞遷移能力的影響，發(fā)現(xiàn)具有潛在治療價值的新型小分子藥物。本發(fā)明人以標漼操作程序(SOP)采集符合標準的血液樣本，系統(tǒng)收集完整的人口學資料、臨床資料和隨訪資料等(這些資料可用于評價預(yù)后，并控制疾病分期、患者年齡等因素對于預(yù)后的影響)，并采用了RT-PCR方法、Real-timePCR方法、Solexa測序技術(shù)和體外細胞遷移能力檢測等。具體來說研究的實驗方法主要包括以下幾個部分1.研究樣本的選擇(1)新發(fā)I-IIIa期腺癌和鱗狀細胞癌(2)均經(jīng)過手術(shù)及術(shù)后輔助化療(3)采血前未經(jīng)過手術(shù)和放化療，無手術(shù)前放化療本研究共招募得到303例符合標準的樣本進行研究。2.Trizol試劑(Invitrogen，Carlsbad，CA)提取血清/血漿總RNA,按常規(guī)方法操作。通常能得到5嗎RNA/50ml血清或血漿。3.Solexa頂J序(1)總RNA進行PAGE電泳回收17-27ntRNA分子(2)將鏈接引物(adaptorprime)酶聯(lián)在小RNA分子的3'與5'端(3)進行RT-PCR反應(yīng)后并進行測序(4)數(shù)據(jù)分析與處理4.Real-timeRT-PCR(qRT-PCR)方法(1)取受試者的血清/血漿總RNA，通過RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA樣品；或者收集受試者的血清/血漿樣本，以血清/血漿作為緩沖液進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)來制備cDNA樣品；(2)設(shè)計引物；6(3)加入熒光探針進行PCR反應(yīng)；(4)檢測并比較不同預(yù)后情況的早期NSCLC患者血清/血漿樣本中微小核糖核酸的量的變化。5.qRT-PCR產(chǎn)物的測序驗證(1)利用4種miRNAs(miR-486,miR-30d,miR-l和miR-499)的反向引物逆轉(zhuǎn)錄獲得相應(yīng)的cDNA模板；(2)利用正向引物和通用反向引物(URP)對四種cDNA模板進行擴增；(3)將獲得的擴增產(chǎn)物克隆到pMDTMl8-T載體(TaKaRa,Japan)中；(4)利用BcaBEST測序引物M13-47和RV-M(TaKaRa，Japan)進行測序。6.細胞培養(yǎng).(1)人肺癌細胞系95-C和95-D購自于ATCC(USA)，95-D為高侵襲力細胞，95-C為低侵襲力細胞；(2)培養(yǎng)液為含有10%胎牛血清的RPMI1640。7.4種miRNAs表達質(zhì)粒的構(gòu)建(1)通過PCR反應(yīng)從DNA模板擴增獲得4種miRNAs(miR-486，miR-30d,miR-landmiR-499)的pri-miRNAs;(2)將獲得的4種pri-miRNAs序列通過Xbal和Kpnl雙酶切克隆入pcDNA3.1質(zhì)粒中(Invitrogen，Carlsbad,CA),構(gòu)建表達載體(pcDNA-miR-l、pcDNA-miR-499、pcDNA-miR-486或pcDNA-miR-30d);(3)所有該研究中的構(gòu)建結(jié)果都通過測序等方法證實其真實性。8.瞬時轉(zhuǎn)染和細胞遷移實驗(1)共包括兩套轉(zhuǎn)染體系，轉(zhuǎn)染細胞系為95-C和95-D，轉(zhuǎn)染試劑為Lipofect2000(Invitrogen,Carlsbad,CA);(2)保護性miRNAs(miR-l或miR-499)化學合成的前體miRNAs(pre-miRNAs)或者上述實驗方法7構(gòu)建的表達載體(pcDNA-miR-l或pcDNA-miR-499)分別轉(zhuǎn)染入高侵襲性細胞系(95-D)中，高危險性miRNAs(miR-486或miR-30d)化學合成的前體miRNAs(pre-miRNAs)或上述實驗方法7構(gòu)建的表達載體(pcDNA-miR-486或pcDNA-miR-30d)分別轉(zhuǎn)染入低侵襲性細胞系(95-C)中，由于miR-30d在95-C肺癌細胞系中高表達，反義miR-30d序列(miR-30di,序列5，-CUUCCAGUCGGGGAUGUUUACA-3')也被瞬時轉(zhuǎn)染入95-C肺癌細胞；G)轉(zhuǎn)染24小時后，轉(zhuǎn)染后細胞(5xl0"被轉(zhuǎn)入24孔板的小室中，每孔孔徑大小7尺寸約8um(MilliporeCorp.MA)，人工培養(yǎng)7小時；(4)轉(zhuǎn)染細胞的遷移能力通過Chemotactic分析法檢測，在磷酸鹽緩沖液中徹底清洗濾膜器，遷移到小室底部的細胞被95%的甲醇固定20分鐘，利用0.4%的臺盼藍染色20分鐘，最后在光學顯微鏡下拍片成像并讀取細胞數(shù)；(5)研究中設(shè)立陰性對照(NC)，即由一個對照miRNA前體或者空pcDNA3.1載體轉(zhuǎn)染入細胞中后獲得的遷移細胞計數(shù)，研究中其他每種miRNA的相對遷移能力均與NC相比獲得。每種細胞系均通過三平行檢測結(jié)果并且至少重復(fù)3次。9.診斷試劑盒制備方法Solexa方法確定預(yù)后良好和預(yù)后較差的NSCLC患者中有拷貝差異的miRNA,通過qRTJCR技術(shù)篩選在預(yù)后良好和預(yù)后較差狀態(tài)下表達量和差異程度大的一組血清/血漿微小核糖核酸，作為NSCLC輔助治療決策的指標。最后篩選出的對應(yīng)預(yù)后良好和預(yù)后較差的血清/血漿miRNA組成診斷試劑盒(miR-486、miR30d、miR-l和miR-499)。診斷試劑盒包括這些血清/血漿微小核糖核酸的一對或多對引物，探針，以及Taq酶、dNTP等試劑。10.統(tǒng)計分析方法運用X2檢驗(用于分類變量)或者studentt檢驗(用于連續(xù)性變量)比較人口學特征、吸煙、組織類型、分期和miRNA平均表達水平在研究對象組間分布的差異。生存時間用死亡時間或末次隨訪時間減去首診時間獲得。Kaplan-Meier方法和log-rank檢驗用于計算血清/血漿miRNA平均表達水平與生存時間的關(guān)系。單因素或者多因素Cox比例風險回歸模型用于計算風險率(HazardRisk,HR)以及它們的95%可信區(qū)間。定義那些死亡HR小于1且高表達的miRNAs為保護性miRNAs;定義那些死亡HR大于1且高表達的miRNAs為危險性miRNAs。我們在探索性樣本人群(60例)的研究中發(fā)現(xiàn)有4個miRNAs與患者生存情況有顯著關(guān)聯(lián)。4種miRNAs的不同表達水平以四分位數(shù)表示Ql表示miRNA表達水平小于等于25百分位數(shù)，Q2表示miRNA表達水平大于25百分位數(shù)且小于等于50百分位數(shù)，Q3表示miRNA表達水平大于50百分位數(shù)且小于等于75百分位數(shù),Q4表示miRNA表達水平大于75百分位數(shù)。我們將其余243例NSCLC患者隨機的分配到Training(測試)組和Testing(驗證)組，以miRNA表達水平的中位數(shù)為截點將Training組中的患者分為高危險組和低危險組。將Training組中確定的每種miRNA和危險miRNA分類的界限值直接應(yīng)用于Testing組和總的303例樣本中，進而觀察本研究結(jié)果的穩(wěn)定程度。8為了進一步研究這四種miRNAs構(gòu)成的綜合指征用于預(yù)后評價的效果，我們構(gòu)建了一個數(shù)學公式，綜合考慮每種miRNA與預(yù)后的正、負關(guān)聯(lián)情況和聯(lián)系強度。具體來說，我們以Tmining組研究樣本的回歸系數(shù)為權(quán)重，根據(jù)每種miRNA的表達情況給每個病人確定一個危險分值。危險分值的計算方法如下危險分值-(0.969xmiR-486的表達水平)+(0.973xmiR-30d的表達水平)+(-0.650xmiR-l的表達水平)+(-0.815xmiR-499的表達水平)。從Training組獲得的危險分值系數(shù)以及界限值被直接應(yīng)用于Testing組和總的303例樣本人群中。所以的統(tǒng)計學分析均通過專門的統(tǒng)計學分析軟件完成(SAS，v.9丄3)。統(tǒng)計學顯著性水平P值設(shè)為0.05，所有統(tǒng)計學檢驗均為雙側(cè)檢驗。以下是本發(fā)明進'一步的說明在上述303例符合條件的NSCLC患者中，選擇30位最后一次隨訪時生存期超過30個月的存活病人作為"長期生存"組，另外選擇30位生存時間小于25個月的已死亡病人作為"短期生存"組，兩組間疾病臨床分期和吸煙情況精確匹配，均進行手術(shù)和術(shù)后輔助化療，組織類型也不存在差異，除了生存情況和生存時間外基本均衡可比。我們將這兩組人群作為探索性樣本經(jīng)Solexa測序試驗獲得相關(guān)結(jié)果。根據(jù)Solexa測序方法，本發(fā)明人檢測到在"長期生存"組和"短期生存"組的早期NSCLC患者血清中存在差異表達的微小核糖核酸包括let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f、miR-15a、miR-16、miR-18a、miR-19b、miR-21、miR-22、miR-23a、miR-24、miR-25、miR-26a、miR-26b、miR-27、miR-28-3p、miR-29a、miR-30a、miR-33a、miR-92a、miR-93、miR-99a、miR-lOO、miR-101、miR陽29b、miR-103、miR-107、miR-192、miR國197、miR-199a-3p、miR-148a、miR-30d、miR-139-3p、miR-7、miR國10a、miR-10b、miR-181a、miR-181b、miR-210、miR-219、miR-221、miR-222、miR-199b-3p、let-7g、let-7i、miR-l、miR-15b、miR-23b、miR-27b、miR-122、miR-124、miR國128、miR-130a、miR-133a、miR國142、miR-143、miR-145、miR-140-3p、miR-191、miR-9、miR-125a、miR-146a、miR-150、miR陽184、miR-185、miR-193a、miR-206、miR-320a、miR陽29c、miR-34c、miR陽99b、miR-130b、miR-30e、miR-375、miR-378、miR-382、miR-340、miR陽342、miR-342-3p、miR-323-3p、miR-151-3p、miR-148b、miR-324-3p、miR國339、miR隱133b、miR-423、miR-423-3p、miR-486、miR-146b、miR-499。根據(jù)上述Solexa結(jié)果，選擇滿足下列條件的miRNAs用qRT-PCR方法進一步的驗證1)在兩組NSCLC患者中倍數(shù)差異達5倍的miRNAs作為本發(fā)明中初步篩査的血清生物標志物；2)這些miRNAs至少在一組NSCLC患者("長期生存"組或"短期9生存"組)中的拷貝數(shù)大于50以提高檢測效率。滿足上述條件的miRNAs包括miR-486，miR-22，miR-30d,miR-21,miR-26b，let7i，miR-378，miR-l，miR-206,miR-146b和miR-499。qRT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)在60例探索性樣本中，有4個miRNAs(miR-486，miR-30d，miR-1和miR-499)在兩組患者中的表達情況存在顯著性差異。多因素Cox回歸分析結(jié)果表明，這4個miRNAs的表達水平均與早期NSCLC患者死亡風險存在著計量-反應(yīng)關(guān)系兩個為危險因素(miR-486和miR-30d,高表達對預(yù)后不利)，兩個為保護因素(miR-l和miR-499，高表達預(yù)后較好)。具有4種miRNAs不同表達水平(以四分位數(shù)表示)的患者之間的中位生存期存在顯著的統(tǒng)計學差異。根據(jù)上述結(jié)果，將這4個與NSCLC預(yù)后相關(guān)的miRNAs在另外243例NSCLC患者中進一步的驗證。我們釆用隨機數(shù)字方法將243例NSCLC患者隨機的分配到Training(測試)組和Testing(驗證)組。在Training組隊列人群中我們發(fā)現(xiàn)血清高表達miR-486，miR-30d和低表達miR-1和miR-499均與NSCLC預(yù)后不良相關(guān)聯(lián)。在Testing組隊列人群中進行驗證的結(jié)果與Training組相類似。將所有303例研究樣本的結(jié)果整合，我們同樣得到與Training組一致的結(jié)果。血清/血漿高表達危險型miRNAs和低表達保護型miRNAs的病人的中位生存期顯著縮短，這4個miRNAs的效應(yīng)相互獨立。我們通過危險度評分方法進一步分析這4個標志物綜合與NSCLC預(yù)后的關(guān)系。我們根據(jù)Training組隊列人群的上述危險分值中位數(shù)作為界值將Training組劃分成高危險組和低危險組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高危險組的病人與低危險組的病人相比，其中位生存期時間較短，死亡風險增加了9.74倍。相同的危險分值計算方法和界值的應(yīng)用于Testing隊列組以及所有的303例病例中，得到的結(jié)果均與Training組獲得的結(jié)果相一致。逐步Cox回歸分析結(jié)果也表明，4個miRNAs及其組合均與NSCLC的預(yù)后獨立相關(guān)。此外，為了研究這四種miRNAs在調(diào)控肺癌細胞遷移過程中的作用，我們將保護性miRNAs(miR-1或miR-499)前體或表達載體(pcDNA-miR-l或pcDNA-miR-499)分別轉(zhuǎn)染入高侵襲性肺癌細胞系(95-D)中，將高危險性miRNAs(miR-486或miR-30d)前體或表達載體(pcDNA-miR-486或pcDNA-miR-30d)分別轉(zhuǎn)染入低侵襲性肺癌細胞系(95-C)中，由于miR-30d在95-C肺癌細胞系中高表達，所以反義miR-30d序列(miR-30di，序列5，CUUCCAGUCGGGGAUGUUUACA)也被瞬時轉(zhuǎn)染入95-C肺癌細胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照(NC)相比，轉(zhuǎn)染了保護性miRNAs和miR-30di的肺癌細胞的遷移能力明顯下降，而轉(zhuǎn)染了高危險性miRNAs的肺癌細胞遷移能力明顯增強。表達載體轉(zhuǎn)染實驗的結(jié)果與之類似，證明miR-l和miR-499高表達抑制肺癌細胞遷移活性，而miR-486和miR-30d高表達促進肺癌細胞的遷移。根據(jù)上述一系列實驗結(jié)果，本發(fā)明人還制備了一種能用于NSCLC輔助診斷和療效監(jiān)測的試劑盒，包含測定受試者血清/血漿中穩(wěn)定存在且可檢測的成熟miR-486、miR-30d、miR-l和miR-499的引物探針和其他檢測試劑。具體而言，這4種miRNA單獨及其組合，或者這4種miRNA的引物的單獨及其組合構(gòu)成的相關(guān)診斷試劑盒有助于NSCLC患者預(yù)后輔助判斷和動態(tài)監(jiān)測，為臨床醫(yī)生快速準確掌握患者的疾病狀態(tài)和病情嚴重程度，及時采取更具個性化的防治方案提供支持，從而最大限度減緩NSCLC進展，避免不恰當?shù)闹委煟纳粕钯|(zhì)量和延長存活時間。miR-486、miR-30d、miR-l和miR-499對于肺癌細胞遷移能力的影響表明這四種miRNA具有小分子藥物的應(yīng)用價值。本申請中"血清/血漿"中的"/"表示"和"及"或"的關(guān)系。本發(fā)明有益效果本發(fā)明提供的血清/血漿微小核糖核酸(microRNAs/miRNAs)標志物作為NSCLC預(yù)后輔助判斷和治療決策的標志物的優(yōu)越性在于(1)血清/血漿miRNAs是一種新型生物標志物，區(qū)別于傳統(tǒng)生物標志物，不僅穩(wěn)定、微創(chuàng)、易于檢測，且定量精確，將大大提高疾病診斷的敏感性和特異性，該類小分子RNA生物標志物的成功開發(fā)將為NSCLC的優(yōu)化治療開創(chuàng)全新局面，為其他疾病生物標志物的研制提供借鑒。'(2)血清/血漿miRNAs試劑盒是一種系統(tǒng)、全面的診斷和監(jiān)測試劑盒，可用于NSCLC患者的預(yù)后判斷、療效評價及對病情發(fā)展的動態(tài)監(jiān)測，有助于了解NSCLC患者疾病進展情況，反映患者的疾病狀態(tài)，為臨床醫(yī)生快速準確掌握患者病情、及時采取更具個性化的防治方案提供支持。(3)采用嚴密、多階段的驗證和評價體系，本發(fā)明人初期采用Solexa全基因組測序技術(shù)對血清/血槳miRNAs的進行直接測序以獲取疾病特異和異常表達的血清/血漿miRNAs表達譜，并應(yīng)用qRT-PCR的方法在大樣本中進行了多階段驗證；以上方法和策略的應(yīng)用加速和保證了血清/血漿miRNAs生物標志物和診斷試劑盒在臨床上的應(yīng)用，也為其他疾病生物標志物的研制提供方法和策略上的借鑒。(4)miR-486、miR-30d、miR-l和miR-499對于肺癌細胞遷移能力的影響表明這四種miRNA不但可以作為標志物，本身可以改變肺癌細胞的遷移、轉(zhuǎn)移能力，具有小分子藥物的應(yīng)用價值。本發(fā)明通過控制臨床分期、手術(shù)、化療等影響預(yù)后的因素，研究血清/血漿miRNA在非小細胞肺癌個性化輔助治療決策方面的重大應(yīng)用前景，闡述異常表達的miRNAs對于肺癌細胞遷移、轉(zhuǎn)移能力的影響，揭示其治療價值。因此，本發(fā)明獲得了肺癌預(yù)后特異性血清/血漿miRNAs表達數(shù)據(jù)庫和特異性標志物，尤其是早期患者預(yù)后診斷試劑盒，可作為個性化治療的輔助決策依據(jù)，并為干預(yù)這些miRNAs達到控制肺癌轉(zhuǎn)移和遷移提供了數(shù)據(jù)支持；通過血清/血槳miRNAs生物標志物和診斷試劑盒的研制和應(yīng)用，可使得肺癌的個性化治療和動態(tài)監(jiān)測更加方便易行，為臨床醫(yī)生快速準確掌握患者病情，為尋求個體化治療方案以及后期臨床應(yīng)用效果評價奠定基礎(chǔ)，并為發(fā)現(xiàn)具有潛在治療價值的新型小分子藥物提供幫助。圖1:顯示4種miRNAs與NSCLC患者預(yù)后情況的Kaplan-Meier曲線估計。A.Training組(120例病人)；B.Testing組(123例病人)；C.全體研究樣本(303例病人)。A、B、C圖顯示的研究結(jié)果順序依次為miR-486，miR-30d,miR-1和miR-499(參考表2，表5和表7)。圖2:顯示303例NSCLC患者危險度評分分析結(jié)果。上圖顯示危險度分值分布情況；中圖顯示NSCLC患者生存狀態(tài)和生存時間；下圖顯示NSCLC患者miRNA表達情況，橫軸表示病人，縱軸表示miRNA。圖3.顯示體外miRNA表達情況改變肺癌細胞的遷移。上圖顯示95-D細胞系的遷移試驗；下圖顯示95-C細胞系的遷移試驗。分別與NC(對照miRNA前體或者空pcDNA3.1載體)相比，均顯著降低(95-D細胞，miR-499或miR-l)或增加(95-C細胞，miR-486，miR-30d或反義的miR-30di)肺癌細胞的遷移能力*/<0.05.0.01。migrationassay:遷移實驗；precursor:前體miRNA;vector:表達載體?？v坐標遷移細胞數(shù)。具體實施例方式實施例1樣品的收集和樣品資料的整理發(fā)明人于2003月7月開始至今從江蘇省腫瘤醫(yī)院和南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院收集了大量的NSCLC患者血清樣品，通過對樣品資料的整理，發(fā)明人從中選擇了303例符合下列標準的樣本作為Solexa測序和后續(xù)一系列qRT-PCR驗證的實驗樣品1、新發(fā)I-IIIa期腺癌和鱗狀細胞癌；122、均經(jīng)過手術(shù)及術(shù)后輔助化療；3、采血前未經(jīng)過手術(shù)和放化療，無手術(shù)前放化療。并系統(tǒng)采集了這些樣本的人口學資料、臨床資料和隨訪資料等情況。實施例2血清/血漿中微小核糖核酸的Solexa測序?qū)嶒炘谏鲜?03例符合條件的NSCLC患者中，選擇30位最后一次隨訪時生存期超過30個月(34.6-61.8個月，平均49.54個月)的存活病人作為"長期生存"組，另外選擇30位生存時間小于25個月(2.0-22.5個月，平均9.54個月)的已死亡病人作為"短期生存"組，兩組間疾病臨床分期和吸煙情況精確匹配，均進行手術(shù)和術(shù)后輔助化療，組織類型也不存在差異，除了生存情況和生存時間外基本均衡可比(見表5)。將這兩組人群作為探索性樣本經(jīng)Solexa測序試驗獲得相關(guān)結(jié)果。具體步驟為1、分別取"長期生存"組和"短期生存"組患者的血清50ml，加入等體積的Trizol試齊U;2、相分離室溫放置15min,然后按0.2ml氯仿/1mlTrizol試劑的體積比加入氯仿，震蕩15s,室溫15min，12,000g，4'C,離心15min;3、將水相轉(zhuǎn)移到新的50ml的離心管，3步苯酚/氯仿除去蛋白相；4、RNA沉淀將水相轉(zhuǎn)移到新的離心管中，按0.5ml異丙醇/lmlTrizol試劑體積加入異丙醇，-2(TC保存60min，12，000g,4'C,離心60min;5、用lmlTrizol試劑重懸沉淀，將懸液轉(zhuǎn)移到新的1.5ml的離心管中；6、重復(fù)2，4步(第四步離心改為15min);7、RNA洗滌去掉上清，加入75°/。乙醇，12，000g，4'C離心5min;8、測量濃度通常能得到5ngRNA/50ml血清；9、總RNA進行PAGE電泳回收17-27ntRNA分子；10、將鏈接引物(adaptorprime)酶聯(lián)在小RNA分子的3'與5'端；11、進行RT-PCR反應(yīng)后并進行測序；12、數(shù)據(jù)分析與處理在"長期生存"組和"短期生存"組NSCLC患者中運用Solexa測序方法發(fā)現(xiàn)的血清差異表達的微小核糖核酸在上文中已經(jīng)羅列出。實施例3探索性樣本血清中微小核糖核酸的qRT-PCR實驗根據(jù)上述Solexa結(jié)果，選擇滿足下列條件的miRNA用qRT-PCR方法進一步的驗證1)在兩組NSCLC患者中倍數(shù)差異達5倍的miRNAs作為本發(fā)明中初步篩查的血13清生物標志物，2)這些miRNAs中至少在一組NSCLC患者("長期生存"組或"短期生存"組)中的拷貝數(shù)大于50以提高檢測效率。滿足上述條件的miRNAs包括miR陽486，miR陽22，miR陽30d，miR-21,miR-26b,let7i，miR-378，miR-l,miR-206，miR-146b和miR-499。此外，兩個let-7家族成員(let-7a和let-7g)雖然僅存在兩倍差異，但是己有研究報道這兩個miRNAs與肺癌預(yù)后相關(guān)聯(lián)，因此也包含在我們的研究中。根據(jù)所選miRNAs設(shè)計逆轉(zhuǎn)錄和q-PCR的引物(詳見表4)。用表4所提供的引物對"長期生存"組和"短期生存"組患者的血清進行miRNA的qRT-PCR檢驗。(1)制備cDNA樣品a)取50(^1血清；b)加等體積的水飽和酚，振蕩混勻，4'C，13200rpm離心3分鐘，取上清；c)上清+1/2體積(250^1)苯酚+1/2體積(250pl)氯仿，振蕩混勻，4'C，13200rpm離心3分鐘，取上清；d)加—與上清等體積的氯仿震蕩混勻，4'C，13200rpm離心3分鐘，取上清作為RNA樣品；e)然后通過RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA。逆轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系包括4^15xAMV緩沖液、2pl10mMdNTP混合物(Takara公司)、0.5^1RNase抑制劑(Takara公司)、2^1AMV(Takara公司)以及1.5plmiRNA特異性反向引物一種或幾種的混合物。反應(yīng)步驟為16'C孵育15分鐘，42'C反應(yīng)1小時，85'C孵育5分鐘；(2)q-PCR:將cDNA按1/5體積稀釋，取1^1稀釋后的cDNA，加入0.3^1Taq酶(Takara公司)，lpl20xEVAGREEN，0.2^110pM正向引物一種，0.2^110pM通用反向引物，1.2^125mMMgCl2，1.6pl2.5mMdNTP混合物(Takara公司)，2^110xPCR緩沖液，13.5^ilH20，20^1體系進行q-PCR。儀器使用的是ABIPrism7300熒光定量PCR儀，PCR的反應(yīng)條件是95'C、5分鐘進行1個循環(huán)—95°C、15秒，60'C、l分鐘進行40個循環(huán)。兩組樣品血清miRNAs的表達量比值可用方程2_^表示，其中厶G:Orgr。w-CTgroup2,我們在每個檢測版中加入六平行的一個共用的健康人對照標本作為參照，計算相對表達量。qRT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)在60例探索性樣本中，有4個miRNAs(miR-486,miR-30d,miR-l和miR-499)在兩組患者中的表達情況存在顯著性差異，見表1。多因素Cox回歸分析結(jié)果表明，這4個miRNAs的表達水平均與早期NSCLC患者死亡風險存在著計量-反應(yīng)關(guān)系兩個為危險因素(miR-486和miR-30d，高表達死亡風險顯著增加)，兩個為保護因素(miR-l和miR-499，高表達死亡風險顯著減少)。具有4種miRNAs不同表達水平(以四分位數(shù)表示)的患者之間的中位生存期存在顯著的統(tǒng)計學差異，見表6。14實施例4血清中微小核糖核酸qRT-PCR實驗的進一步研究根據(jù)上述結(jié)果，將這4個與NSCLC預(yù)后相關(guān)的miRNAs在另外243例NSCLC患者中進一步的驗證。我們采用隨機數(shù)字方法將243例NSCLC患者隨機的分配到Training組和Testing組，見表5。表達量檢測方法參見實施例3。在Training組隊列人群中我們發(fā)現(xiàn)血清高表達miR-486，miR-30d和低表達miR-l和miR-499均與NSCLC預(yù)后不良相關(guān)聯(lián)，見表7,圖1A。在Testing組隊列人群中進行驗證的結(jié)果與Training組相類似，見表7,圖1B。將所有303例研究樣本的結(jié)果整合，我們同樣得到與Training組一致的結(jié)果，見圖1C;血清/血漿高表達危險型miRNAs和低表達保護型miRNAs的病人的中位生存期顯著縮短，見表2。逐步Cox回歸分析結(jié)果也表明，4個miRNAs均與NSCLC的預(yù)后獨立相關(guān)(見表8)。實施例5利用危險度評分方法進一步分析4個微小核糖核酸與NSCLC預(yù)后我們根據(jù)Training組隊列人群的危險分值的中位數(shù)作為界值將Training組劃分成高危險組和低危險組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高危險組的病人與低危險組的病人相比，其中位生存期時間較短，死亡風險增加了9.74(HR=10.74)，見表3。相同的危險度評分計算方法和界值均應(yīng)用于Testing隊列組以及所有的303例病例中，得到的結(jié)果均與Training組獲得的結(jié)果相一致，見表3。對于4個標志物的聯(lián)合分析，如圖2，危險度評分大于0.415的NSCLC患者(同時滿足高表達miR-486，miR-30d和低表達miR-l，miR-499)傾向于較短的生存時間，顯示綜合考慮4個標志物有更好的輔助判斷效果。實施例6利用體外功能學試驗研究4種miRNAs在調(diào)控肺癌細胞遷移過程中的作用我們將保護性miRNAs(miR-l或miR-499)化學合成的前體(pre-miRNAs)或表達載體(pcDNA-miR-l或pcDNA-miR-499)分別轉(zhuǎn)染入高侵襲性細胞系(95-D)中，將高危險性miRNAs(miR-486或miR-30d)化學合成的前體(pre-miRNAs)或表達載體(pcDNA-miR-486或pcDNA-miR-30d)分別轉(zhuǎn)染入低侵襲性細胞系(95-C)中，由于miR-30d在95-C肺癌細胞系中高表達，反義miR-30d序列(miR-30di，序列5，CUUCCAGUCGGGGAUGUUUACA)也被瞬時轉(zhuǎn)染入95-C肺癌細胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分別與對照相比，轉(zhuǎn)染了保護性miRNAs和miR-30di的腫瘤細胞的遷移能力明顯下降，而轉(zhuǎn)染了高危險性miRNAs的細胞遷移能力明顯增強，見圖3。另外，表達載體(pcDNA-miR-l或pcDNA-miR-499)轉(zhuǎn)染入高侵襲性細胞系(95-D)的結(jié)果證實了上述的15發(fā)現(xiàn)miR-l和miR-499抑制細胞遷移活性，而miR-486和miR-30d促進肺癌細胞的遷移，見圖3。研究發(fā)現(xiàn)的這4種miRNAs均可以影響細胞的遷移過程，而該過程是惡性腫瘤(包括NSCLC)進展的關(guān)鍵步驟之一，因此，該研究表明miR-l或miR-499可作為制備治療NSCLC的藥物，而在miR-486或miR-30d高表達患者中，抑制miR-486或miR-30d表達，如使用miR-30di也可以用于制備抑制非小細胞肺癌轉(zhuǎn)移的藥物中。實施例7用于NSCLC預(yù)后輔助判斷的微小核糖核酸試劑盒的制作微小核糖核酸試劑盒的制作和操作流程是基于solexa測序技術(shù)和real-timePCR技術(shù)和核酸微陣列、雜交等技術(shù)。試劑盒包括一批血清/血漿微小核糖核酸引物(包括下列引-物中的一對或多對miR-486的引物為SEQIDNo.23和SEQIDNo.24;miR30d的引物為SEQIDNo.15和SEQIDNo.16;miR-l的引物為SEQIDNo.7和SEQIDNo.8;miR-499的引物為SEQIDNo.25和SEQIDNo.26)，還可以有相應(yīng)PCR技術(shù)所需的常用試劑，如逆轉(zhuǎn)錄酶，緩沖液，dNTPs，MgCl2，DEPC水，熒光探針，RNA酶抑制劑，Taq酶等，可根據(jù)具體采用的實驗方法選用，如可選用實施例3中相應(yīng)實驗采用的試劑中的一種或多種，這些常用試劑都是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，另外還可以有標準品和對照(如定量標化的正常人樣本等)。此試劑盒的價值在于只需要血清/血漿而不需要其它組織樣品，通過最精簡的熒光或探針法檢測微小核糖核酸的變化趨勢，再通過該趨勢輔助判斷NSCLC的預(yù)后情況或死亡風險，不僅穩(wěn)定，檢測方便，且定量精確，大大提高疾病診斷的敏感性和特異性，因此將此試劑盒投入實踐，可以幫助指導(dǎo)診斷和更有效的個體化治療。表l.長期生存組和短期生存組樣本SoIexa測序結(jié)果比較miRNA樣本量長期生存組拷貝數(shù)1均數(shù)標準中位數(shù)樣本量拷貝數(shù)1短期生存組均數(shù)±標準差中位數(shù)Ratio2/>值3miR-486301630.658±0.3610.669303205U29±0.5421.0650.0510.0002miR-2230180.722±1.2250.375302091.103±2.4010.254O扁0.443miR-30d30280.455±0.3710.341301651.353±0.7381.1220.1704J0xl(T7miR-21302301.490±0.544l.柳30441.239±0.5011.2395.227O細miR-26b30561.423±1.3370.94330101.240±0.9735.6000.545let-7i301532.249±1.8051.78930261.845±1.1391.5635.8850.304miR-378302122.946±5.9630.74030344.407±11.3351.0426.2350.535miR-13029182.918±3.8181.182304070.408±0.6080.1807.170O週miR-2063019791.471±0.8981.450301%1.500±1.023U7910.0970.卯7miR-146b30811.309±1.0121.1143061.299±0.8231.31513.5000.966miR-499301121.096±0.4651.0393060.683±0.2690.71218.6670細1let-7a3015360.857±0.3840.776307420》07±0.3801.0352.0700.615let-7g301761,430±0.7331.38230591.4,7751.2572.9830.91930例混合樣本Solexa測序結(jié)果:長期生存組的拷貝數(shù)/短期生存組的拷貝數(shù)'Studentt，檢驗200910184518.4轉(zhuǎn)溢也械15/263<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表4.miRNA引物信<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>表6.探索性樣本人群中4種miRNAs表達水平與NSCLC預(yù)后關(guān)系<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>'經(jīng)性別、年齡和組織類型調(diào)整(臨床分期、吸煙情況完全匹配)Ql表示miRNA表達水平小于等于25百分位數(shù)，Q2表示miRNA表達水平大于25百分位數(shù)且小于等于50百分位數(shù)，Q3表示miRNA表達水平大于50百分位數(shù)且小于等于75百分位數(shù)，Q4表示miRNA表達水平大于75百分位數(shù)。Qn后面的括號內(nèi)的數(shù)據(jù)即為25、50和75百分位lt。表7.Training/Testing樣本人群中4種miRNAs表達水平與NSCLC預(yù)后關(guān)系miRNAsTraining/Testing病人死亡人數(shù)中位生存期(月)Log-rank<P值調(diào)整HR1(950/oCI)'Training組調(diào)整HR2(95%CI)1Testing組miR-486低<=0.795高>0.79560/6260/6116/2024/23未達到/39.9331.33/31.330.070/0.0581.001.86(0.94-3.66)1.001.71(0.92-3.20)miR-30d低<=0.680高>0.68060/5860/6513/1727/26未達至lj/42.622.97/31.60.0001/0.0071.00'4.46(2.17-9.17)1.002.97(1.51-5.86)miR-l高>0.675低<=0.67560/6260/6111/1629/2741.67/42.622.97/31.80.006/0.0211.002.95(1.44-6.06)1.003.11(1.57-6.19)miR-499高>0.750低<=0.75058/7462/4913/2127/2238.53/43.1722.97/31.60.005/0.0491.002.61(1.33-5.15)1.002.44(1.274.70)4至性別、年齡、吸煙狀況、組織類型和臨床分期調(diào)整每種miRNA的高表達和低表達參數(shù)來自于Training樣本表達量的中位數(shù)，見統(tǒng)計分析部分表8.逐步Cox回歸分析確最后納入方程的變量PSEHR95%CI尸疾病分期(nia期vs.mi期)0.480.121.621.28-2.04<0.0001miR-486(高表達vs.低表達)0.920.222.511.64-3.83<0細1miR-30d(高表達vs.低表達)1.410.234.102.62-6.40<0扁1miR-1(低表達vs.高表達)1.190.233.282.09-5.13<0扁1miR-499(低表達vs.高表達)0.990.212.701.78-4.08<0細1〈110〉南京醫(yī)科大學〈120〉一種與非小細胞肺癌預(yù)后相關(guān)的血清/血漿miRNA標志物及其應(yīng)用<160〉28<210>1<211〉30<212〉腿〈213〉hsa-let-7a上游引物〈400〉1'acactccagctgggtgaggtagtaggttgt30〈210〉2<211>44<212>DNA〈213〉hsa-let-7a下游引物<400>2ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgagaactatac44<210>3〈211〉30<212>腿<213>hsa-let-7g上游引物〈400〉3acactccagctgggtgaggtagtagtttgt30〈210〉4<211〉44<212〉DNA〈213〉hsa-let-7g下游引物〈400>4ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgagaactgtac44<210〉5<211〉30<212〉■〈213〉hsa-let-7i上游引物〈400〉5acactccagctgggtgaggtagtagtttgt30<210>6<211>44<212>DNA<213〉hsa-let-7i下游引物〈400〉6ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgagaacagcac44〈210>7<211〉30<212>腿〈213>hsa-miR-l上游引物<400〉7acactccagctgggtggaatgtaaagaagt30〈210〉8〈211〉44〈212〉<213〉hsa-miR-l下游引物<400>8ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgagatacatac44〈210〉9〈211〉30<212〉DNA<213〉hsa-miR-21上游引物〈400〉9acactccagctgggtagcttatcagactga30〈210〉10<211>44<212〉DNA<213〉hsa-miR-21下游引物<400〉10ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgagtcaacatc44〈210〉11〈211>30〈212>腿<213>hsa-miR-22上游引物〈400〉11acactccagctgggaagctgccagttgaag30〈210〉12〈211〉44〈212〉DNA<213>hsa-miR-22下游引物<400>1225ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgagacagttct44〈210〉13<211>29<212〉腿<213〉hsa-miR-26b上游引物<400>13acactccagctgggttcaagtaattcagg29<210>14〈211〉44<212>DNA'<213>hsa-miR-26b下游引物<400>14—ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgagacctatcc44<210>15<211〉30〈212〉隱〈213〉hsa-miR-30d上游引物〈400〉15acactccagctgggtgtaaacatccccgac30〈210〉16〈211〉44<212>DNA〈213〉hsa-miR-30d下游引物〈400〉16ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgagcttccagt44〈210〉17〈211〉30〈212〉DNA<213>hsa-miR-146b上游引物〈400〉17acactccagctgggtgagaactgaattcca30<210>18<211>44<212>DNA〈213〉hsa-miR-146b下游引物〈400〉18ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgagagcctatg4426〈210>19<211>30〈212〉DNA〈213〉hsa-raiR-206上游引物<400〉19acactccagctgggtggaatgtaaggaagt30〈210〉20〈211〉44〈212>DNA〈213〉hsa-miR-206下游引物〈400〉20ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgagccacacac44〈210>21<211>29〈212>DNA〈213〉hsa-miR-378上游引物〈400〉21acactccagctgggactggacttggagtc29〈210〉22〈211〉44<212〉DNA〈213〉hsa-miR-378下游引物〈400〉22ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgagccttctga44〈210〉23<211>30<212〉DNA〈213〉hsa-miR-486上游引物<400>23acactccagctgggtcctgtactgagctgc30〈210〉24〈211〉44〈212〉腿〈213〉hsa-miR-486下游引物〈400〉24ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgagctcggggc44〈210>25〈211>29〈212〉DNA<213>hsa-miR-499上游引物〈400〉25acactccagctgggttaagacttgcagtg29〈210〉26〈211〉44〈212〉DNA〈213〉hsa-miR-499下游引物〈400〉26ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgagaaacatca44〈210〉27〈211>16.〈212〉DNA〈213〉通用反向引物(URP)<400>27tggtgtcgtggagtcg16〈210〉28<211〉22<212>RNA〈213〉miR-30di<400〉28cuuccagucggggauguuuaca2228權(quán)利要求1、一種與非小細胞肺癌預(yù)后相關(guān)的血清/血漿miRNA標志物，其特征在于該標志物為miR-486、miR30d、miR-1或miR-499中的一種或多種。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的血清/血漿miRNA標志物，其特征在于該標志物為miR-486、miR30d、miR-l或miR-499中二種以上的組合；優(yōu)選miR-l與miR-499組合，或者miR-486與miR30d組合；進一步優(yōu)選miR-486、miR30d、miR-l以及miR-499構(gòu)成的組合。3、權(quán)利要求1或2所述的血清/血漿.miRNA標志物在制備非小細胞肺癌預(yù)后輔助診斷試劑盒或治療非小細胞肺癌的藥物中的應(yīng)用。4、miR-l或miR-499在制備抑制非小細胞肺癌轉(zhuǎn)移的藥物中的應(yīng)用；在miR-486或miR-30d高表達患者中，抑制miR-486或miR-30d表達在制備抑制非小細胞肺癌轉(zhuǎn)移的藥物中的應(yīng)用。5、權(quán)利要求l所述的血清/血漿miRNA標志物的引物，其特征在于該引物為miR-486的引物為SEQIDNo.23和SEQIDNo.24;miR30d的引物為SEQIDNo.15和SEQIDNo.16;miR-l的引物為SEQIDNo.7禾卩SEQIDNo.8;miR-499的引物為SEQIDNo.25和SEQIDNo.26。6、權(quán)利要求5所述的任意一對或多對血清/血漿miRNA標志物的引物在制備非小細胞肺癌預(yù)后輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。7、一種非小細胞肺癌預(yù)后輔助診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒含有血清/血漿miRNA中miR-486、miR30d、miR-l或miR-499—種或多種miRNA的引物。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒含有權(quán)利要求5所述任意一對或多對血清/血漿miRNA標志物的引物。9、根據(jù)權(quán)利要求7或8所述診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒還可以包括PCR技術(shù)常用的試劑。全文摘要本發(fā)明屬于基因工程及腫瘤學領(lǐng)域，涉及一種與非小細胞肺癌預(yù)后相關(guān)的血清/血漿miRNA標志物及其應(yīng)用。該標志物為miR-486、miR30d、miR-1或miR-499中的一種或多種。該標志物可用于制備非小細胞肺癌預(yù)后輔助診斷試劑盒或治療非小細胞肺癌的藥物。文檔編號C12N15/11GK101638656SQ200910184518公開日2010年2月3日申請日期2009年8月28日優(yōu)先權(quán)日2009年8月28日發(fā)明者張承宇,張鳴鳳,科曾,沈洪兵,胡志斌,靜董,熹陳,靳光付,馬紅霞申請人:南京醫(yī)科大學