本發(fā)明涉及一種聯(lián)產(chǎn)琥珀酸和異戊二烯的基因工程菌及其構(gòu)建方法，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

異戊二烯是一種重要的化工平臺(tái)化合物，其95％用于合成橡膠；也是丁基橡膠的第二單體。此外，還可廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥、醫(yī)藥、香料及粘結(jié)劑等領(lǐng)域。目前，異戊二烯的來(lái)源主要是通過(guò)石油基原料異戊烷、異戊烯脫氫法、化學(xué)合成法(包括異丁烯-甲醛法、乙炔-丙酮法、丙烯二聚法)和裂解C5餾分萃取蒸餾法。然而，隨著化石資源的日益枯竭，原料來(lái)源是利用石油基原料制備異戊二烯的重要瓶頸問(wèn)題。以可再生的生物質(zhì)為原料，利用生物轉(zhuǎn)化技術(shù)合成異戊二烯，因具有可持續(xù)性、環(huán)境友好、品質(zhì)優(yōu)異等優(yōu)勢(shì)，已成為國(guó)際上的研究熱點(diǎn)。

目前，生物基異戊二烯的生物合成路線主要是以葡萄糖為原料，利用甲羥戊酸(MVA)或甲基赤蘚糖-5-磷酸(MEP)途徑合成異戊二烯(Jianming Yang,2012)。然而，不管是哪條合成路線，都會(huì)在合成異戊二烯的同時(shí)，產(chǎn)生二氧化碳，這樣會(huì)造成碳轉(zhuǎn)化率的損失，造成原料葡萄糖的浪費(fèi)，增加合成成本，限制了該技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用。此外，已有異戊二烯生物合成的報(bào)道多數(shù)是有氧發(fā)酵，由于異戊二烯與氧氣混合，能形成爆炸性混合物，使其生物合成存在安全風(fēng)險(xiǎn)。

琥珀酸可用于食品添加劑，藥物添加劑，去污劑添加物，發(fā)泡劑，離子螯合劑。目前，國(guó)際市場(chǎng)上工業(yè)用琥珀酸的年需求量超過(guò)15,000噸，售價(jià)在$5.90～8.80/kg(因純度而異)，市場(chǎng)潛力較大。目前，許多的化工產(chǎn)品都是以苯為原料的，但苯是石油化工產(chǎn)品，不具有可再生性。從長(zhǎng)遠(yuǎn)考慮必須找到合適的可再生原料取代苯。利用生物技術(shù)，發(fā)酵合成琥珀酸是近年來(lái)得研究熱點(diǎn)。葡萄糖經(jīng)糖酵解途徑生產(chǎn)磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和丙酮酸。PEP經(jīng)羧化生成草酰乙酸，繼而還原生成琥珀酸及延胡索酸，最后再經(jīng)一步還原生成琥珀酸。常規(guī)利用代謝工程方法改造大腸桿菌以生產(chǎn)琥珀酸的方法是通過(guò)失活丙酮酸-甲酸裂解酶和乳酸脫氫酶以消除包括甲酸、乙酸、乙醇和乳酸等競(jìng)爭(zhēng)途徑。Millard等人通過(guò)在大腸桿菌JCL1208中過(guò)量表達(dá)PEP羧化酶，可以使琥珀酸產(chǎn)量提高3.5倍，但過(guò)量表達(dá)PEP激酶卻沒(méi)有任何效果。

在琥珀酸合成過(guò)程中，不管是利用PEP還是用丙酮酸合成，都需要利用一分子的二氧化碳。如果能聯(lián)產(chǎn)異戊二烯和琥珀酸，使合成異戊二烯過(guò)程中釋放的二氧化碳用于合成琥珀酸，就可避免碳原子的浪費(fèi)。此外，在厭氧條件下，由于不存在外源電子受體，要以中間產(chǎn)物為 電子受體二自身得以氧化，要保證細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡。即現(xiàn)有方法中碳原子利用最大化與氧化還原平衡之間存在矛盾，若要滿足氧化還原平衡，底物中一半的碳原子會(huì)以PEP或(和)草酰乙酸的形式積累；若要滿足碳最大化的流向目標(biāo)產(chǎn)物，又需要額外添加NADH。然而，基于細(xì)胞代謝的復(fù)雜性，通過(guò)基因工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)將異戊二烯合成過(guò)程中產(chǎn)生的二氧化碳用于琥珀酸的合成存在很大的不可預(yù)知性和不確定性，因此，目前尚沒(méi)有聯(lián)產(chǎn)異戊二烯和琥珀酸的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種聯(lián)產(chǎn)琥珀酸和異戊二烯的基因工程菌及其構(gòu)建方法，所采取的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種聯(lián)產(chǎn)琥珀酸和異戊二烯的基因工程菌。該基因工程菌是在大腸桿菌中同時(shí)過(guò)表達(dá)異戊二烯合成途徑所需酶的基因和丙酮酸羧化酶基因。

優(yōu)選地，所述異戊二烯合成途徑，是異戊二烯MVA合成途徑或MEP合成途徑。

優(yōu)選地，所述基因工程菌是在大腸桿菌中共表達(dá)乙酰輔酶A酰基轉(zhuǎn)移酶/羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因、3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A合酶基因、甲羥戊酸激酶基因、甲羥戊酸-5-磷酸激酶基因、甲羥戊酸-5-二磷酸脫羧酶基因、異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶基因、異戊二烯合成酶基因和丙酮酸羧化酶基因。

更優(yōu)選地，所述乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶/羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因、3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A合酶基因和異戊二烯合成酶基因連接于pACYCDuet-1質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)上；所述甲羥戊酸激酶基因、甲羥戊酸-5-磷酸激酶基因、甲羥戊酸-5-二磷酸脫羧酶基因和異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶基因連接于pTrc質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)上；所述丙酮酸羧化酶基因連接于pCOLADuet-1質(zhì)粒上。

優(yōu)選地，所述大腸桿菌，共表達(dá)1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因、5-磷酸脫氧木酮糖還原異構(gòu)酶基因、異戊二烯合成酶基因和丙酮酸羧化酶基因。

更優(yōu)選地，所述1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因、5-磷酸脫氧木酮糖還原異構(gòu)酶基因和異戊二烯合成酶基因連接于pACYDuet-1質(zhì)粒的多克隆表達(dá)位點(diǎn)上；所述丙酮酸羧化酶基因連接于pCOLADuet-1質(zhì)粒上。

本發(fā)明的另一目的是提供一種所述基因工程菌的構(gòu)建方法，該方法的步驟如下：

1)將乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶基因/羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因mvaE、3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A合酶基因mvaS以及異戊二烯合成酶基因isps4克隆到質(zhì)粒pACYCDuet-1，構(gòu)建重組質(zhì)粒pACY-mvaE-mvaS-isps4；

2)將甲羥戊酸激酶基因ERG12、甲羥戊酸-5-磷酸激酶基因ERG8、甲羥戊酸-5-二磷酸脫羧酶基因ERG19以及異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶基因IDI1克隆到pTrcHis2B，得到重組質(zhì)粒pTrc-low；

3)將丙酮酸羧化酶基因pyc克隆到質(zhì)粒pCOLADUet-1上，得到重組質(zhì)粒pCOLA-PYC；

4)將步驟1)，2)和3)所得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌宿主細(xì)胞中，獲得基因工程菌。

本發(fā)明還提供了另一種所述基因工程菌的構(gòu)建方法，該方法的步驟如下：

1)將丙酮酸羧化酶基因pyc克隆到質(zhì)粒pCOLADUet-1上，得到重組質(zhì)粒pCOLA-PYC；

2)將1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因dxs、5-磷酸脫氧木酮糖還原異構(gòu)酶基因dxr和異戊二烯合成酶基因isps4克隆到質(zhì)粒pACYCDuet-1，構(gòu)建重組質(zhì)粒pACY-dxs-dxr-isps4；

3)將步驟1)和步驟2)所制備的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌宿主細(xì)胞中，獲得基因工程菌。

所述任一基因工程菌在發(fā)酵生產(chǎn)異戊二烯和琥珀酸中的應(yīng)用也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

所述應(yīng)用的步驟如下：

1)將權(quán)利要求1所述基因工程菌接種到M9種子培養(yǎng)基中，在37℃、180rpm活化培養(yǎng)18-24h，獲得種子菌液；

2)將步驟1)所得的種子菌液以10％的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在轉(zhuǎn)速300-800rpm，37℃的條件下培養(yǎng)至OD₆₀₀為20-40，再添加總濃度為0.1-1.0mM的IPTG，關(guān)閉空氣，通過(guò)氮?dú)饣蚨趸?，并利用氨水或碳酸鉀控制pH在7.0，在厭氧25-37℃的條件下誘導(dǎo)表達(dá)。

本發(fā)明所涉及的各種基因中，所述乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶基因/羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因、3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A合酶基因優(yōu)選來(lái)源于糞腸球菌(Enterococcus faecalis)；所述甲羥戊酸激酶基因、甲羥戊酸-5-磷酸激酶基因、甲羥戊酸-5-二磷酸脫羧酶基因、異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶基因優(yōu)選來(lái)源于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。所述異戊二烯合成酶基因來(lái)源于銀白楊(Populus alba)；所述丙酮酸羧化酶基因，優(yōu)選來(lái)源于枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)；所述1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因、5-磷酸脫氧木酮糖還原異構(gòu)酶基因，優(yōu)選來(lái)源于枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)或大腸桿菌。

本發(fā)明所述宿主大腸桿菌優(yōu)選大腸桿菌BL21(DE3)。

本發(fā)明獲得的有益效果如下：

(1)沒(méi)有碳的浪費(fèi)，具有原子經(jīng)濟(jì)性。

(2)產(chǎn)品異戊二烯和琥珀酸都是具有很高附加值的產(chǎn)品，具有創(chuàng)造性。

(3)產(chǎn)品異戊二烯為氣體，琥珀酸為液體，易于分離，具有規(guī)?；瘽摿?。

(4)有助于細(xì)胞體內(nèi)氧化還原平衡，提高目標(biāo)產(chǎn)物總產(chǎn)率。

(5)本發(fā)明沒(méi)有二氧化碳?xì)怏w排放，綠色環(huán)保。

附圖說(shuō)明

圖1為pLWPYC1的質(zhì)粒圖譜。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明不受實(shí)施例的限制。

以下實(shí)施例中所用材料、試劑、儀器和方法，未經(jīng)特殊說(shuō)明，均為本領(lǐng)域中的常規(guī)材料、試劑、儀器和方法，均可通過(guò)商業(yè)渠道獲得。

實(shí)施例1

(1)丙酮酸羧化酶基因的克隆、表達(dá)

以枯草芽孢桿菌的基因組(Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168，NC_000964.3)為模板，擴(kuò)增基因片段，同時(shí)連入酶切位點(diǎn)AatⅡ和XhoI。以PYC-F-AatⅡ:5’-ATCGGACGTCATGTTTGGTGACAAGGTAAAAG-3’

PYC-R-XhoI:5’-CCGCTCGAGTTATGCTTTTTCAATTTCAAGG-3’為引物，以枯草芽孢桿菌的DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增體系如表1所示：

表1 PCR擴(kuò)增體系

PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，53℃退火30s，72℃延伸2min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物純化后，利用內(nèi)切酶AatⅡ和XhoI進(jìn)行雙酶切，再連接到同樣進(jìn)行雙酶切的pCOLADUet-1載體上，形成質(zhì)粒pLWPYC1。

連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，然后涂布加有50μg·mL^-1卡那霉素的LB固體平板，PCR篩選陽(yáng)性克隆，從陽(yáng)性克隆中提取重組質(zhì)粒后，再通過(guò)限制性酶切和測(cè)序鑒定。

(2)E.coli重組菌株的構(gòu)建

將來(lái)源于糞腸球菌(Enterococcus faecalis)的乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶基因/羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因mvaE，3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A合酶基因mvaS和來(lái)源于楊樹(shù)(Populus alba)的的異戊二烯合成酶基因isps4(Gen Bank No.AB198180)連接到pACYCDuet-1質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)上，具體連接方法參見(jiàn)文獻(xiàn)(Bioresource Technology 104(2012)642–647)，構(gòu)建出MVA上游質(zhì)粒(pACY-MvaE-MVAS-isps4)。將來(lái)源于釀酒酵母的甲羥戊酸激酶基因ERG12，甲羥戊酸-5-磷酸激酶基因ERG8，甲羥戊酸-5-二磷酸脫羧酶基因ERG19，異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶基因IDI1，連接到質(zhì)粒pTrcHis2B上，具體連接方法參加文獻(xiàn)(Bioresource Technology 104(2012)642–647)，形成MVA下游質(zhì)粒pTrc-low。將MVA上游質(zhì)粒(pACY-MvaE-MVAS-isps4)和下游途徑質(zhì)粒pTrc-low及pLWPYC1共同熱擊轉(zhuǎn)化到E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂布于加有氯霉素、卡那霉素和氨芐霉素抗生素的LB固體平板，通過(guò)PCR篩選獲得陽(yáng)性克隆，由此獲得工程大腸桿菌LWPYC1。

將MVA上游(pACY-MvaE-MVAS-isps4)和下游途徑(pTrc-ERG12-EGR8-ERG19-IDI1)共同熱擊轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂布于加有氯霉素和氨芐霉素抗生素的LB固體平板，由此獲得工程大腸桿菌LWIP1作為對(duì)照菌。

(3)發(fā)酵產(chǎn)異戊二烯和琥珀酸

挑取步驟(2)獲得的LWPYC1的白色單克隆(12h內(nèi)長(zhǎng)出的)在3ml LB(氯霉素Cm+氨芐霉素Amp+卡那霉素Kan,1‰)中，于37℃搖床培養(yǎng)活化。菌體濃度為1.0左右轉(zhuǎn)接至30ml LB(Amp+Cm+Kan)中進(jìn)行擴(kuò)培，作為種子。

取擴(kuò)培后的菌液按1％接種量接入100ml發(fā)酵培養(yǎng)基(K₂HPO₄·3H₂O 0.98g；一水合檸檬酸0.21g；檸檬酸鐵銨0.03g；MD牛肉粉0.9g；葡萄糖0.2g；MgSO₄(1M)200ul；微量元素100μl((NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 7.4g/L，ZnSO₄·7H₂O 5.8g/L，H₃BO₄49.4g/L，CuSO₄·5H₂O 5g/L，MnCl₂·4H₂O 31.6g/L)；氨芐青霉素50μg/mL；氯霉素34μg/mL)，37℃搖菌，菌體濃度長(zhǎng)至1.0左右加入終濃度為0.5mM的IPTG，加瓶塞，進(jìn)行厭氧發(fā)酵。30℃，180rpm搖菌。

對(duì)照菌LWIP1培養(yǎng)同LWPYC1，僅抗生素為(Amp+Cm)。

(4)產(chǎn)物檢測(cè)

發(fā)酵24-48h后，抽上層氣體進(jìn)行GC-MS檢測(cè)異戊二烯。取發(fā)酵液檢測(cè)琥珀酸。琥珀酸的檢測(cè)利用LC-MS進(jìn)行。結(jié)果表明菌株LWPYC1可合成0.8g/L異戊二烯及1g/L的琥珀酸，異戊二烯和琥珀酸的總轉(zhuǎn)化率之和達(dá)35.5％；對(duì)照菌LWIP1合成異戊二烯0.79g/L及200mg/L琥珀酸。轉(zhuǎn)化率為11％。

實(shí)施例2

(1)E.coli重組菌株的構(gòu)建

將經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化后的來(lái)源于楊樹(shù)(Populus nigra)的異戊二烯合成酶基因ispS(GenBank accession No.HQ684728)和來(lái)源于枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因dxs(Gene ID:938609)和1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶基因dxr(Gene ID:939636)連接到質(zhì)粒pACYCDuet-1上，構(gòu)建出質(zhì)粒pAdxs2/dxr2/ispS，具體連接方法參加文獻(xiàn)(Applied Microbiology and Biotechnology(2011)90:1915–1922)。將質(zhì)粒pAdxs2/dxr2/ispS轉(zhuǎn)化導(dǎo)入E.coli BL21(DE3)細(xì)胞中，構(gòu)建出含有MEP途徑的工程菌株ZYR4。將ZYR4制備成感受態(tài)細(xì)胞，再將質(zhì)粒pLWPYC1轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞，涂布于加有氯霉素和卡那霉素的LB固體平板，通過(guò)PCR篩選獲得陽(yáng)性克隆，由此獲得工程大腸桿菌LWPYC2。以工程菌ZYR4作為對(duì)照菌。

(3)發(fā)酵產(chǎn)異戊二烯和琥珀酸

挑取步驟(2)獲得的LWPYC2的白色單克隆(12h內(nèi)長(zhǎng)出的)在3ml LB(Cm+Kan,1‰)中，于37℃搖床培養(yǎng)活化。菌液濃度為1.0左右轉(zhuǎn)接至30ml LB(Cm+Kan)中進(jìn)行擴(kuò)培，作為種子。

取擴(kuò)培后的菌液按1％接種量接入100ml發(fā)酵培養(yǎng)基(K₂HPO₄·3H₂O 0.98g；一水合檸檬酸0.21g；檸檬酸鐵銨0.03g；MD牛肉粉0.9g；葡萄糖0.2g；MgSO₄(1M)200ul；微量元素100μl((NH₄)6Mo₇O₂₄·4H₂O 7.4g/L，ZnSO₄·7H₂O 5.8g/L，H₃BO₄49.4g/L，CuSO₄·5H₂O5g/L，MnCl₂·4H₂O 31.6g/L)；氨芐青霉素50μg/mL；氯霉素34μg/mL)，37℃搖菌，菌濃長(zhǎng)至1.0左右加入終濃度為0.5mM的IPTG，加瓶塞，進(jìn)行厭氧發(fā)酵。30℃，180rpm搖菌。對(duì)照菌ZYR4培養(yǎng)同LWPYC2，僅抗生素為氯霉素。

(4)產(chǎn)物檢測(cè)

發(fā)酵24-48h后，抽上層氣體進(jìn)行GC-MS檢測(cè)異戊二烯。取發(fā)酵液檢測(cè)琥珀酸。琥珀酸的檢測(cè)利用琥珀酸檢測(cè)試劑盒(Oxaloacetate Assay Kit,sigma)進(jìn)行。結(jié)果表明菌株LWPYC2可合成300mg/L異戊二烯及5g/L的琥珀酸；對(duì)照菌ZYR4合成異戊二烯280mg/L及400mg/L琥珀酸。

實(shí)施例3

M9種子培養(yǎng)基(/L)：20g葡萄糖，6g Na₂HPO₄，3g KH₂PO₄，1g NH₄Cl，0.5gNaCl，0.24g MgSO₄，121℃高壓蒸汽滅菌15min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(/2L)：19.6g K₂HPO₄·3H₂O，4.2g citric acid·H₂O，0.6g檸檬酸鐵銨，0.8ml濃硫酸，40g葡萄糖，0.123mg(NH₄)₆Mo₇O₂·4H2O，0.097mg ZnSO₄·7H₂O，0.823mg H₃BO₄，0.083mg CuSO₄·5H₂O，0.527mg MnCl₂·4H₂O，4ml 1M MgSO₄，1900ml蒸餾水。

挑取菌株LWPYC1單克隆到50ml M9種子培養(yǎng)基中，37℃、180rpm活化過(guò)夜(18-24h)。將種子按10％的接種量接種至含有2L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L小型發(fā)酵罐中，通氣量1.3VVM，轉(zhuǎn)速400rpm，37℃培養(yǎng)至OD₆₀₀約為20時(shí)，添加終濃度為0.1-1mM的IPTG，25℃-37℃誘導(dǎo)表達(dá)，通入二氧化碳，以碳酸鉀和氫氧化鉀調(diào)pH，控制pH在7.0，每隔8h補(bǔ)加一次IPTG。得到的異戊二烯產(chǎn)物通過(guò)GC-MS對(duì)其進(jìn)行定性和定量分析。培養(yǎng)過(guò)程中對(duì)發(fā)酵液中殘余葡萄糖進(jìn)行檢測(cè)，并通過(guò)變速流加濃度為800g/L的糖液，維持殘?zhí)菨舛仍?.5g/L以下。每4h取發(fā)酵液5ml，測(cè)定細(xì)胞OD₆₀₀、葡萄糖濃度；每15min取尾氣1ml，利用氣相色譜檢測(cè)產(chǎn)物異戊二烯和二氧化碳濃度。直到OD不再變化，產(chǎn)物不再產(chǎn)生為止。

結(jié)果表明菌株LWPYC1可合成6g/L異戊二烯及12g/L的琥珀酸，異戊二烯和琥珀酸的總轉(zhuǎn)化率之和達(dá)24％，是對(duì)照菌的3倍。

實(shí)施例4

挑取菌株LWPYC1單克隆到50ml M9種子培養(yǎng)基中，37℃、180rpm活化過(guò)夜(18-24h)。將種子按10％的接種量接種至含有2L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L小型發(fā)酵罐中，通氣量1.3VVM，轉(zhuǎn)速400rpm，37℃培養(yǎng)至OD₆₀₀約為40時(shí)，添加終濃度為0.1-1mM的IPTG，25℃-37℃誘導(dǎo)表達(dá)，通入二氧化碳，以碳酸鉀和氫氧化鉀調(diào)pH，控制pH在7.0，每隔8h補(bǔ)加一次IPTG。得到的異戊二烯產(chǎn)物通過(guò)GC對(duì)其進(jìn)行定性和定量分析。培養(yǎng)過(guò)程中對(duì)發(fā)酵液中殘余葡萄糖進(jìn)行檢測(cè)，并通過(guò)變速流加濃度為800g/L的糖液，維持殘?zhí)菨舛仍?.5g/L以下。每4h取發(fā)酵液5ml，測(cè)定細(xì)胞OD₆₀₀、葡萄糖濃度；每15min取尾氣1ml，利用氣相色譜檢測(cè)產(chǎn)物異戊二烯和二氧化碳濃度。直到OD不再變化，產(chǎn)物不再產(chǎn)生為止。

結(jié)果表明菌株LWPYC1可合成10g/L異戊二烯及25g/L的琥珀酸，異戊二烯和琥珀酸的總轉(zhuǎn)化率是對(duì)照菌的2.8倍。

雖然本發(fā)明已以較佳的實(shí)施例公開(kāi)如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明精神和范圍內(nèi)，都可以做各種的改動(dòng)與修飾，因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。