專利名稱：一種基于納米金增強的多種肺癌標志物的高靈敏檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種基于納米金增強的多種肺癌標志物的高靈敏檢測方法，特別是一種基于微陣列、納米生物復合探針及納米金增強的高靈敏檢測方法，該方法能同時檢測多種肺癌相關標志物，可用于肺癌的早期檢測、復發(fā)及轉移監(jiān)測。屬于納米生物檢測技術領域。
背景技術：
能夠對生物分子簡便、快捷、高靈敏度地檢測，始終是人們努力的方向，在疾病的早期診斷、快速診斷、衛(wèi)生檢測、環(huán)境監(jiān)測等領域都具有重要意義。肺癌是全球發(fā)病率最高、 死亡總人數最多的惡性腫瘤，肺癌也是預后最差、容易轉移的惡性腫瘤之一，肺癌起病隱匿，早期無臨床癥狀?，F有影像學檢測和痰細胞學檢查等檢測手段，即使最先進的檢測技術如多層螺旋CT和正電子發(fā)射體層攝影等可以發(fā)現直徑約2-6mm的腫瘤，但檢查過程復雜， 花費很高，且此時腫瘤已經進入血管生成期，因此，現有的檢測技術顯然仍無法用于肺癌早期及轉移檢測。隨著分子生物學和醫(yī)學研究的深入，出現了許多肺癌標志物，主要有癌胚抗原、細胞角蛋白、P53蛋白、黏蛋白等?？傮w來說，肺癌標志物含量低，單一標志物很難同時滿足敏感性和特異性的要求。隨著納米技術的飛速發(fā)展，已可以同時實現多種肺癌標志物的高靈敏檢測，這導致早期肺癌及轉移肺癌的敏感和特異檢測成為可能。微陣列是利用微電子芯片技術的集約化和平行處理原理，將大量具有生物學意義的生物樣品有序地固化在硅襯底或玻璃上，利用微陣列可以快速地獲取或處理大量的生命信息。微陣列的信號標記通常采用熒光標記檢測法，而熒光試劑價格昂貴、以及生物分子自身熒光干擾、熒光衰減以及讀取所用儀器價格昂貴等缺點，也大大限制了其在醫(yī)學臨床診斷方面的應用。隨著納米科學技術的不斷發(fā)展，納米材料和納米結構取得了引人矚目的成就。納米材料具有傳統材料所不具備的特有的三大效應表面效應、小尺寸效應和宏觀量子隧道效應。作為標記材料納米材料和納米結構已廣泛應用于免疫檢測中。如納米金顆粒對生物分子有很強的吸附功能，可以與蛋白質、核酸等非共價結合，因而在生物醫(yī)學基礎研究和臨床實驗中成為非常有用的工具。納米金顆粒具有高電子密度的特性，在納米金顆粒結合處，在顯微鏡下可見褐色顆粒，當這些標記物在相應的配體處大量聚集時，肉眼可見紅色或粉紅色斑點，因而廣泛應用于定性或半定量的快速檢測方法中，但是這類檢測技術的最大缺點是靈敏度低，檢測蛋白的靈敏度僅為ng/ml，對微量生物分子檢測無能為力(免疫標記技術的進展及納米技術在其中的應用，賈春平等，生命科學，第20卷，第5期，第749-753 頁)。此外，這類檢測方法大部分適用于試紙條或膜為固相載體的檢測體系中，對于以玻璃等為固相載體的微陣列上的微米甚至納米級的檢測點來說，不經過進一步的信號放大，一般顯微鏡尤其肉眼根本是檢測不到的，需要進一步進行納米金信號的放大。本發(fā)明就是在基于以上的需求提出的
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種基于納米金生物復合探針、微陣列及納米金增強的高靈敏檢測方法，該方法能同時高靈敏檢測多種肺癌標志物。本發(fā)明主要內容包括首先將待測蛋白的捕捉抗體點樣到微陣列上，然后在納米金上標記待測蛋白的多克隆或單克隆檢測抗體，然后將標記好待測蛋白質單克隆或多克隆捕捉抗體的蛋白微陣列及納米金生物復合探針與待測蛋白質樣品混合，37°C孵育一段時間，洗去沒有反應的納米金探針，加入金增強反應液，肉眼或顯微鏡下觀察、或用CCD掃描拍照，根據灰度值測定相應的蛋白濃度。本發(fā)明的方法步驟(1)蛋白抗體微陣列制作用芯片點樣儀將各待檢測蛋白質的抗體及質控點(二抗)點在醛基修飾的玻璃基片上，具體點樣方法參見專利O00710170613. X)，室溫放置16小時以上，置4°C保存。(2)構建納米金生物復合探針在pH6 9情況下，納米金顆粒水溶液與待測蛋白質相對應的抗體結合，根據膠體金凝集實驗確定各抗體的用量，將各抗體與納米金溶液室溫條件下混勻一段時間，再加入一定濃度(0. -20%)(質量/百分數，下同)的聚乙二醇，4°C過夜，離心，洗去未標記上的抗體，用納米金重懸液(牛血清白蛋白BSA 0.25-10%、聚乙烯吡咯酮PVP 0. 1_1%、蔗糖 1.5-10%、聚乙二醇PEG0. 01-1%、吐溫Tween20 0.2-1%)重懸標記好的納米金生物復合探針，置4°C保存?zhèn)溆谩?3)免疫反應將標記好各待測蛋白抗體的芯片及納米金生物復合探針與待測蛋白質樣品混合， 37°C孵育一段時間，然后再洗去沒有反應的納米金探針。(4)顯色加入金增強反應液(次氯金酸HAuCl · 3H20 0. 1-lOOmM、鹽酸羥胺NH2OH · HCl 0. Ι-lOOmM、明膠Gelatinl-IO % )后，室溫輕搖3-5min,肉眼觀測或用CCD拍照。本發(fā)明提供的檢測方法的優(yōu)點及特點本發(fā)明提供的測試方法最大的特點及優(yōu)點是靈敏度高，檢測方便，耗時短，且能同時檢測多種肺癌標志物。(1)背景信號低，檢測靈敏度高本發(fā)明提供的測試方法主要是基于納米金生物復合探針及納米金增強技術的蛋白質檢測技術，只有當待測蛋白存在時，納米金探針才會結合在蛋白芯片上，也只在有納米金的地方，才會發(fā)生進一步的納米金信號增強，由于納米金增強液的作用，使檢測信號得到級聯放大；沒有納米金的地方則不會有信號，背景信號很低，提高了信噪比，達到對微量蛋白質的檢測，檢測蛋白質的靈敏度達到pg/mL級。(2)同時可以檢測多種蛋白質本發(fā)明利用蛋白芯片可在一次檢測反應提供多種信息的優(yōu)點，實現同時檢測多種蛋白標記物。(3)操作方便，耗時短本發(fā)明提供的測定方法從檢測標本開始，只需要1-1. 5h的時間，就可以得到檢測結果；另外，本技術操作步驟少，操作方便、簡單，適于臨床大批量標本的快速檢測。


圖1基于納米金增強反應的蛋白質測定流程示意圖其中A為納米金生物復合探針構建示意圖，B為蛋白微陣列制作流程示意圖，C為免疫反應及顯色示意圖。圖2基于納米金增強的CEA(上排)、P53(下排)的檢測結果，檢測CEA、p53蛋白的靈敏度為180pg/mL。圖3基于銀染的CEA(上排)、P53(下排)的檢測結果，檢測CEA、p53蛋白的靈敏度為 1. 5ng/mL。圖4肺癌病人正常人血清檢測結果(a)肺癌標志物標準品CEA、NSE、CK-19及P53蛋白、(b)肺癌病人、(C)正常人血清中檢測結果。在該肺癌病人血清中，CEA、CK_19、P53均為強陽性，而正常人血清中為陰性。圖5(a)正常人及肺癌轉移病人血清檢測結果肺癌標志物標準品CEA、CK-19及 MUCl蛋白、(b)肺癌轉移病人、(c)正常人血清中檢測結果。在肺癌轉移病人血清中，CEA,MUCl均為強陽性，而正常人為陰性。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明。實施例1 可用于標準品CEA、P53蛋白的高靈敏檢測方法1蛋白芯片的制作將癌胚抗原(CEA)、P53蛋白的單克隆抗體點樣到醛基修飾的玻璃基片上。室溫過夜，置4°C保存?zhèn)溆谩?納米金生物復合探針的制備在pH6 9情況下，根據膠體金凝集實驗確定CEA、P53蛋白的檢測抗體的用量，并將各濃度的抗體與納米金溶液室溫條件下混勻1-5小時，再加入0. 1-20% (質量) 的聚乙二醇，4°C過夜，離心，洗去未標記上的抗體，用納米金重懸液(牛血清白蛋白BSA 0. 25-10%、聚乙烯吡咯酮PVP 0. 1-1%、蔗糖1.5-10%、聚乙二醇PEG 0.01-1%、吐溫 Tween20 0. 2-1% )重懸標記好的納米金生物復合探針，置4°C保存?zhèn)溆谩?免疫反應將標記好CEA、P53抗體的蛋白芯片及納米金生物復合探針與CEA、P53蛋白樣品(樣品濃度均為 100、50、25、12· 5,6. 25,3. 1,1. 5,0. 75,0. 37,0. 18,0. 09、0ng/mL)混合， 37°C孵育30-60分鐘，然后再洗去沒有反應的納米金探針。4顯色反應加入金增強反應液(次氯金酸HAuCl · 3H20 0. 1-lOOmM、鹽酸羥胺NH2OH · HCl 0. Ι-lOOmM、明膠Gelatinl-IO % )后，室溫輕搖3-lOmin，肉眼觀測或用C⑶拍照，有褐色點出現的為陽性結果。另外作為對比實驗的顯色方法為檸檬酸鹽緩沖液作用下的銀染顯色方法，具體顯色過程參見專利O00710170613. X)。
5結果分析常規(guī)的銀染方法，檢測CEA、p53蛋白的靈敏度為1. 5ng/mL(圖3)，而采用本發(fā)明中的金增強液顯色方法，檢測CEA、P53蛋白的靈敏度為180pg/mL(圖2)，所以靈敏度得到提尚。實施例2 可用于肺癌早期檢測的測定方法癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen CEA)是一種酸性糖蛋白，血清CEA水平的動態(tài)變化不僅可用于惡性腫瘤的早期診斷，還能反映患者對治療的反應和預后，其測量值進行性升高者多預后不良。細胞角蛋白(Cytokeratin) 19在肺癌診斷中有很大價值，是非小細胞肺癌的重要標志物。血清CK19的水平隨腫瘤分期的增加逐漸升高，其還能預示肺癌預后，并有助于判定手術療效。細胞角蛋白19與CEA聯合應用，診斷非小細胞肺癌符合率已可達到78%。神經元特異性烯醇酶(Neuron-Specific Enolase NSE)是一種哺乳動物組織中普遍存在的糖酵解酶，是小細胞肺癌(SCLC)的重要標志物，有助于SCLC的診斷及其與非小細胞肺癌的鑒別診斷。NSE還是肺癌化療效果觀察和隨訪的有效指標，對化療產生反應后此酶水平會下降，病情完全緩解后其可達正常水平。因為P53基因是與人類腫瘤發(fā)生密切相關的最重要的抑癌基因，約有50%的腫瘤的發(fā)生與其有關，尤其是對肺癌來說，有高達70%的肺癌患者有p53基因突變的發(fā)生。P53基因突變往往導致異常p53蛋白的積累， 因此P53蛋白檢測可以預測p53基因的狀態(tài)及腫瘤發(fā)生及進展，是個很好的預測因子。對以上腫瘤標志物的聯合檢測可以用于肺癌的早期檢測及診斷。1蛋白芯片的制作將癌胚抗原(CEA)、細胞角蛋白(CK-19)、神經烯醇化酶(NSE)、P53蛋白的單克隆抗體、質控點(抗鼠IgG)點樣到醛基修飾的玻璃基片上。室溫過夜，置4°C保存?zhèn)溆谩?納米金生物復合探針的制備在pH6 9情況下，根據膠體金凝集實驗確定CEA、CK-19、NSE、P53各蛋白的檢測抗體的用量，并將各濃度的抗體與納米金溶液室溫條件下混勻1-5小時，再加入0. 1-10% (質量)的聚乙二醇，4°C過夜，離心，洗去未標記上的抗體，用納米金重懸液(牛血清白蛋白 BSA 0. 25-10%、聚乙烯吡咯酮 PVP0. 1-1%、蔗糖 1. 5-10%、聚乙二醇 PEG 0.01-1%、吐溫Tween200. 2-1% )重懸標記好的納米金生物復合探針，置4°C保存?zhèn)溆谩?免疫反應將標記好CEA、CK-19、NSE、P53抗體的蛋白芯片及納米金生物復合探針與CEA、 CK-19、NSE、P53蛋白樣品或病人血樣混合，37°C孵育一段時間，然后再洗去沒有反應的納米金探針。4 顯色加入金增強(次氯金酸HAuCl · 3H20 0. 5-lOOmM、鹽酸羥胺 NH2OH · HCll-IOOmM,明膠Gelatinl-10% )反應液后，室溫輕搖3-lOmin，肉眼觀測或用C⑶拍照，有褐色點出現的為陽性結果。5結果分析在該肺癌病人血清中，CEA、CK_19、P53均為強陽性，而正常人血清中為陰性，表明這個檢測方法可用于肺癌的檢測(圖4)。實施例3 可用于肺癌微轉移檢測的測定方法黏蛋白1 (Mucins MUC1)是一種大分子量的糖蛋白，在腫瘤組織中黏蛋白1多出現異常表達，并與腫瘤的浸潤、轉移及預后相關。MUCl與CEA、CK19聯合檢測可以用來預測肺癌的轉移及預后情況。1蛋白芯片的制作將癌胚抗原(CEA)、細胞角蛋白(CK-19)、黏蛋白(MUCl)、質控點(抗鼠IgG)點樣到醛基修飾的玻璃基片上。室溫過夜，置4°C保存?zhèn)溆谩?納米金生物復合探針的制備在pH6 9情況下，根據膠體金凝集實驗確定CEA、CK_19、MUC1各蛋白的檢測抗體的用量，并將各濃度的抗體與納米金溶液室溫條件下混勻1-5小時，再加入0. 1-10% (質量)的聚乙二醇，4°C過夜，離心，洗去未標記上的抗體，用納米金重懸液(牛血清白蛋白 BSA 0. 25-10%、聚乙烯吡咯酮 PVP0. 1_1%、蔗糖 1. 5-10 %、聚乙二醇 PEG 0. 01-1 %、吐溫 Tween20 0. 2-1% )重懸標記好的納米金生物復合探針，置4°C保存?zhèn)溆谩?免疫反應將標記好CEA、CK_19、MUC1抗體的蛋白芯片及納米金生物復合探針與CEA、CK_19、 MUCl蛋白樣品或病人血樣混合，37°C孵育一段時間，然后再洗去沒有反應的納米金探針。4 顯色加入金增強反應液(次氯金酸HAuCl · 3H20 0. 5_100mM、鹽酸羥胺NH2OH · HCl Ι-lOOmM、明膠Gelatinl-IO % )后，室溫輕搖3-lOmin，肉眼觀測或用C⑶拍照，有褐色點出現的為陽性結果。5結果分析在肺癌轉移病人血清中，CEA、MUC1均為強陽性，而正常人為陰性，表明這個檢測方法可用于肺癌的轉移檢測(圖5)。
權利要求
1.一種多種肺癌標志物的高靈敏度檢測方法，其特征在于基于納米金生物復合探針微陣列和納米金增強，進行檢測的步驟是首先將待測蛋白的捕捉抗體點樣到微陣列上，然后在納米金上標記上待測蛋白的多克隆或單克隆檢測抗體，然后將標記好待測蛋白質單克隆或多克隆捕捉抗體的蛋白微陣列及納米金生物復合探針與待測蛋白質樣品混合，37°c孵育一段時間，洗去沒有反應的納米金探針，加入金增強反應液，肉眼或顯微鏡下觀察、或用CCD 掃描拍照，根據灰度值測定相應的蛋白濃度。
2.按權利要求1所述的檢測方法，其特征在于具體步驟為(a)蛋白抗體微陣列制作用芯片點樣儀將各檢測蛋白的抗體及質控點點在醛基修飾的玻璃基片上，室溫放置16 小時以上，置4°C保存；(b)構建納米金生物復合探針在pH 6 9情況下，納米金顆粒水溶液可與待測蛋白質相對應的抗體結合，根據膠體金凝集實驗確定各抗體的用量，將各抗體與納米金溶液室溫條件下混勻一段時間，再加入質量百分濃度為0. 1% -20%的聚乙二醇，4°C過夜，離心，洗去未標記上的抗體，用納米金重懸液重懸標記好的納米金生物復合探針，置4°C保存?zhèn)溆茫?c)免疫反應將標記好各待測蛋白抗體的芯片及納米金生物復合探針與待測蛋白質樣品混合，37°C 孵育一段時間，然后再洗去沒有反應的納米金探針；顯色(d)加入金增強反應液后，室溫輕搖3-5min，肉眼觀測或用CXD拍照。
3.按權利要求2所述的檢測方法，其特征在于步驟(c)中所述重懸液組成為牛血清白蛋白 BSA 0. 25-10%、聚乙烯吡咯酮PVP 0. 1-1 %、蔗糖 1. 5-10%、聚乙二醇PEG 0.01-1%, 吐溫 Tween20 0. 2_1%。
4.按權利要求2所述的檢測方法，其特征在于步驟(d)中金增強反應液組成為次氯金酸 HAuCl · 3H20 0. 1-lOOmM、鹽酸羥胺 NH2OH · HC10. 1-lOOmM、明膠 Gelatinl-10 %，以上均為質量百分濃度。
5.按權利要求1-4中任一項所述的檢測方法，其特征在于所述的方法適用于肺癌早期檢測和肺癌微轉移檢測。
6.按權利要求5所述的檢測方法，其特征在于檢測蛋白質的靈敏度達pg/ml級。
全文摘要
本發(fā)明是一種基于納米金增強的多種肺癌標志物。高靈敏度檢測方法，檢測步驟為1)先將各待測蛋白質的捕捉抗體點樣到醛基修飾的基片上；2)然后在納米金上標記上待測蛋白的多克隆或單克隆檢測抗體；3)將標記好待測蛋白質捕捉抗體的蛋白芯片及納米金生物復合探針與待測蛋白質樣品混合，37℃孵育一段時間，洗去沒有反應的納米金探針；4)加入金增強反應液，肉眼或顯微鏡下觀察、或用CCD掃描拍照，根據灰度值測定相應的蛋白濃度。本發(fā)明提供的方法可廣泛應用于臨床診斷、腫瘤轉移監(jiān)測、抗原、抗體、核酸的檢測、衛(wèi)生檢疫、環(huán)境檢測等領域，檢測蛋白質的靈敏度達pg/ml級。
文檔編號G01N33/574GK102313814SQ201110211260
公開日2012年1月11日 申請日期2011年7月22日 優(yōu)先權日2011年7月22日
發(fā)明者景奉香, 賈春平, 趙建龍, 趙輝, 金慶輝 申請人:中國科學院上海微系統與信息技術研究所