專利名稱：一株絲孢酵母生產谷胱甘肽的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物化工領域，旨在提供一種絲孢酵母7Wc/Kwporo" womev^ee似e CGMCCNo. 3144在降解苯酚生產谷胱甘肽中的應用。
背景技術：
苯酚是有機合成的常用原料，酚類化合物廣泛存在于煉焦、制藥、造紙、染料、酚醛樹脂合成以及石油化工等行業(yè)廢水中，苯酚是含酚廢水的主要污染物，據國家環(huán)保局統(tǒng)計2003年我國酚類物質排放量約為3000噸。苯酚屬于原生質毒物，對生物具有毒害作用，對人類祌經系統(tǒng)的危害尤其嚴重(Paula M. et al" Isolation and characterization of phenol-degradingdenitrifying bacteria [J], Appl. Environ. Microbiol., 1998， 64(7): 2432-2438),水中酚類化合物含量達到O. 005 mg/L時就不能飲用，含酚量> 100mg/L的灌溉水將導致農作物減產和枯死(李淑彬等，蠟狀芽孢桿菌菌株Jp-A的分離鑒定及其降解苯酚特性[J],應用生態(tài)學報，2006， 15(2):920-924;)，因此苯酚被列為國家環(huán)保局1989年通過的"水中優(yōu)先控制污染物黑名單"。
苯酚污水的處理有物理、化學氧化及生物降解方法等(張錦等，含酚廢水的危害及處理方法的應用特點[J],環(huán)境工程,2001， 83(2): 36-37)，對于難于回收的含苯酚廢水，生物降解具有溫和、效率高、應用范圍廣、處理能力大、設備簡單、和不產生二次污染等特性。文獻報道已篩選到可降解苯酚的微生物多種，其中多數為不動桿菌Cto'""o&c加sp.)(陳明，張維，醋酸鈣不動桿菌PHEA—2對苯酚的降解特性研究[J]，中國環(huán)境科學,2001， 21(3): 226-229)、假單胞菌(i^ewcfowowos sp.) (Arinjay Kumar et al., Biodegradation kinetics of phenol and catecholusing尸^wifowo"fl;y MTCC1194[J]， Biochem. Eng. J., 2004， 22: 151-159)、紅球菌
(及to必o)"^sp.)(沈錫輝等，苯酚降解菌紅球菌PNAN5菌株的分離鑒定、降解特性及其開環(huán)雙加氧酶性質研究[J],環(huán)境科學學報，2004, 24: 482—486)、微球菌(Mz'ctococcm sp.)(潘利華等，苯酚降解菌的篩選及其降解特性的初步研究[J],微生物學通報,2003, 30(5): 78-81)、皮狀絲孢酉孝母(7Wc/z呼o/wj cwto"ewm)(Andras Gaal & Halina Y. Neujahr, Metabolism of phenoland resorcinol in 7WcAo印oraw cw/aweww[J〗，J. Bacteriol.， 1979， 137(1): 12-31)、假絲酵母
(Cawt/油sp.) (Jiang Yan et al.， The biodegradation of phenol at high initial concentration by theyeast Oot&^ fro; /ca/wj], Biochem. Eng. J.， 2005， 24: 243—247)以及絲狀真菌(Santos V. L. &Linardi V. R., Biodegradation of phenol by a filamentous fungi isolated from industrial effluents:identification and degradation potential[J]， Process Biochem., 2004， 39: 1001—1006)等，其中假絲酵母耐苯酚濃度可達2000mg/L，投加于活性污泥中可成為處理含酚廢水的優(yōu)勢菌群，苯酚降解率可達95%以上，未投加菌種的活性污泥其對照苯酚降解率低60%(朱永光等，活性污泥系統(tǒng)處理苯酚廢水的生物強化效果[J]，應用與環(huán)境生物學報，2006， 12(4): 559-561)，皮狀絲孢酵母(7h'c/z(wporaw cw/a"eww)的耐酚濃度亦可達2000mg/L(Andras Gaal & Halina Y. Neujahr,Metabolism of phenol and resorcinol in 7Wc/ o，/x w cw加e脂[J]， J. Bacteriol" 1979， 137(1):12-31)。
作為一種石油化工衍生產物和化工主要原料之一，苯酚以廢物形式存在于環(huán)境之中時具有毒性，而活性污泥法處理苯酚廢水后大量菌體代謝增殖會產生污泥的安置問題。因此，目前需要開發(fā)一種能夠更好地利用含酚廢水中的苯酚的利用價值的廢水處理方法以達到資源的節(jié)約與合理利用。
谷胱甘肽，即y-L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸(Y-L-glutamyl-L-cysteinyl-glycine，簡稱GSH)，自然界中主要存在于酵母、動物肝臟、肌肉和血液中，是一種重要的生理活性物質(A. Meister & M. E. Anderson, Glutathione, Annu. Rev. Biochem.， 1983,52:711-760)，在臨床
醫(yī)學、食品添加劑和運動營養(yǎng)學方面具有廣泛的用途(胡文鐸等編，國家基本藥物及新特藥臨床指南[M]，天津天津科技翻譯出版公司，1996， 537)。谷胱甘肽的生產方法主要有化學合成法、酶法合成和發(fā)酵法等。目前，從富含谷胱甘肽的酵母細胞中提取谷胱甘肽成為主流。
谷胱甘肽的提取分離和制備方法有諸多文獻(王淼等，陽離子交換法分離純化酵母細胞提取液中的谷胱甘肽[J]，食品科學,2007,28(4): 211-217;劉娟等，發(fā)酵法生產谷胱甘肽的研究進展[J]，微生物學通報,2006， 29(6): 72-75;蘇曉晉等，應用超濾技術去除富含谷胱甘肽的酵母提取液中蛋白質的研究[J]，食品工業(yè)科技，2006, 27 (2) : 136-139)。由于胞內產品濃度低，谷胱甘肽的生產需要培養(yǎng)大量菌體，目前谷胱甘肽的生產方法存在原料利用率低，成本高等問題。發(fā)酵法生產谷胱甘肽中，以誘變處理獲得高谷胱甘肽含量的酵母變異菌株來生產谷胱甘肽為常見。對谷胱甘肽發(fā)酵條件以及補料方式的優(yōu)化方面的研究在提高谷胱甘肽的產量已多有報道，李寅等研究了谷胱甘肽的發(fā)酵條件，利用搖瓶補糖策略使得谷胱甘肽產量達到119mg/L(李寅等，高密度培養(yǎng)工程菌生產谷胱甘肽[J]，中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，1999, 30(1):1-4) 。 Sakato等同時利用補糖和乙醇控制方法，使得谷胱甘肽總量和含量分別達2360mg/L和3.7% (K. Sakato & H. Tanaka， Advanced Control of Glutathione Fermentation Process[J]，B/Wec/j"o/別oewg， 1992， 40(8): 904-912.)。
如果作為生產的輔產物提取，在緩解原料利用率低導致高成本問題方面具有可選之處。有報道利用酵母細胞同時生產S-腺苷-L-蛋氨酸和谷胱甘肽的研究(Hui Liu et al.,Co-production of S-adenosyl-L-methionine and glutathione with the spent brew's yeast cells[J].iVocew說oc/zem/WoN 2004， 39(12), 1993-1997)，而作為有機毒性污染物的苯酚，如能利用苯酚降解菌降解苯酚的同時輔產谷胱甘肽，則可達一舉兩得目的既消除了苯酚污染，又可生產高附加值產物谷胱甘肽。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的是提供絲孢酵母7Hc/zaspww7 wo"&vWeerae CGMCC No. 3144在生產谷胱甘肽中的應用。
絲孢酵母7WcAtw; OTOrt woWev/cfemye CGMCC No. 3144,在苯酚選擇性固體培養(yǎng)基上生長有大量菌絲，菌落中間突起，邊緣有樹枝狀輻射菌絲，無皺褶，乳白色，于30。C左右生長。細胞橢球狀、棒狀，有出芽生殖，有棒狀節(jié)孢子。
本發(fā)明技術方案是絲孢酵母7Wc^o印orow mo"/evWeewe CGMCC No. 3144在生產谷胱甘
肽中的應用。
上述所說的應用具體是一種利用絲孢酵母7Wcfewpora" mo加evitfee"se CGMCC No. 3144生產谷胱甘肽的方法，是將絲孢酵母7h'c/ a ;wwj woM/evk/eerae CGMCC No. 3144進行常規(guī)培養(yǎng)基斜面種子培養(yǎng)以及二級種子培養(yǎng)后，轉接入增殖培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)增殖，然后收集酵母菌體進行谷胱甘肽提取，經過分離純化制得谷胱甘肽產品。
上述方法中所說的增殖培養(yǎng)基是含苯酚濃度不高于2500mg/L的廢水或者是人工配制的含苯酚濃度不高于2500mg/L的培養(yǎng)基。
其中所說的人工配制的含苯酚濃度不高于2500mg/L的培養(yǎng)基，可以是磷酸氫二鈉6g/L、磷酸二氫鉀3g/L、氯化鈉0.5g/L、氯化銨10g/L、硫酸鎂0.24g/L、無水氯化鈣0.011g/L,苯酚濃度不高于2500mg/L。
上述方法中所說的增殖培養(yǎng)基還可是含葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基。如磷酸氫二鈉6g/L、磷酸二氫鉀3g/L、氯化鈉0.5g/L、氯化銨10g/L、硫酸鎂0.24§凡、無水氯化鈣0.011g/L，葡萄糖濃度任意。上述方法中培養(yǎng)增殖是在溫度為室溫或28-3(TC，好氧通氣/攪拌下進行。 從酵母細胞中提取分離純化谷胱甘肽采用常規(guī)方法就可，作為一個具體的實例，是收 集的酵母水洗后，利用體積分數為40-50c/。酒精溶液進行谷胱甘肽有機溶劑滲透萃取2-3hrs， 或者使用80-9(TC熱水攪拌抽提15min,萃取液調pH 1.0-3.0，使用截留分子量10000的PES膜室 溫超濾(0.2-0.3MPa)去除蛋白后經過大孔強酸陽離子S-9樹脂交換柱交換分離后，使用 5。/。NaOH溶液洗脫，洗脫液真空濃縮，凍干得產品。
本發(fā)明中培養(yǎng)生產模式為批式、流加或者連續(xù)方式進行。
本發(fā)明優(yōu)選用含酚廢水作為增殖培養(yǎng)基，如將種子液接入含酚污水處理裝置或發(fā)酵罐， 在降解苯酚的同時生產谷胱甘肽，具有顯著的資源節(jié)約優(yōu)勢。
7Wc/w少ora" wo"fev/fifeerae CGMCC No. 3144菌株，耐酚濃度達2500mg/L，通過將含酚 廢水中的苯酚作為碳源，細胞進行增殖，胞內谷胱甘肽產量可高達1.1-1.2%，谷胱甘肽體積 產量會隨細胞增殖而增加。通過應用從細胞中提取谷胱甘肽以及分離技術，可以進行谷胱甘 肽的生產。本發(fā)明通過利用含酚廢水中的苯酚作為碳源生產谷胱甘肽，不僅能夠把含酚廢水 中的苯酚變廢為寶，而且大大降低了谷胱甘肽的生產成本。
通過下面的附圖和詳細描述，本發(fā)明這些方面的特征和優(yōu)點將更為清楚。


圖1是7Hc/za^ora/7 wo"fev^mse菌株的批式苯酚降解以及谷胱甘肽生產動力學。 圖2是7Hc/ a^ww7wo"fev/^e似e菌株利用葡萄糖批式生長以及谷胱甘肽生產動力學。 圖3是7Wc/w^ww7 woWev/cfemye菌株在流加模式下降解苯酚生產谷胱甘肽產量。 圖4是7h'c/2oy;7oro" wo"fev/^e"w菌株在不同濃度苯酚濃度下的苯酚降解以及谷胱甘肽產量。
本發(fā)明中，除非特別指明，術語"苯酚降解菌"是指可以苯酚為唯一碳源和能源進行生 長的微生物菌株，即菌株在增殖或代謝過程中可將苯酚降解為二氧化碳和水而去除。
本發(fā)明中，除非特別指明，術語"含酚廢水"或者"苯酚廢水"是指工業(yè)過程中產生的 以苯酚為主要有機污染物組成的污水。
本發(fā)明中，除非特別指明，術語"碳源"是指微生物可利用的含碳物質，微生物利用該 含碳物質合成自身細胞的含碳物質。術語"能源"是微生物細胞可氧化其產生電子，在電子傳遞過程中產生ATP供細胞利用的物質。
具體實施例方式
(1) 菌株
本實驗室從油田污泥中篩選得到的一株酵母屬苯酚降解菌，于2009年6月26日保藏于中 國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號CGMCCNo.3144,其耐 苯酚濃度達2500mg/L，對1200 mg/L的苯酚的降解率24hrs內達99X以上，該菌株降解苯酚后 的殘留濃度可低于0.5mg/L，達標排放。
(2) 培養(yǎng)基 用去離子水配制下列培養(yǎng)基。
斜面培養(yǎng)基胰蛋白胨20g/L、酵母膏10g/L、氯化鈉20g/L、瓊脂粉2.0% 種子培養(yǎng)基胰蛋白胨5g/L、酵母膏5g/L、氯化鈉10g/L、葡萄糖10g/L。 人工含酚培養(yǎng)基磷酸氫二鈉6g/L、磷酸二氫鉀3g/L、氯化鈉0.5g/L、氯化銨10g/L、硫 酸鎂0,24g/L、無水氯化鈣0.011g/L，苯酚濃度根據實驗調整。 葡萄糖培養(yǎng)基上述人工含酚培養(yǎng)基中苯酚更換為葡萄糖。
(3) 還原型谷胱甘肽測試(Hui Liu et al.， Co-production of S-adenosyl-L-methionine and glutathione with the spent brew's yeast cells[J]. iVocew 5/oc/w柳/rfry， 2004， 39(12)， 1993-1997)
使用ALLOXAN (四氧嘧啶)試劑法，還原型谷胱甘肽(GSH)在實驗條件下與ALLOXAN (四氧嘧啶)作用，反應生成的物質在305nm處紫外區(qū)有最高吸收峰，使用紫外分光光度計 進行測定。
(4) 苯酚濃度測試使用4-氨基安替比林直接光度法(國家環(huán)保局《水和廢水監(jiān)測分 析方法》編委會，《水和廢水監(jiān)測分析方法》[M].北京中國環(huán)境科學出版社，1997,408-410)。
(5) 生物量測試采用干重和OD6Q。進行，培養(yǎng)液5ml進行離心，下層菌體使用去離子 水洗滌三次后放置烘箱中80'C烘干至恒重測細胞干重；培養(yǎng)液5ml進行離心，上清液作為參 比，測試600nm處培養(yǎng)液的吸光值。
實施例l
菌體培養(yǎng)菌種接種種子培養(yǎng)基，置于3(TC， 180r/min的搖床中進行振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)24hrs 后取一定體積種子培養(yǎng)液，離心(4000rpm，下同)，菌體采用生理鹽水洗滌離心后轉移至苯酚濃度約1200mg/L的人工苯酚培養(yǎng)基中，接種量30%，混合均勻，置于3(TC， 180r/min 的搖床中或接種15L恒溫發(fā)酵罐，溫度28°C-30。C，攪拌轉速200-500rpm，通氣量0.5-1.5vvm， 培養(yǎng)24hrs。取培養(yǎng)液5ml進行離心，含酚培養(yǎng)基取上層清液檢測苯酚濃度；下層菌體使用 去離子水洗滌三次后，加入等體積45X乙醇3(TC下萃取3hrs，分析還原型谷胱甘肽的濃度。 苯酚的降解以及谷胱甘肽產量如圖l所示。隨著苯酚降解，細胞逐漸增殖，谷胱甘肽產量逐 漸增加。
谷胱甘肽分離純化細胞離心收集、水洗后，使用40y。酒精溶液萃取2hrs。然后離心 4000rpm，上清液調pH 1.0-3.0,使用截留分子量10000的PES膜超濾(0.2-0.3MPa)后，上大孔 強酸陽離子樹脂S-9離子交換柱，采用5。/。NaOH溶液洗脫，洗脫液真空濃縮后，冷凍干燥后得 白色粉末，制得GSH純度65-75。/。，得率60%以上。
實施例2菌體培養(yǎng)與實施例l基本相同，不同之處在于，接入與1000mg/L苯酚等摩爾濃 度的葡萄糖培養(yǎng)基，28'C下培養(yǎng)12hrs，菌體密度及谷胱甘肽產量如圖2所示。
分離純化步驟同實施例l，只是細胞提取改用50。/。酒精溶液萃取2hrs， GSH純度68-77。/。， 得率62°/。以上。
實施例3種子液接種量30%，培養(yǎng)基中苯酚初始濃度約1500mg/L， 30'C降解時間24hrs 后先補加一次1000mg/L苯酚，以后每天按照200mg/L補加苯酚，連續(xù)3次，谷胱甘肽產量與細 胞干重如圖3所示。隨著補加苯酚濃度，細胞可逐漸增殖，谷胱甘肽產量也隨之增加。
分離純化步驟同實施例l,只是細胞提取改用80-90。C熱水攪拌抽提15min， GSH純度 70-80%，得率65%以上。
實施例4種子液接種量30%，培養(yǎng)基中苯酚初始濃度約1200mg/L，溫度室溫(夏季)， 降解時間24hrs后開始啟動連續(xù)降解，流加苯酚濃度1000mg/L，停留時間24hrs，攪拌轉速 300rpm,通氣量1.0wm，流出液苯酚濃度低于0.5mg/L。
分離純化步驟同實施例3， GSH純度70-80。/。，得率65%以上。
實施例5菌體培養(yǎng)與實施例l基本相同，不同之處在于，菌體分別接入初始濃度500mg/L、1000mg/L、 1200mg/L、 1500mg/L、 2000mg/L、 2500 mg/L以及3260 mg/L的苯酚培養(yǎng)基中， 24hrs后剩余苯酚濃度、生物量及谷胱甘肽產量如圖4所示。
分離純化步驟同實施例3， GSH純度50-60。/。，得率50%以上。
苯酚作為含碳物質，具有為微生物提供碳源和能源使得微生物細胞增殖的能力，對苯酚 降解菌細胞內谷胱甘^C進行綜合利用具有減輕資源消耗和降低谷胱甘肽生產成本的優(yōu)勢，同 時使得廢水中苯酚的污染得以消除，具有一舉兩得的優(yōu)勢。利用苯酚降解菌進行苯酚降解的 同時產谷胱甘肽，屬于生物發(fā)酵工程和環(huán)境工程的交叉領域，具有節(jié)能減排優(yōu)點。在資源日 益短缺的今天，含酚廢水的處理應該從綜合利用方面加以考慮，對回收價值不高的含酚廢水 進行生物降解的同時，大量菌體代謝利用苯酚后會增殖，將產生污泥的安置問題，如可以對 菌體進行綜合利用，開發(fā)高附加值生物產品具有重要節(jié)能減排的優(yōu)勢。
權利要求
1、一種絲孢酵母Trichosporon montevideense CGMCC No.3144在生產谷胱甘肽中的應用。
2、 根據權利要求l所述應用，其特征是，具體過程為將絲孢酵母7Wc/zoy/ ora" woWmVfee/weCGMCCNo. 3144進行常規(guī)培養(yǎng)基斜面種子培養(yǎng)以及二級種子培養(yǎng)后，轉接入增殖培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)增殖，然后收集酵母菌體進行谷胱甘肽提取，經過分離純化制得谷胱甘肽產n叩o
3、 根據權利要求2所述應用，其特征是其中所說的增殖培養(yǎng)基是含苯酚濃度不高于2500mg/L的廢水或者是人工配制的含苯酚濃度不高于2500mg/L的培養(yǎng)基。
4、 據權利要求3所述的應用，其特征是，其中所說的人工配制的含苯酚濃度不高于2500mg/L的培養(yǎng)基，其中磷酸氫二鈉6g/L、磷酸二氫鉀3g/L、氯化鈉0.5g/L、氯化銨10g/L、硫酸鎂0,24g/L、無水氯化鈣0.011g/L，苯酚濃度不高于2500mg/L。
5、 根據權利要求2所述的應用，其特征是其中所說的增殖培養(yǎng)基是含葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基。
6、 根據權利要求5所述的應用，其特征是其中所說的葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中磷酸氫二鈉6g/L、磷酸二氫鉀3g/L、氯化鈉0.5g/L、氯化銨10g/L、硫酸鎂0.24g/L、無水氯化鈣0.011g/L，葡萄糖濃度任意。
7、 根據權利2要求所述的應用，其特征是，培養(yǎng)增殖溫度為室溫或者28'C-3(TC，好氧通氣/攪拌下進行。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種絲孢酵母在降解苯酚的同時生產谷胱甘肽的應用。本發(fā)明的目的是提供利用該苯酚降解菌同時進行苯酚降解和谷胱甘肽生產的方法。本發(fā)明采用的苯酚降解菌為絲孢酵母Trichosporon montevideense(保藏號CGMCC No.3144)。本發(fā)明提供的方法是利用絲孢酵母Trichosporon montevideense(保藏號CGMCC No.3144)進行生物降解苯酚同時獲得酵母細胞提取谷胱甘肽。過程包括常規(guī)培養(yǎng)基斜面種子培養(yǎng)以及至少二級種子培養(yǎng)，轉接污水處理裝置或發(fā)酵罐進行苯酚降解，然后收集酵母進行谷胱甘肽提取。本發(fā)明技術具有減少污染物排放、有效利用資源以及降低谷胱甘肽生產成本等優(yōu)勢。
文檔編號C12P21/02GK101633944SQ20091018421
公開日2010年1月27日 申請日期2009年8月14日 優(yōu)先權日2009年8月14日
發(fā)明者惠 劉 申請人:南京師范大學