專(zhuān)利名稱(chēng)：：非小細(xì)胞肺癌分子標(biāo)志物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及人富亮氨酸α2糖蛋白、人C4結(jié)合蛋白和人血清淀粉樣蛋白這三種蛋白質(zhì)或單獨(dú)或聯(lián)合用作非小細(xì)胞肺癌分子標(biāo)記物以及用作非小細(xì)胞肺癌預(yù)后的指標(biāo)的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：肺癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在全部惡性腫瘤中占第一位。在我國(guó)，肺癌已成為惡性腫瘤死亡的首位，占全部惡性腫瘤死亡病例的22.7%，且發(fā)病率和死亡率仍在繼續(xù)上升。2000-2005年間，我國(guó)肺癌患者增加了12萬(wàn)，如不及時(shí)采取有效的控制措施，預(yù)計(jì)到2025年，患者人數(shù)將達(dá)到100萬(wàn)，成為世界第一肺癌大國(guó)。肺癌可以分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌，其中后者占大約80%。非小細(xì)胞肺癌又可以分為三類(lèi)鱗癌、腺癌和大細(xì)胞癌。導(dǎo)致肺癌發(fā)生的因素有很多，吸煙、遺傳因素，放射性氡氣、石棉等都是風(fēng)險(xiǎn)因素。肺癌的死亡率高，五年生存率不足15%。一個(gè)重要的原因是早期診斷率低，不足2%，80%以上患者就診時(shí)已在晚期。目前的診斷方法有X-射線(xiàn)檢查、CT掃描、支氣管鏡檢、痰細(xì)胞學(xué)檢查以及肺癌生物標(biāo)志物檢測(cè)等。這些方法都存在各自的缺陷，如影像學(xué)技術(shù)難以發(fā)現(xiàn)瘤體較小的腫瘤，早期普查的漏檢率較高。已有的肺癌標(biāo)志物是廣譜的，無(wú)法確診肺癌，因此尋找特異性的肺癌生物標(biāo)志物具有重要的意義。除了診斷方法上的不足外，肺癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)也是一個(gè)突出的問(wèn)題。肺癌的轉(zhuǎn)移部位多，轉(zhuǎn)移途徑也很多，有淋巴轉(zhuǎn)移、局部直接蔓延、血行轉(zhuǎn)移和局部種植等。而復(fù)發(fā)的原因也很不明確，目前報(bào)道可能與手術(shù)效果，肺癌類(lèi)型、分期以及患者的免疫力強(qiáng)弱等因素有關(guān)。目前尚未見(jiàn)有關(guān)用作肺癌預(yù)后的生物標(biāo)志物的報(bào)道。如果能在手術(shù)之前預(yù)測(cè)不同病人的預(yù)后效果，將可以針對(duì)病人的情況優(yōu)化治療方法，對(duì)預(yù)后差的病人采取保守治療，具有十分重要的臨床意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
發(fā)明內(nèi)容針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明找到了三個(gè)肺癌特異相關(guān)的生物標(biāo)志物，分別為人富亮氨酸α2糖蛋白、人C4結(jié)合蛋白和人血清淀粉樣蛋白。統(tǒng)計(jì)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，這三種蛋白質(zhì)在血液中的水平可用作非小細(xì)胞肺癌預(yù)后的指標(biāo)。本發(fā)明者利用MRM技術(shù)結(jié)合絕對(duì)定量法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)對(duì)象是否患有非小細(xì)胞肺癌的檢測(cè)以及對(duì)患有非小細(xì)胞肺癌患者進(jìn)行預(yù)后。本發(fā)明第一方面涉及人富亮氨酸α2糖蛋白或其片段、人C4結(jié)合蛋白或其片段、人血清淀粉樣蛋白或其片段、或其組合在制備用于檢測(cè)對(duì)象是否患有非小細(xì)胞肺癌或?qū)加蟹切〖?xì)胞肺癌患者進(jìn)行預(yù)后的制劑中的應(yīng)用。本發(fā)明另一方面涉及與人富亮氨酸α2糖蛋白、人C4結(jié)合蛋白或人血清淀粉樣蛋白特異性結(jié)合的物質(zhì)或其組合在制備用于檢測(cè)對(duì)象是否患有非小細(xì)胞肺癌或?qū)加蟹切〖?xì)胞肺癌患者進(jìn)行預(yù)后的制劑中的應(yīng)用。本發(fā)明另一方面還提供了一種用于對(duì)患有非小細(xì)胞肺癌患者進(jìn)行預(yù)后的試劑盒，所述試劑盒包含SEQIDNO:1所示的氨基酸序列、SEQIDNO:2所示的氨基酸序列、SEQIDNO3所示的氨基酸序列或其組合。本發(fā)明的其它方面和優(yōu)點(diǎn)可通過(guò)參閱以下具體實(shí)施方案的描述并結(jié)合附圖來(lái)知曉。圖1為C4BP、LRGl和SAA三種蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)肽段的Transition的線(xiàn)性檢測(cè)范圍。其中圖IA為C4BP蛋白對(duì)應(yīng)肽段的Transition的線(xiàn)性檢測(cè)范圍；圖IB為L(zhǎng)RGl蛋白對(duì)應(yīng)肽段的Transition的線(xiàn)性檢測(cè)范圍；圖IC為SAA蛋白對(duì)應(yīng)肽段的Transition的線(xiàn)性檢測(cè)范圍。圖2為利用多重反應(yīng)監(jiān)控技術(shù)檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)血液樣品和正常對(duì)照血液樣品中C4BP、LRGl和SAA三種蛋白質(zhì)的水平。圖2A為非小細(xì)胞肺癌血液樣品和正常對(duì)照血液樣品中C4BP蛋白的水平；圖2B為非小細(xì)胞肺癌血液樣品和正常對(duì)照血液樣品中LRGl蛋白的水平；圖2C為非小細(xì)胞肺癌血液樣品和正常對(duì)照血液樣品中SAA蛋白的水平。圖3為根據(jù)70例肺癌樣本和25例正常對(duì)照樣本繪制的C4BP蛋白、LRGl蛋白和SAA蛋白單獨(dú)以及聯(lián)合的ROC曲線(xiàn)。圖4為根據(jù)20對(duì)肺鱗癌樣本繪制的C4BP蛋白、LRGl蛋白和SAA蛋白單獨(dú)以及聯(lián)合的ROC曲線(xiàn)(上)與對(duì)應(yīng)的KM曲線(xiàn)(下)。(A)C4BP蛋白；⑶LRGl蛋白；(C)SAA蛋白；(D)三種蛋白質(zhì)聯(lián)合。具體實(shí)施例方式雖然之前的研究分別發(fā)現(xiàn)了這三種蛋白質(zhì)在肺癌患者的血漿中上調(diào)，但目前還沒(méi)有研究工作同時(shí)對(duì)這三種蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，也沒(méi)有將這三種蛋白質(zhì)聯(lián)合用作分子標(biāo)記物，更沒(méi)有一篇報(bào)道或單獨(dú)或聯(lián)合利用這三種蛋白質(zhì)進(jìn)行預(yù)后研究。另外，早前的研究，或僅利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)了差異表達(dá)，或僅利用免疫印跡的方法進(jìn)行驗(yàn)證，而本發(fā)明利用最新的MRM技術(shù)結(jié)合絕對(duì)定量法準(zhǔn)確測(cè)定了這三種蛋白質(zhì)在肺癌患者血液或正常對(duì)照血清中的濃度，證明了它們之間存在顯著差異(肺癌患者血清中上調(diào))。另外，統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)它們?cè)谘褐械乃娇梢杂米龇切〖?xì)胞肺癌(尤其是肺鱗癌和肺腺癌)的預(yù)后指標(biāo)。因此，本發(fā)明第一方面涉及人富亮氨酸α2糖蛋白或其片段、人C4結(jié)合蛋白或其片段、人血清淀粉樣蛋白或其片段、或其組合在制備用于檢測(cè)對(duì)象是否患有非小細(xì)胞肺癌或?qū)加蟹切〖?xì)胞肺癌患者進(jìn)行預(yù)后的制劑中的應(yīng)用。人富亮氨酸α2糖蛋白(Leucine-richalpha-2-glycoprotein,LRG1)的Swiss-Prot號(hào)為P02750，IPI號(hào)為IPI00022417。LRGl是一個(gè)存在于血液中的糖蛋白，人們目前對(duì)它的功能了解還不多。它在中性粒細(xì)胞的分化早期表達(dá)上調(diào)(0'Donnell,L.C.,L.J.Druhan,andB.R.Avalos,Molecularcharacterizationandexpressionanalysisofleucine-richalpha2-glycoprotein,anovelmarkerofgranulocyticdifferentiation.JLeukocBiol,2002.72(3):p.478-85.)。研究發(fā)現(xiàn)它可以作為某些微生物感染和癌癥的標(biāo)志物。如該蛋白在胰腺癌患者的血清中呈現(xiàn)上調(diào)(Kakisaka，Τ.，etal.,Plasmaproteomicsofpancreaticcancerpatientsbymulti-dimensionalliquidchromatographyandtwo-dimensionaldifferencegelelectrophoresis(2D-DIGE)up—regulationofleucine-richalpha-2-glycoproteininpancreaticcancer.JChromatogrBAnalytTechnolBiomedLifeSci，2007.852(1-2):p.257-67)。它在肺癌患者的血清中也呈現(xiàn)上調(diào)(Okano,Τ.,etal.,Plasmaproteomicsoflungcancerbyalinkageofmulti-dimensionalIiquidchromatographyandtwo-dimensionaldifferencegelelectrophoresis.Proteomics,2006.6(13):p.3938-48)。人C4結(jié)合蛋白(C4b-bindingproteinalphachain,C4BPA)的Swiss—Prot號(hào)為P04003，IPI號(hào)為IPI00021727。C4BPA是一種糖蛋白，參與補(bǔ)體活化的經(jīng)典途徑。早前的研究發(fā)現(xiàn)，C4BPA蛋白在肺癌患者的血清中高表達(dá)(Ueda，K.，etal.，Comparativeprofilingofserumglycoproteomebysequentialpurificationofglycoproteinsand2-nitrobenzensulfenyl(NBS)stableisotopelabeling-.anewapproachforthenovelbiomarkerdiscoveryforcancer.JProteomeRes,2007.6(9):p.3475-83.)。(SerumamyloidAproteinprecursor,SAA)白勺Swiss—Prot號(hào)為P02735，IPI號(hào)為IPI00552578。利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析鱗癌患者的血漿和正常人血漿，發(fā)現(xiàn)SAA在鱗癌患者的血清中上調(diào)(Dowling，P.，etal.，2_DdifferencegeIelectrophoresisofthelungsquamouscellcarcinomaversusnormalserademonstratesconsistentalterationsinthelevelsoftenspecificproteins.Electrophoresis,2007.28(23):p.4302-10.)。本發(fā)明所用的人富亮氨酸α2糖蛋白(也稱(chēng)為L(zhǎng)RG1)、人C4結(jié)合蛋白(也稱(chēng)為C4BP)、人血清淀粉樣蛋白(也稱(chēng)為SAA)的含義還包括了這些蛋白的具有相同或相似生物活性或功能的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)相對(duì)于所述多肽的氨基酸序列有若干個(gè)(較佳地1-10個(gè)，更佳為1-5個(gè)，最佳為1-3個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代。另外，所述缺失或插入(增加)也可發(fā)生在C末端和/或N末端(通常有20個(gè)以?xún)?nèi)，較佳地為10個(gè)以?xún)?nèi)，更佳地為5個(gè)以?xún)?nèi)的氨基酸缺失或增加)。在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。上述變異形式還包括上述蛋白的類(lèi)似物。這些類(lèi)似物與天然蛋白的差別可以是氨基酸序列上的差異和/或不影響序列的修飾形式上的差異。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，宜采用所述蛋白的片段。所述片段應(yīng)當(dāng)與樣品中的蛋白或其經(jīng)過(guò)酶解(如胰蛋白酶酶解)后得到的片段的序列完全一致。為方便操作，所述片段的長(zhǎng)度宜為5-50個(gè)氨基酸，優(yōu)選6-30個(gè)氨基酸，更優(yōu)選為6-25個(gè)氨基酸。此外，所述片段的最佳Transition應(yīng)有較好的信噪比。所述宜經(jīng)過(guò)重同位素(例如13C)標(biāo)記，以便將其與未經(jīng)標(biāo)記的樣品相區(qū)分。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述人富亮氨酸α2糖蛋白片段為SEQIDNO=I所示的氨基酸序列；所述人C4結(jié)合蛋白片段為SEQIDNO:2所示的氨基酸序列；所述人血清淀粉樣蛋白片段為SEQIDNO:3所示的氨基酸序列。所述片段經(jīng)同位素1V標(biāo)記。本文所用的術(shù)語(yǔ)“人富亮氨酸α2糖蛋白或其片段、人C4結(jié)合蛋白或其片段、人血清淀粉樣蛋白或其片段、或其組合”指的是人富亮氨酸α2糖蛋白或其片段、人C4結(jié)合蛋白或其片段、人血清淀粉樣蛋白或其片段中兩者或三者的組合。一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案是將上述三種蛋白片段聯(lián)合用于檢測(cè)對(duì)象是否患有非小細(xì)胞肺癌或?qū)加蟹切〖?xì)胞肺癌患者進(jìn)行預(yù)后。對(duì)患有非小細(xì)胞肺癌患者進(jìn)行預(yù)后的步驟包括將一定量的經(jīng)過(guò)重同位素標(biāo)記的片段加入經(jīng)酶(如胰蛋白酶)消化的患者血清樣品中，用多重反應(yīng)監(jiān)控技術(shù)檢測(cè)患者血清中所述片段的水平，從而確定患者血清中人富亮氨酸α2糖蛋白、人C4結(jié)合蛋白或人血清淀粉樣蛋白的水平；將所測(cè)得的水平與根據(jù)未復(fù)發(fā)病人的水平確定的臨界值比較，如果所測(cè)得的水平高于臨界值，則表示該非小細(xì)胞肺癌患者的預(yù)后差。所述臨界值可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)常規(guī)手段來(lái)確定。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)測(cè)得的未復(fù)發(fā)病人(組)的血清蛋白質(zhì)含量數(shù)據(jù)來(lái)繪制受試者工作特征曲線(xiàn)(R0C曲線(xiàn))，隨后確定臨界值(cut-off)。多重反應(yīng)監(jiān)控(MultipleReactionMonitoring，MRM)技術(shù)又稱(chēng)作多重SRM技術(shù)(Selectedreactionmonitoring)，該技術(shù)充分利用了三級(jí)四極桿型(triplequadrupole,QQQ)質(zhì)譜的優(yōu)勢(shì)。在MRM模式中，第一個(gè)和第三個(gè)四極桿充當(dāng)了指定m/z的分子的篩選工具，在一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜的層次上，分別對(duì)指定肽段和指定肽段的指定碎片離子進(jìn)行兩個(gè)水平的篩選；而第二個(gè)四極桿則作為碎裂池(collisioncell)負(fù)責(zé)碎裂肽段母離子。在肽段和肽段碎片兩個(gè)層次通過(guò)很窄的分子量窗口(一般是0.7Da)進(jìn)行篩選，可以將同時(shí)間內(nèi)共洗脫的背景雜質(zhì)進(jìn)行過(guò)濾，具有很高的選擇性。MRM掃描模式不同于全掃描等其他模式，可以將傳統(tǒng)的全掃描模式的靈敏度提高一至兩個(gè)數(shù)量級(jí)。這種模式下的線(xiàn)性范圍可以達(dá)到5個(gè)數(shù)量級(jí)。這些性質(zhì)使得對(duì)高復(fù)雜度的樣品中某些低豐度的蛋白質(zhì)的檢測(cè)成為可能。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多重反應(yīng)監(jiān)控技術(shù)可以和以合成肽段為基礎(chǔ)的絕對(duì)定量技術(shù)(absolutequantificationanalysis,AQUA)相結(jié)合，這樣就可以直接對(duì)多個(gè)樣品中的某個(gè)或某些蛋白質(zhì)直接進(jìn)行絕對(duì)含量的檢測(cè)。因此，本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)樣品中某多肽含量的方法，該方法包括用諸如多肽合成儀來(lái)合成所述多肽，并用重同位素(如13C)對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記；然后將一定量的所述經(jīng)重同位素標(biāo)記的片段加入樣品中，用多重反應(yīng)監(jiān)控技術(shù)檢測(cè)樣品中所述多肽(或其碎片)的強(qiáng)度，通過(guò)比較未標(biāo)記多肽(即樣品中的多肽)或其碎片的強(qiáng)度與經(jīng)重同位素標(biāo)記的多肽的強(qiáng)度，確定樣品中所述多肽的含量。上述MRM結(jié)合絕對(duì)定量技術(shù)也可用于檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌，其步驟包括將一定量的所述經(jīng)過(guò)重同位素標(biāo)記的片段加入經(jīng)胰蛋白酶消化的患者血清樣品中，用多重反應(yīng)監(jiān)控技術(shù)檢測(cè)患者血清中所述片段的水平，從而確定患者血清中人富亮氨酸α2糖蛋白、人C4結(jié)合蛋白或人血清淀粉樣蛋白的水平；將所測(cè)得的水平與正常對(duì)照血清的水平比較，如果所測(cè)得的水平高于正常對(duì)照血清的水平，則表示該對(duì)象患有非小細(xì)胞肺癌。本發(fā)明另一方面還涉及與人富亮氨酸α2糖蛋白、人C4結(jié)合蛋白或人血清淀粉樣蛋白特異性結(jié)合的物質(zhì)或其組合在制備用于檢測(cè)對(duì)象是否患有非小細(xì)胞肺癌或?qū)加蟹切〖?xì)胞肺癌患者進(jìn)行預(yù)后的制劑中的應(yīng)用。在本發(fā)明的技術(shù)方案中，所述非小細(xì)胞肺癌患者可以是肺鱗癌患者、肺腺癌患者或大細(xì)胞肺癌患者。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述與人富亮氨酸α2糖蛋白、人C4結(jié)合蛋白或人血清淀粉樣蛋白特異性結(jié)合的物質(zhì)是抗體。此處的術(shù)語(yǔ)“抗體”具有最廣義地含義，其具體地包括單克隆抗體(包括全長(zhǎng)的單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)。術(shù)語(yǔ)“抗體”還包括完整分子的片段，例如能夠結(jié)合響應(yīng)抗原的Fab和F(ab')2。Fab和F(ab')2片段缺少完整抗體的Fc片段，能夠更迅速地從循環(huán)系統(tǒng)中清除，并且與完整抗體相比具有更低的非特異性組織結(jié)合性。本發(fā)明中有用的Fab和F(ab')2以及其他抗體片段也可用于檢測(cè)和定量測(cè)定人富亮氨酸α2糖蛋白、人C4結(jié)合蛋白或人血清淀粉樣蛋白，只要它們表現(xiàn)出所需的特異性結(jié)合的活性。這些片段通?？捎媚竟厦?產(chǎn)生Fab片段)或胃蛋白酶(產(chǎn)生F(ab')2片段)通過(guò)蛋白酶水解切割產(chǎn)生。用于本發(fā)明的多克隆抗體和單克隆抗體可用常規(guī)方法制得。通常，首先用蛋白來(lái)免疫合適的動(dòng)物，較佳的是小鼠、大鼠、家兔或山羊。由于可獲得的血清體積多，能獲得標(biāo)記的抗家兔和抗山羊抗體，因此對(duì)于制備多克隆抗血清來(lái)說(shuō)，家兔和山羊是較佳的。免疫通常這樣進(jìn)行將蛋白以鹽水(較佳的以佐劑如弗氏完全佐劑)混合或乳化，然后腸胃外(通常是皮下或肌內(nèi))注射該混合物或乳劑。2-6周后用鹽水(較佳的是用弗氏不完全佐劑)配的蛋白質(zhì)注射一次或多次以強(qiáng)化免疫。將免疫后的動(dòng)物血液抽取到玻璃或塑料容器中，25°C培育該血液1小時(shí)，然后4°C培育2-18小時(shí)，獲得多克隆抗血清。單克隆抗體可用Kohler和Milstein的標(biāo)準(zhǔn)方法[Nature(197256:495-96]或其改進(jìn)方法制得。通常，如上所述對(duì)小鼠或大鼠免疫。然而，并非是對(duì)動(dòng)物取血然后抽提血清，而是取出脾臟(以及任選地取出幾個(gè)大的淋巴結(jié))，將其分散成單細(xì)胞。如果需要，可將細(xì)胞懸液(在除去非特異性粘附的細(xì)胞后)加入包被了蛋白質(zhì)抗原的板或孔中，對(duì)脾細(xì)胞進(jìn)行篩選。表達(dá)抗原特異性的膜結(jié)合免疫球蛋白的B細(xì)胞結(jié)合到板上，不象懸液其它物質(zhì)那樣被洗去。然后對(duì)所得B細(xì)胞或所有解離的脾細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，使其與骨髓瘤細(xì)胞融合形成雜交瘤，培養(yǎng)在選擇性培養(yǎng)基(如次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸苷培養(yǎng)基，“HAT”)中。通過(guò)有限稀釋接種所得雜交瘤，并測(cè)定特異性結(jié)合免疫抗原(且不結(jié)合無(wú)關(guān)抗原)的抗體的產(chǎn)生。然后，體外(例如在組織培養(yǎng)瓶或中空纖維反應(yīng)器中)或體內(nèi)(如小鼠腹水中)培養(yǎng)所選的分泌單克隆抗體的雜交瘤。本發(fā)明所述的與人富亮氨酸α2糖蛋白、人C4結(jié)合蛋白或人血清淀粉樣蛋白特異性結(jié)合的物質(zhì)(如其抗體)中任一種均能用于本發(fā)明，然而優(yōu)選的是所述物質(zhì)中的兩者或更多者的組合。一個(gè)具體的優(yōu)選實(shí)施方案是將與人富亮氨酸α2糖蛋白、人C4結(jié)合蛋白或人血清淀粉樣蛋白特異性結(jié)合的物質(zhì)(例如它們的單克隆抗體)同時(shí)用于檢測(cè)對(duì)象是否患有非小細(xì)胞肺癌或?qū)加蟹切〖?xì)胞肺癌患者進(jìn)行預(yù)后的制劑中的應(yīng)用。和前文描述相類(lèi)似的，在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，對(duì)患有非小細(xì)胞肺癌患者進(jìn)行預(yù)后的步驟包括利用所述抗體來(lái)測(cè)定患者血清中人富亮氨酸α2糖蛋白、人C4結(jié)合蛋白或人血清淀粉樣蛋白的水平；將所測(cè)得的水平與根據(jù)未復(fù)發(fā)病人的水平確定的臨界值比較，如果所測(cè)得的水平高于臨界值，則表示該非小細(xì)胞肺癌患者的預(yù)后差。所述臨界值可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)常規(guī)手段來(lái)確定。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)測(cè)得的未復(fù)發(fā)病人(組)的血清蛋白質(zhì)含量數(shù)據(jù)來(lái)繪制受試者工作特征曲線(xiàn)(R0C曲線(xiàn))，隨后確定臨界值(cut-off)。用抗體測(cè)定血清中抗原可用免疫熒光技術(shù)，利用熒光標(biāo)記的抗體并結(jié)合光學(xué)顯微術(shù)、流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)或熒光計(jì)量術(shù)檢測(cè)而實(shí)現(xiàn)。試驗(yàn)方法例如包括使生物樣品(如生物液體如血清)在能夠鑒別可檢測(cè)標(biāo)記抗體存在下進(jìn)行培育，然后用本領(lǐng)域熟知的眾多方法中的任一種方法檢測(cè)抗體。生物樣品可以用固相支持物或載體(如硝酸纖維素)、或能固定細(xì)胞、細(xì)胞顆?；蚩扇艿鞍椎钠渌滔嘀С治锘蜉d體來(lái)處理。然后用合適的緩沖液洗滌支持物或載體，再根據(jù)本發(fā)明上述那樣用可檢測(cè)的標(biāo)記的抗體處理。再用緩沖液第二次洗滌固相支持物或載體，除去未結(jié)合的抗體。然后可用常規(guī)方法檢測(cè)所述固相支持物或載體上所結(jié)合的標(biāo)記的量。熟知的支持物或載體包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龍淀粉酶、天然的和改性的纖維素、聚丙烯酰胺、輝長(zhǎng)巖和磁鐵石。支持物或載體的結(jié)構(gòu)可以是球形(如在玻珠內(nèi))、圓柱形(如試管的內(nèi)表面或棒的外表面)。另外，表面可以是平坦的，例如板、測(cè)試條帶等。較佳的支持物或載體包括聚苯乙烯珠。本領(lǐng)域技術(shù)人員可知道用于結(jié)合抗體或抗原的其他許多合適的載體，或者能夠通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定這些載體。在本發(fā)明中，可將抗體與酶相連，然后用于酶免疫分析(EIA)。然后，當(dāng)該酶與合適的底物接觸時(shí)，酶會(huì)與底物反應(yīng)，從而產(chǎn)生可被檢測(cè)(例如通過(guò)分光光度分析、熒光分析、或肉眼觀察)的化學(xué)物?？捎糜诳蓹z測(cè)地標(biāo)記抗體的酶包括(但不局限于)蘋(píng)果酸脫氫酶、葡萄球菌核酸酶、S-5-類(lèi)固醇異構(gòu)酶、酵母乙醇脫氫酶、α-甘油磷酸脫氫酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、過(guò)氧化氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡糖淀粉酶和乙酰膽堿酯酶。采用酶的生色團(tuán)底物，利用比色方法就可以完成檢測(cè)。檢測(cè)還可以通過(guò)將酶與底物反應(yīng)的程度與類(lèi)似制備的標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行肉眼比較來(lái)實(shí)現(xiàn)。檢測(cè)可用其他各種免疫試驗(yàn)實(shí)現(xiàn)。例如，通過(guò)放射性標(biāo)記抗體，就可以通過(guò)采用放射免疫分析(RIA)來(lái)檢測(cè)。放射性同位素可用閃爍計(jì)數(shù)器等設(shè)備或通過(guò)放射性自顯影來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。還可以用熒光化合物來(lái)標(biāo)記本發(fā)明的抗體。當(dāng)熒光標(biāo)記的抗體被暴露于適當(dāng)波長(zhǎng)的光時(shí)，就能因熒光而檢測(cè)出它的存在。最常用的熒光標(biāo)記化合物有異硫氰酸熒光素、羅丹明、藻紅蛋白、藻青蛋白、別藻藍(lán)蛋白、鄰苯二醛和熒光胺。抗體還可用發(fā)出熒光的金屬(如ikE或其他鑭系金屬)進(jìn)行可檢測(cè)地標(biāo)記。這些金屬可通過(guò)這些金屬的螯合基團(tuán)(如二乙三胺五乙酸(ETPA))與抗體連接。還可以將抗體偶聯(lián)化學(xué)發(fā)光化合物，對(duì)抗體進(jìn)行可檢測(cè)標(biāo)記。然后，檢測(cè)在化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中發(fā)光的存在來(lái)檢測(cè)帶有化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的抗體的存在。特別有用的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記化合物的例子是魯米諾、異魯米諾、熱吖啶鐺酯、咪唑、吖啶鐺鹽和草酸酯。同樣，還可以用生物發(fā)光化合物來(lái)標(biāo)記本發(fā)明抗體。生物發(fā)光是在生物系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的一種化學(xué)發(fā)光，其中催化性蛋白提高了化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的效率。生物發(fā)光蛋白的存在可通過(guò)檢測(cè)發(fā)光來(lái)確定。用于標(biāo)記目的的重要的生物發(fā)光化合物是螢光素、螢光素酶和水母發(fā)光蛋白。本發(fā)明的抗體也可用于免疫測(cè)定試驗(yàn)，如夾心試驗(yàn)。在典型的免疫測(cè)定試驗(yàn)中，將一定量的未標(biāo)記抗體(或抗體片段)結(jié)合于固相支持物或載體上，加入一定量的帶可檢測(cè)標(biāo)記的可溶抗體，從而可以檢測(cè)和/或定量分析在固相抗體、抗原和標(biāo)記抗體之間形成的三元復(fù)合物。典型的且較佳的免疫測(cè)量試驗(yàn)包括“正向”試驗(yàn)，在該試驗(yàn)中與固相結(jié)合的抗體先與待測(cè)試樣品接觸，通過(guò)形成二元固相抗體-抗原復(fù)合物從而將抗原從樣品中抽提出。在培育合適的時(shí)間后，洗滌固相支持物或載體以去除液體樣品殘余物(包括未反應(yīng)的抗原，如果有的話(huà))，然后再與含有未知量的標(biāo)記抗體的溶液接觸。在第二次培育使標(biāo)記抗體通過(guò)未標(biāo)記抗體與結(jié)合于固相支持物或載體上的抗原復(fù)合之后，第二次洗滌固相支持物或載體，除去未反應(yīng)的標(biāo)記抗體。本發(fā)明第三方面提供了一種用于檢測(cè)對(duì)象是否患有非小細(xì)胞肺癌或?qū)加蟹切〖?xì)胞肺癌患者進(jìn)行預(yù)后的試劑盒，所述試劑盒包含SEQIDNO:1所示的氨基酸序列、SEQIDNO:2所示的氨基酸序列、SEQIDNO:3所示的氨基酸序列或其組合。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述氨基酸序列還可攜帶標(biāo)記。所述標(biāo)記優(yōu)選同位素標(biāo)記。所述試劑盒還可包含說(shuō)明書(shū)，該說(shuō)明書(shū)提供了指導(dǎo)使用者如上所述應(yīng)用上述多肽序列來(lái)檢測(cè)對(duì)象是否患有非小細(xì)胞肺癌或?qū)加蟹切〖?xì)胞肺癌患者進(jìn)行預(yù)后的說(shuō)明。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(NewYork=ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠(chǎng)商所建議的條件。本申請(qǐng)的發(fā)明人采用溶液內(nèi)酶解的方法制備了肺癌患者(包括鱗癌和腺癌)的血液樣品和正常對(duì)照的血液樣品，接著采用在線(xiàn)一體柱色譜分離技術(shù)和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)肽段樣品進(jìn)行分析，質(zhì)譜數(shù)據(jù)用SEQUEST軟件搜索人hternationalProteinIndex(IPI)數(shù)據(jù)庫(kù)(版本號(hào)3.22)，然后用本實(shí)驗(yàn)室的Buildsummary軟件搜索正反庫(kù)評(píng)估和控制數(shù)據(jù)質(zhì)量。利用基于肽段Hits數(shù)的半定量方法，找到了三個(gè)在肺癌患者血液和正常對(duì)照血液間差異表達(dá)的蛋白質(zhì)——人富亮氨酸α2糖蛋白、人C4結(jié)合蛋白和人血清淀粉樣蛋白。MRM技術(shù)結(jié)合絕對(duì)定量法檢測(cè)肺癌患者血液和正常對(duì)照血液中這三種蛋白質(zhì)的濃度，結(jié)果表明這三種蛋白質(zhì)的濃度在肺癌患者血液與正常對(duì)照血液間存在顯著差異(在肺癌患者的血液中上調(diào))。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，這三種蛋白質(zhì)的水平可以用作非小細(xì)胞肺癌患者的預(yù)后指標(biāo)。實(shí)施例1、非小細(xì)胞肺癌患者血液樣品和正常對(duì)照血液樣品的處理以及肽段制備本實(shí)施例中所使用的尿素、3_[(3-膽酰胺丙基)_二乙銨]-1_丙磺酸(CHAPS)、十二烷基磺酸鈉(SDQ、二硫蘇糖醇(DTT)和4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPEQ均購(gòu)自Bio-Rad公司。收集新近診斷為腺癌(lungadenocarcinoma,AD)或鱗癌(squamouscellcarcinoma,SCC)的患者的血液(未接受治療前收集)，以及正常對(duì)照的血液。樣本具體信息分別見(jiàn)表1、表2和表3。其中表1的20對(duì)樣本根據(jù)性別、年齡、吸煙情況和!分期等因素兩兩配對(duì)，這些樣本的MRM數(shù)據(jù)用于肺鱗癌的預(yù)后分析。表2為另外30例非小細(xì)胞肺癌樣本的信息，其中包括15例腺癌和15例肺鱗癌。表3為25例正常對(duì)照樣本的信息。血液樣品放置室溫30分鐘，4°C，3000g離心20分鐘。收集上清，每管ImL分裝，-80°C保存，臨用前取出，避免反復(fù)凍融。乙醇沉淀法除去脂類(lèi)和白蛋白。具體如下50μL血清，加入250μL緩沖液(IOmMNaCl,IOOmMHEPES,ρΗ7.4)。0.22μm濾管(Millipore公司)，4°C，IOOOOg離心30分鐘以除去脂類(lèi)物質(zhì)。260yL去脂血清，加入ISOyL預(yù)冷的乙醇，4°C旋轉(zhuǎn)混合1小時(shí)。4°C，16000g離心45分鐘。收集沉淀，凍干，100μL裂解緩沖液復(fù)溶(8Μ尿素，4%CHAPS，40mMTris,65mMDTT，加入1XCocktail蛋白酶抑制劑(羅氏公司))。溶液內(nèi)酶解法制備肽段樣品。具體如下取蛋白質(zhì)樣品，加入IOmMDTT，37°C放置2.5小時(shí)。加入50mMIAA，室溫避光反應(yīng)45分鐘。加入5倍體積的蛋白沉淀液(丙酮乙醇=11，ν/ν，0.三氟乙酸)，-20°C放置12小時(shí)。蛋白沉淀用50mM碳酸氫銨溶液(pH8.3)復(fù)溶，按251加入測(cè)序級(jí)胰酶(Promega公司)，37°C酶解20小時(shí)。表1、20對(duì)肺鱗癌樣品信息權(quán)利要求1.人富亮氨酸α2糖蛋白或其片段、人C4結(jié)合蛋白或其片段、人血清淀粉樣蛋白或其片段、或其組合在制備用于檢測(cè)對(duì)象是否患有非小細(xì)胞肺癌或?qū)加蟹切〖?xì)胞肺癌患者進(jìn)行預(yù)后的制劑中的應(yīng)用。2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述人富亮氨酸α2糖蛋白片段為SEQIDNO:1所示的氨基酸序列；所述人C4結(jié)合蛋白片段為SEQIDNO:2所示的氨基酸序列；所述人血清淀粉樣蛋白片段為SEQIDNO:3所示的氨基酸序列。3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，將SEQIDNO:1所示的氨基酸序列、SEQIDNO:2所示的氨基酸序列、SEQIDNO:3所示的氨基酸序列聯(lián)合用于制備用于對(duì)患有非小細(xì)胞肺癌患者進(jìn)行預(yù)后的制劑。4.如權(quán)利要求2或3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述片段經(jīng)過(guò)重同位素標(biāo)記。5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，對(duì)患有非小細(xì)胞肺癌患者進(jìn)行預(yù)后的步驟包括將一定量的所述經(jīng)過(guò)重同位素標(biāo)記的片段加入經(jīng)胰蛋白酶消化的患者血清樣品中，用多重反應(yīng)監(jiān)控技術(shù)檢測(cè)患者血清中所述片段的水平，從而確定患者血清中人富亮氨酸α2糖蛋白、人C4結(jié)合蛋白或人血清淀粉樣蛋白的水平；將所測(cè)得的水平與根據(jù)未復(fù)發(fā)病人的水平確定的臨界值比較，如果所測(cè)得的水平高于臨界值，則表示該非小細(xì)胞肺癌患者的預(yù)后差。6.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌的步驟包括將一定量的所述經(jīng)過(guò)重同位素標(biāo)記的片段加入經(jīng)胰蛋白酶消化的患者血清樣品中，用多重反應(yīng)監(jiān)控技術(shù)檢測(cè)患者血清中所述片段的水平，從而確定患者血清中人富亮氨酸α2糖蛋白、人C4結(jié)合蛋白或人血清淀粉樣蛋白的水平；將所測(cè)得的水平與正常對(duì)照血清的水平比較，如果所測(cè)得的水平高于正常對(duì)照血清的水平，則表示該對(duì)象患有非小細(xì)胞肺癌。7.與人富亮氨酸α2糖蛋白、人C4結(jié)合蛋白或人血清淀粉樣蛋白特異性結(jié)合的物質(zhì)或其組合在制備用于檢測(cè)對(duì)象是否患有非小細(xì)胞肺癌或?qū)加蟹切〖?xì)胞肺癌患者進(jìn)行預(yù)后的制劑中的應(yīng)用。8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述與人富亮氨酸α2糖蛋白、人C4結(jié)合蛋白或人血清淀粉樣蛋白特異性結(jié)合的物質(zhì)是抗體。9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，對(duì)患有非小細(xì)胞肺癌患者進(jìn)行預(yù)后的步驟包括利用所述抗體來(lái)測(cè)定患者血清中人富亮氨酸α2糖蛋白、人C4結(jié)合蛋白或人血清淀粉樣蛋白的水平；將所測(cè)得的水平與根據(jù)未復(fù)發(fā)病人的水平確定的臨界值比較，如果所測(cè)得的水平高于臨界值，則表示該非小細(xì)胞肺癌患者的預(yù)后差。10.一種用于檢測(cè)對(duì)象是否患有非小細(xì)胞肺癌或?qū)加蟹切〖?xì)胞肺癌患者進(jìn)行預(yù)后的試劑盒，所述試劑盒包含SEQIDNO:1所示的氨基酸序列、SEQIDNO:2所示的氨基酸序列、SEQIDNO:3所示的氨基酸序列或其組合。全文摘要本發(fā)明涉及非小細(xì)胞肺癌分子標(biāo)志物及其應(yīng)用，具體涉及人富亮氨酸α2糖蛋白或其片段、人C4結(jié)合蛋白或其片段、人血清淀粉樣蛋白或其片段、或其組合在制備用于檢測(cè)對(duì)象是否患有非小細(xì)胞肺癌或?qū)加蟹切〖?xì)胞肺癌患者進(jìn)行預(yù)后的制劑中的應(yīng)用。文檔編號(hào)G01N33/68GK102243240SQ201010171879公開(kāi)日2011年11月16日申請(qǐng)日期2010年5月11日優(yōu)先權(quán)日2010年5月11日發(fā)明者劉延盛,徐孟杰,曾嶸,羅曉陽(yáng),陳海泉申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院,復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院