用于柄銹菌亞門和黑粉菌亞門的基因操作和表達(dá)系統(tǒng)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及分離的啟動(dòng)子和合成顯性選擇構(gòu)建體和增強(qiáng)子用于基因靶向的應(yīng)用，用于在選自柄銹菌亞門和黑粉菌亞門的物種中有效生產(chǎn)遺傳修飾的細(xì)胞，所述物種特別是選自紅冬孢酵母屬、孢堆黑粉菌屬、擲孢酵母屬或黑粉菌屬的物種。
【專利說(shuō)明】用于柄銹菌亞門和黑粉菌亞門的基因操作和表達(dá)系統(tǒng)
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的奪叉引用
[0002] 本申請(qǐng)涉及于2011年6月10日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)序列號(hào)61/495, 619且 要求其優(yōu)先權(quán)。這個(gè)申請(qǐng)通過(guò)引用并入本文。
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【背景技術(shù)】
[0005] 本發(fā)明涉及植物分子生物學(xué)領(lǐng)域，更具體而言涉及在柄銹菌亞門 (Pucciniomycotina)和黑粉菌亞門（Ustilaginomycotina)的物種中的高效率基因操作和 強(qiáng)基因表達(dá)系統(tǒng)。
[0006] 本文用于闡明本發(fā)明背景的出版物及其他材料以及特別提供關(guān)于實(shí)踐的另外細(xì) 節(jié)的案例通過(guò)引用并入，并且為了方便起見(jiàn)通過(guò)作者和日期在下述正文中提及，并且在所 附參考書(shū)目中按作者字母順序列出。
[0007] 柄銹菌亞門是擔(dān)子菌門中的真菌亞門（Kirk等人，2008)。它擁有具有重 要工業(yè)應(yīng)用的許多物種。例如，紅冬孢酵母屬（Rhodosporidium)和鎖擲酵母屬 (Sporidiobolus)中的許多物種，例如圓紅冬抱酵母（Rhodosporidium toruloides) (也稱為瘦弱紅酵母（Rhodotorula gracilis)、Rhodosporidium glutinis)、粘紅酵母 (Rhodotorula glutinis)、Torula koishikawensis和Torula rubescens)和赫色擲抱酵母 (Sporobolomyces salmonicolor)，是能夠高密度發(fā)酵的富油單細(xì)胞酵母（Hu等人，2009; Meng等人，2009)。這些物種具有作為用于生產(chǎn)長(zhǎng)鏈烴的宿主的極大潛力，所述長(zhǎng)鏈烴例如 三?；视停═AG或脂肪）、脂肪酸酯（生化柴油）、脂肪醇、醇、內(nèi)酯、萜類和維生素（Wu等 人，2010a ;Wu等人，2010b ;Zhao等人，2010a ;Zhao等人，2010b)。盡管基于PEG介導(dǎo)的原 生質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法已在圓紅冬孢酵母中報(bào)道（Tully和Gilbert，1985)，但該方法是高度不 可靠的且需要營(yíng)養(yǎng)突變型用于轉(zhuǎn)化。由于質(zhì)粒PHG2的不穩(wěn)定性，轉(zhuǎn)化載體不能應(yīng)用于工業(yè) 菌株的基因操作，所述質(zhì)粒PHG2含有圓紅冬孢酵母的苯丙氨酸氨裂解酶（PAL)編碼基因 (PAL)和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)的LEU2基因作為選擇標(biāo)記，和DNA載體 整合的位點(diǎn)特異性模式。類似地，不存在可以在紅冬孢酵母屬中用于驅(qū)動(dòng)實(shí)用基因或選擇 標(biāo)記表達(dá)的功能啟動(dòng)子。類似情況在擲孢酵母屬（Sporobolomyces)中發(fā)現(xiàn)（Ianiri等人， 2011)。在另一個(gè)例子中，黑粉菌亞門中的物種特別是黑粉菌屬（Ustilago)和Pseudozyma 已知生產(chǎn)糖脂，所述糖脂可以充當(dāng)表面活性劑或殺真菌劑（Hewald等人，2005 ;Teichmann 等人，2010)。
[0008] 完整的基因操作和表達(dá)系統(tǒng)一般由下述組成：組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；可選擇標(biāo) 記；DNA載體；將DNA引入宿主細(xì)胞內(nèi)以整合到基因組內(nèi)或作為附加體復(fù)制的方法；和抑制 或阻斷目的基因表達(dá)的方法。
[0009] 根瘤土壤桿菌（Agrobacterium tumefaciens)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化（ATMT)是用于轉(zhuǎn)化許 多真菌物種的方便方法（De Groot等人，1998)。轉(zhuǎn)化效率可以通過(guò)下述得到改善：最佳化 用于土壤桿菌屬（Agrobacterium)的pH值、在共培養(yǎng)過(guò)程中受體細(xì)胞和供體細(xì)胞的比例和 絕對(duì)值（Ji等人，2010)和使用衍生自T-DNA的增強(qiáng)子DNA序列（YE和Gilbertson，2009)。 在植物物種的ATMT中，已報(bào)道了改善轉(zhuǎn)化的幾種技術(shù)，包括植物組織的超聲處理和真空滲 入（de Oliveira等人，2009);驅(qū)動(dòng)選擇標(biāo)記表達(dá)的更強(qiáng)啟動(dòng)子（Maehara等人，2010)和宿 主防御應(yīng)答的控制（Khanna等人，2007 ;Vega等人，2008)。這些修飾的效應(yīng)在真菌的ATMT 中仍未得到證實(shí)。
[0010] 眾所周知真菌細(xì)胞還可以通過(guò)下述進(jìn)行轉(zhuǎn)化：完整細(xì)胞或原生質(zhì)體的電穿孔（Wu 和Letchworth，2004);和原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)染（(Meyer，2008;Turgeon等人，2010)或簡(jiǎn)單化 學(xué)誘導(dǎo)以增加細(xì)胞壁滲透性（Gietz和Woods，2002 ;Hill等人，1991 ;Ito等人，1983)。隨 機(jī)插入誘變是用于快速鑒定未知基因的有力工具。盡管限制性酶介導(dǎo)的整合（REMI)可以 用于改善在PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方案中線性化DNA載體的整合（B0lker等人，1995 ;Maier和 Schafer，1999)，但這種方法受阻于基因組DNA的大缺失、多重插入和未加標(biāo)簽的誘變包括 染色體重排（:B6lker等人，1995 ;Meyer 等人，2003 ;Sweigard 等人，1998)。另一方面，ATMT 已公認(rèn)為這個(gè)方面的優(yōu)良工具（Choi等人，2007 ;Soltani等人，2008)。
[0011] 真菌轉(zhuǎn)化體的選擇已由表達(dá)修飾抗生素和除草劑的蛋白質(zhì)的人工構(gòu)建體證實(shí)。常 用基因包括賦予針對(duì)潮霉素 B的抗性的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（hpt)(Bundock等人，1995); 賦予針對(duì)諾爾絲菌素的抗性的諾爾絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶（nat) (Ji等人，2010 ;KrUgel等人， 1988)、賦予針對(duì)卡那霉素或G418或新霉素的抗性的氨基糖苷3'-磷酸轉(zhuǎn)移酶（aph)或新 霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（npt) (Goldstein和McCusker，1999 ;Scorer等人，1994)、賦予針對(duì)博來(lái)霉 素（Zeocin)的抗性的印度斯坦鏈異壁菌（Streptoalloteichus hindustanus)博來(lái)霉素基 因（ble) (Pfeifer等人，1997 ;Takeno等人，2005);賦予針對(duì)除草劑草甘膦的抗性的5-烯 醇丙酮酰-3-磷酸莽草酸合成酶（aroA)基因（Comai等人，1983);賦予針對(duì)除草劑雙丙氨 磷的抗性的草胺膦乙酰轉(zhuǎn)移酶（pat) (Goldstein和McCusker，1999);賦予針對(duì)除草劑磺酰 脲的抗性的乙酰乳酸合酶（acs)基因（Haughn等人，1988)。
[0012] 基因缺失和重排是現(xiàn)代遺傳學(xué)中至關(guān)重要的基因靶向技術(shù)。然而，由于低基因靶 向頻率，生成此類突變體通常是非常有挑戰(zhàn)性的。顯著改善基因靶向頻率的技術(shù)在許多生 物體中是高度尋求的。
[0013] 在高等真核DNA非同源末端連接（NHEJ)系統(tǒng)中，DNA依賴性蛋白激酶（DNA-PK) 全酶包含稱為Ku70和Ku80的約70和80kDa的多肽異二聚體，其與DNA鏈斷裂結(jié)合，從而 召募且激活稱為DNA-PKcs的470-kDa催化亞基（Smith和Jackson，1999)。雖然Rad51和 Rad52對(duì)于HR途徑中的DSB修復(fù)是必需的（van Attikum等人，2003)，但DNA-PKcs/Ku復(fù)合 體和XRCC4/連接酶IV在哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中的NHEJ途徑中是至關(guān)重要的（van Attikum等人， 2001)。然而，關(guān)于DNA-PKcs亞基的同系物在真菌中仍未鑒定。近年來(lái)，已存在關(guān)于通過(guò)缺 失其關(guān)鍵組分中的一個(gè)或多個(gè)破壞NHEJ途徑來(lái)成功改善基因缺失頻率的幾個(gè)報(bào)道（KUck 和Hoff，2010)。這種技術(shù)難以應(yīng)用。
[0014] 另一方面，已報(bào)道了抑制DNA-PK活性的大量化合物，包括渥曼青霉素 (wortmanin) (Boulton 等人，1996)、LY294002 (Rosenzweig 等人，1997)、香草醒（Durant 和 Karran，2003)、NU1025 (Boulton 等人，1999)、roi28763(Tentori 等人，2002)、 八614361(51?11行21^等人，2003)、顯7026[2-(嗎啉-4-基）-苯并[11]色-4-酮；2-(4-嗎 啉基）-4H-萘酚[1，2-b]吡喃-4-酮]和NU7441 [8-(4-二苯并噻吩）-2-(4-嗎啉 基）-4H-1-苯并吡喃-4-酮]。后面兩種被認(rèn)為在動(dòng)物中是更特異性和有力的DNA-PK抑制 劑（Veuger等人，2003;Willmore等人，2004)。在真菌中不存在DNA-PK的情況下，不了解 是否存在促進(jìn)基因靶向的化合物。
[0015] 目前，紅冬孢酵母屬、擲孢酵母屬、孢堆黑粉菌屬（Sporisorium)和黑粉菌屬中的 物種的遺傳轉(zhuǎn)化是完全不可用的或無(wú)效的，并且是可再生化學(xué)制品和生物燃料進(jìn)展的主要 障礙。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0016] 本發(fā)明涉及使轉(zhuǎn)化細(xì)胞能夠高度有效生產(chǎn)的合成構(gòu)建體和轉(zhuǎn)化方法，所述轉(zhuǎn)化細(xì) 胞選自柄銹菌亞門和黑粉菌亞門中的物種。特別相關(guān)的物種是紅冬孢酵母屬、孢堆黑粉菌 屬、擲孢酵母屬和黑粉菌屬中的那些，在其中存在具有用于將可再生資源生物轉(zhuǎn)化成高價(jià) 值產(chǎn)品的極大潛力的許多物種，所述高價(jià)值產(chǎn)品例如甘油三酯、生物柴油、脂肪醇、維生素、 內(nèi)酯、萜類和生物表面活性劑。
[0017] 在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了多核苷酸序列，其充當(dāng)例如用于潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶 (hpt)和諾爾絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（nat)的基因表達(dá)的強(qiáng)啟動(dòng)子，并且允許轉(zhuǎn)化細(xì)胞在 選自紅冬孢酵母屬、孢堆黑粉菌屬和黑粉菌屬的物種中的有效選擇。在一個(gè)實(shí)施方案中， 啟動(dòng)子包含SEQ ID N0:1中所示的核苷酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，啟動(dòng)子包含SEQ ID N0:2中所示的核苷酸序列。在另外的實(shí)施方案中，啟動(dòng)子包含SEQ ID N0:3中所示的核苷 酸序列。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，啟動(dòng)子包含SEQ ID N0:4中所示的核苷酸序列。在另一 個(gè)實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是棉蚜（Ashibia gossipii)的tef啟動(dòng)子，并且包含SEQ ID N0:5 中所示的核苷酸序列。在另外的實(shí)施方案中，啟動(dòng)子包含SEQ ID N0:51中所示的核苷酸序 列。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，啟動(dòng)子包含SEQ ID N0:55中所示的核苷酸序列。在另一個(gè)實(shí) 施方案中，啟動(dòng)子是粘紅酵母的硬脂酰-CoA δ 9-去飽和酶啟動(dòng)子，并且包含SEQ ID N0:56 中所示的核苷酸序列。這些啟動(dòng)子各自在紅冬孢酵母屬、孢堆黑粉菌屬、擲孢酵母屬、紅酵 母屬（Rhodotorula)、Pseudozyma和黑粉菌屬中執(zhí)行強(qiáng)烈基因表達(dá)中是有效的。使用本文 描述的用于鑒定此類啟動(dòng)子的技術(shù)，可以從曲霉菌屬（Aspergillus)、紅冬孢酵母屬、紅酵 母屬、擲孢酵母屬、孢堆黑粉菌屬、Pseudozyma和黑粉菌屬中的其他物種中鑒定另外的強(qiáng)啟 動(dòng)子。此外，使用常規(guī)啟動(dòng)子篩選測(cè)定法可以分離這些啟動(dòng)子的可操作片段，并且使用本文 描述的技術(shù)可以篩選經(jīng)轉(zhuǎn)化的真菌細(xì)胞的有效選擇。
[0018] 在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含衍生自選自下述的物種的分離啟動(dòng)子的合 成顯性選擇構(gòu)建體：曲霉菌屬、紅冬孢酵母屬、擲孢酵母屬、孢堆黑粉菌屬、紅酵母屬、 Pseudozyma和黑粉菌屬，關(guān)于其的啟動(dòng)子可操作地連接至合適標(biāo)記的編碼序列，所述合適 標(biāo)記的編碼序列可操作地連接至轉(zhuǎn)錄終止子。此類構(gòu)建體在促進(jìn)選自下述的物種中的轉(zhuǎn) 化細(xì)胞生產(chǎn)中是有效的：紅冬孢酵母屬、孢堆黑粉菌屬、擲孢酵母屬、紅酵母屬、Pseudozyma 或黑粉菌屬。在一個(gè)實(shí)施方案中，合適標(biāo)記是賦予抗生素抗性的蛋白質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，合適標(biāo)記是賦予除草劑抗性的蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，實(shí)現(xiàn)這種功能的標(biāo)記的編碼 序列是天然存在或人工制備且含有至少約60%GC的編碼序列。在第二個(gè)實(shí)施方案中，實(shí)現(xiàn) 這種功能的標(biāo)記的編碼序列是天然存在或人工制備且含有約63%GC的編碼序列。在第三個(gè) 實(shí)施方案中，實(shí)現(xiàn)這種功能的標(biāo)記的編碼序列是天然存在或人工制備且含有約70%GC的編 碼序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，此類編碼序列的至少約70%密碼子三聯(lián)體以C或G結(jié)束。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，此類編碼序列的超過(guò)約80%密碼子三聯(lián)體以C或G結(jié)束。在一個(gè)實(shí)施 方案中，此類編碼序列在至少約40%的總絲氨酸（Ser)殘基中包含UCG密碼子。在一個(gè)實(shí) 施方案中，關(guān)于藥物抗性的編碼序列包含SEQ ID NO:6中所不的核苷酸序列。在另一個(gè)實(shí) 施方案中，關(guān)于藥物抗性的編碼序列包含SEQ ID NO:7中所示的核苷酸序列。在另外的實(shí) 施方案中，關(guān)于藥物抗性的編碼序列包含SEQ ID NO:8中所不的核苷酸序列。在一個(gè)實(shí)施 方案中，可以使用在真菌物種中可操作的任何轉(zhuǎn)錄終止子。
[0019] 在第三個(gè)方面，本發(fā)明提供了基于對(duì)物種顯性選擇的轉(zhuǎn)化方法，所述物種選自 柄銹菌亞門和黑粉菌亞門，特別是紅冬孢酵母屬、孢堆黑粉菌屬、黑粉菌屬、紅酵母屬、 Pseudozyma或擲孢酵母屬（鎖擲酵母屬）中的物種。在一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)化方法是根瘤 土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化（ATMT)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)化方法是電穿孔。在另外的實(shí)施方 案中，轉(zhuǎn)化方法是轉(zhuǎn)染。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)化方法是生物射彈（biolistic)。
[0020] 根據(jù)ATMT實(shí)施方案，該方法包括下述步驟：（a)制備含有下述的合成DNA構(gòu)建 體：可操作地連接至（ii)關(guān)于可選擇標(biāo)記的編碼序列的（i)衍生自曲霉菌屬、紅冬孢酵母 屬、擲孢酵母屬、孢堆黑粉菌屬、紅酵母屬、Pseudozyma或黑粉菌屬的啟動(dòng)子,所述可選擇標(biāo) 記的編碼序列可操作地連接至（iii)可操作地連接的轉(zhuǎn)錄終止子；(b)將DNA構(gòu)建體插入 T-DNA二元載體內(nèi)；（c)將所得到的T-DNA載體引入土壤桿菌屬菌株內(nèi)；（d)優(yōu)選在土壤桿 菌屬毒力誘導(dǎo)物例如乙酰丁香酮（acetosynringone)(AS)的存在下，使土壤桿菌屬細(xì)胞與 真菌細(xì)胞一起在固體培養(yǎng)基上或放在固體培養(yǎng)基之上的膜上共培養(yǎng)，以轉(zhuǎn)化真菌細(xì)胞；（e) 在固體培養(yǎng)基上或放在固體培養(yǎng)基之上的膜上直接選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的菌落。選擇培養(yǎng)基可以進(jìn) 一步補(bǔ)充有以完全抑制土壤桿菌屬和未經(jīng)轉(zhuǎn)化的真菌細(xì)胞生長(zhǎng)的濃度的物質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施 方案中，啟動(dòng)子是本文描述的啟動(dòng)子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可選擇標(biāo)記的編碼序列是本文 描述的編碼序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，選擇培養(yǎng)基或共培養(yǎng)培養(yǎng)基含有至少約1.5%瓊脂。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，選擇培養(yǎng)基或共培養(yǎng)培養(yǎng)基含有約2%-約3%瓊脂。
[0021] 在第四個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于真菌中的基因靶向的改良方法。特別地，哺乳動(dòng) 物DNA依賴性蛋白激酶（DNA-PK)抑制劑可以大量補(bǔ)充至用于轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基。在一個(gè)實(shí)施方 案中，DNA-PK抑制劑是NU7026(2-(嗎啉-4-基）-苯并[h]色-4-酮；2-(4-嗎啉基）-4H-萘 酚[l，2-b]吡喃-4-酮）。在另一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)基中的NU7026量為約0. ΙμΜ-約 50 μ Μ。在另外的實(shí)施方案中，DNA-PK抑制劑可以與任何轉(zhuǎn)化方案一起使用，所述轉(zhuǎn)化方案 例如ATMT、電穿孔、轉(zhuǎn)染、生物射彈等。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0022] 圖1A-1D顯示轉(zhuǎn)化載體的圖示。圖1A :pEX2 ;Pgpd指玉米黑粉菌（Ustilago maydis)的gpd啟動(dòng)子。圖IB :pEC3。圖1C :pEC3PxxxhptR ;Pxxx指示位于P盒中的多種 啟動(dòng)子。圖ID :pEX3GPDA-EGFP。LB和RB分別為T-DNA的左邊界和右邊界。T35S :花椰菜 花葉35S基因終止子；Tnos :根瘤土壤桿菌胭脂堿合酶轉(zhuǎn)錄終止子；egfp :增強(qiáng)型綠色熒光 蛋白基因。
[0023] 圖2A-2D顯示可選擇標(biāo)記對(duì)圓紅冬孢酵母的ATMT的作用。對(duì)于玉米黑粉菌和圓 紅冬孢酵母，關(guān)于轉(zhuǎn)化體的選擇用100 μ g/ml潮霉素 B執(zhí)行。圖2A :與AGL1共培養(yǎng)的圓紅 冬孢酵母。圖2B :與AGL1 (pEX2)共培養(yǎng)的圓紅冬孢酵母。圖2C :推定轉(zhuǎn)化體的菌落PCR。 圖2D :使用nat作為選擇標(biāo)記的推定轉(zhuǎn)化體的菌落PCR。
[0024] 圖3A和3B顯示在潮霉素抗性菌落中的GFP表達(dá)。圖3A :針對(duì)100 μ g/ml潮霉素 B選擇8天的菌落；圖3B :針對(duì)200 μ g/ml潮霉素 B選擇8天的菌落。
[0025] 圖4 :顯示在多種共培養(yǎng)培養(yǎng)基pH下獲得的圓紅冬孢酵母轉(zhuǎn)化體的DNA印跡。WT ; 野生型圓紅冬孢酵母。印跡針對(duì)hpt-3進(jìn)行探測(cè)。
[0026] 圖5顯示甘鹿鞭黑粉菌（Sporisorium scitamineum)轉(zhuǎn)化體的DNA印跡分析?；?因組DNA用BamHI消化且用[32P]_標(biāo)記的hpt DNA片段探測(cè)。泳道1-18是來(lái)自推定轉(zhuǎn)化 體的DNA。泳道19是甘蔗鞭黑粉菌野生型DNA。分子標(biāo)記在左側(cè)上指示。
[0027] 圖6顯示具有不同啟動(dòng)子的粘紅酵母轉(zhuǎn)化體的DNA印跡。PgpdUm、PgpdA Kt、PgpdAAn 和PtefAg分別指來(lái)自玉米黑粉菌、圓紅冬孢酵母、構(gòu)巢曲霉和棉蚜的gpd啟動(dòng)子。印跡針對(duì) hpt-3進(jìn)行探測(cè)。
[0028] 圖7顯示DNA-PK抑制劑的結(jié)構(gòu)是NU7026 (2-(嗎啉-4-基）-苯并[h]色-4-酮； 2-(4-嗎啉基）-4H-萘酚[1，2-b]批喃-4-酮）。

【具體實(shí)施方式】
[0029] 除非另有定義，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技 術(shù)人員通常理解相同的含義。
[0030] 如本文使用的術(shù)語(yǔ)"有效選擇"意指使用任何真菌分離物在90mm培養(yǎng)皿中的至少 兩個(gè)真正轉(zhuǎn)化體的直接選擇。
[0031] 如本文使用的術(shù)語(yǔ)"強(qiáng)表達(dá)"意指標(biāo)記蛋白質(zhì)或mRNA表達(dá)至使用已知檢測(cè)方法可 檢測(cè)的水平，所述已知檢測(cè)方法例如GFP的熒光、GUS和lacZ基因的活性測(cè)定法。
[0032] 本發(fā)明涉及使轉(zhuǎn)化細(xì)胞能夠高度有效生產(chǎn)的合成構(gòu)建體和轉(zhuǎn)化方法，所述轉(zhuǎn)化細(xì) 胞選自柄銹菌亞門和黑粉菌亞門中的物種。特別相關(guān)的物種是紅冬孢酵母屬、擲孢酵母 屬、孢堆黑粉菌屬、紅酵母屬、Pseudozyma和黑粉菌屬中的那些，在其中存在具有用于將可 再生資源生物轉(zhuǎn)化成高價(jià)值產(chǎn)品的極大潛力的許多物種，所述高價(jià)值產(chǎn)品例如甘油三酯、 生物柴油、脂肪醇、內(nèi)酯、萜類和維生素和生物表面活性劑。此類菌株的例子包括但不限于 圓紅冬抱酵母、Rhodosporidium azoricum、Rhodosporidium babjevae、Rhodosporidium concentricum、雙倒卵形紅冬抱酵母（Rhodosporidium diobovatum)、Rhodosporidium fluvial> Rhodosporidium kratochvilovae、Rhodosporidium lusitaniae、海洋紅酵母 (Rhodosporidium paludigenum)、球紅冬抱酵母（Rhodosporidium sphaerocarpum)、圓 紅冬抱酵母、玫紅擲抱酵母（Sporobolomyces roseus)、Sporobolomyces carnicolor、 Sporobolomyces salmoneus、Sporisorium scitamineum、玉米黑粉菌、Pseudozyma Antarctica、Pseudozyma aphidis。
[0033] 在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含可操作地連接至關(guān)于可選擇標(biāo)記的編碼序列的啟 動(dòng)子的多核苷酸構(gòu)建體，所述關(guān)于可選擇標(biāo)記的編碼序列可操作地連接轉(zhuǎn)錄終止子。啟動(dòng) 子衍生自選自下述的真菌物種：黑粉菌屬的物種、曲霉菌屬的物種和紅冬孢酵母屬的物種， 并且提供編碼序列在柄銹菌亞門和黑粉菌亞門的經(jīng)轉(zhuǎn)化的真菌細(xì)胞中的強(qiáng)表達(dá)。多核苷酸 構(gòu)建體提供了柄銹菌亞門和黑粉菌亞門的經(jīng)轉(zhuǎn)化的真菌細(xì)胞的有效選擇。多核苷酸構(gòu)建體 特別用于有效選擇紅冬孢酵母屬、孢堆黑粉菌屬、黑粉菌屬、紅酵母屬、Pseudozyma和擲孢 酵母屬（鎖擲酵母屬）的經(jīng)轉(zhuǎn)化的真菌細(xì)胞。
[0034] 在一個(gè)實(shí)施方案中，啟動(dòng)子衍生自編碼甘油醛3-磷酸脫氫酶（gpd)的基因或編碼 蛋白質(zhì)翻譯延伸因子（tef)的基因。
[0035] 在一個(gè)實(shí)施方案中，啟動(dòng)子包含SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列。在另一個(gè)實(shí) 施方案中，啟動(dòng)子包含SEQ ID N0:2中所示的核苷酸序列。在另外的實(shí)施方案中，啟動(dòng)子包 含SEQ ID N0:3中所示的核苷酸序列。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，啟動(dòng)子包含SEQ ID N0:4中 所示的核苷酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是SEQ ID N0:5中所示的棉姆的tef啟 動(dòng)子。在另外的實(shí)施方案中，啟動(dòng)子包含SEQ ID N0:51中所示的核苷酸序列。在進(jìn)一步的 實(shí)施方案中，啟動(dòng)子包含SEQ ID N0:55中所示的核苷酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，啟動(dòng) 子是粘紅酵母的硬脂酰-CoA δ 9-去飽和酶啟動(dòng)子，并且包含SEQ ID N0:56中所示的核苷 酸序列。使用本文描述的用于鑒定此類啟動(dòng)子的技術(shù)，可以從曲霉菌屬、紅冬孢酵母屬、紅 酵母屬、擲孢酵母屬和黑粉菌屬中的其他物種中鑒定另外的強(qiáng)啟動(dòng)子。此外，使用常規(guī)啟動(dòng) 子篩選測(cè)定法可以分離這些啟動(dòng)子的可操作片段，并且使用本文描述的技術(shù)可以篩選經(jīng)轉(zhuǎn) 化的真菌細(xì)胞的有效選擇。
[0036] DNA操作領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的技術(shù)，核酸雜交可以用于鑒定其他合適的多核 苷酸。依照本發(fā)明，使用的其他合適啟動(dòng)子可以通過(guò)鑒定多核苷酸而獲得，所述多核苷酸通 過(guò)在低嚴(yán)格條件、中等嚴(yán)格條件或高嚴(yán)格條件下雜交與上文描述的啟動(dòng)子選擇性雜交。選 擇性雜交序列一般彼此具有至少50%序列相同性，優(yōu)選至少70%、80%或90%序列相同性，并 且最優(yōu)選95%、98%或99%序列相同性。
[0037] 使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的算法或計(jì)算機(jī)程序和這些技術(shù)，基因組和核苷酸 數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)庫(kù)搜索和同源性搜索基于核苷酸的比對(duì)鑒定相似的DNA或RNA分子。依照本 發(fā)明，使用的其他合適多核苷酸可以通過(guò)調(diào)節(jié)序列的多核苷酸的計(jì)算機(jī)芯片鑒定而獲得， 所述調(diào)節(jié)序列彼此具有至少50%序列相同性，優(yōu)選至少70%、80%或90%序列相同性，并且最 優(yōu)選95%、98%或99%序列相同性。
[0038] 在一個(gè)實(shí)施方案中，啟動(dòng)子包含（i)與SEQ ID N0:2的核苷酸序列具有至少50% 相同性的核苷酸序列，（ii)與SEQ ID N0:2的核苷酸序列具有至少60%相同性的核苷酸序 列，（iii)與SEQ ID N0:2的核苷酸序列具有至少70%相同性的核苷酸序列，（iv)與SEQ ID NO: 2的核苷酸序列具有至少80%相同性的核苷酸序列，（v)與SEQ ID NO: 2的核苷酸序列 具有至少90%相同性的核苷酸序列，（vi)與SEQ ID NO: 2的核苷酸序列具有至少95%相同 性的核苷酸序列，和（vii)與SEQ ID N0:2的核苷酸序列具有至少98%相同性的核苷酸序 列。
[0039] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，啟動(dòng)子包含（i)與SEQ ID N0:51的核苷酸序列具有至少 50%相同性的核苷酸序列，（ii)與SEQ ID N0:51的核苷酸序列具有至少60%相同性的核苷 酸序列，（iii)與SEQ ID N0:51的核苷酸序列具有至少70%相同性的核苷酸序列，（iv)與 SEQ ID N0:51的核苷酸序列具有至少80%相同性的核苷酸序列，（v)與SEQ ID N0:51的核 苷酸序列具有至少90%相同性的核苷酸序列，（vi)與SEQ ID NO: 51的核苷酸序列具有至 少95%相同性的核苷酸序列，和（vii)與SEQ ID N0:51的核苷酸序列具有至少98%相同性 的核苷酸序列。
[0040] 在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，啟動(dòng)子包含⑴與SEQ ID N0:55的核苷酸序列具有至少 50%相同性的核苷酸序列，（ii)與SEQ ID N0:55的核苷酸序列具有至少60%相同性的核苷 酸序列，（iii)與SEQ ID N0:55的核苷酸序列具有至少70%相同性的核苷酸序列，（iv)與 SEQ ID N0:55的核苷酸序列具有至少80%相同性的核苷酸序列，（v)與SEQ ID N0:55的核 苷酸序列具有至少90%相同性的核苷酸序列，（vi)與SEQ ID NO: 55的核苷酸序列具有至 少95%相同性的核苷酸序列，和（vii)與SEQ ID N0:55的核苷酸序列具有至少98%相同性 的核苷酸序列。
[0041] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，啟動(dòng)子包含（i)與SEQ ID N0:56的核苷酸序列具有至少 50%相同性的核苷酸序列，（ii)與SEQ ID N0:56的核苷酸序列具有至少60%相同性的核苷 酸序列，（iii)與SEQ ID N0:56的核苷酸序列具有至少70%相同性的核苷酸序列，（iv)與 SEQ ID N0:56的核苷酸序列具有至少80%相同性的核苷酸序列，（v)與SEQ ID N0:56的核 苷酸序列具有至少90%相同性的核苷酸序列，（vi)與SEQ ID NO: 56的核苷酸序列具有至 少95%相同性的核苷酸序列，和（vii)與SEQ ID N0:56的核苷酸序列具有至少98%相同性 的核苷酸序列。
[0042] 關(guān)于可選擇標(biāo)記的編碼序列編碼可選?？蛇x擇標(biāo)記編碼序列用于選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì) 胞或組織。通常，可選擇標(biāo)記編碼序列將編碼抗生素抗性，其中合適的編碼序列包括下述中 的至少一組：編碼針對(duì)抗生素壯觀霉素的抗性的編碼序列、針對(duì)zeomycin的抗性的編碼序 列、編碼鏈霉素抗性的鏈霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（spt)基因、編碼卡那霉素或遺傳霉素抗性的新 霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（nptll)基因、編碼針對(duì)潮霉素的抗性的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（hpt或aphiv) 基因、編碼針對(duì)諾爾絲菌素的抗性的乙酰乳酸合酶（als)基因或諾爾絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基 因?？商娲兀参锟蛇x擇標(biāo)記編碼序列將編碼除草劑抗性例如針對(duì)磺酰脲型除草劑、草 銨膦、草甘膦、銨、溴苯腈、咪唑啉酮和2, 4-二氯苯氧乙酸鹽（2, 4-D)的抗性，包括編碼針對(duì) 作用于抑制谷氨酰胺合酶作用的除草劑例如草胺膦或basta的抗性的基因（例如bar基 因）。一般參見(jiàn)國(guó)際
【發(fā)明者】L·H·紀(jì), Y·B·劉, C·M·J·許, L·H·孫 申請(qǐng)人:淡馬錫生命科學(xué)研究院有限公司