專利名稱:酵母發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)麥角固醇和谷胱甘肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種高密度培養(yǎng)酵母細(xì)胞以及通過酵母細(xì)胞生產(chǎn)麥角固醇和谷胱甘肽的方法,屬于生物發(fā)酵工程領(lǐng)域。
背景技術(shù):
麥角固醇和谷胱甘肽均為重要的醫(yī)用品和保健品,目前國內(nèi)外用發(fā)酵法生產(chǎn)麥角固醇或谷胱甘肽是最為普遍的方法,即通過培養(yǎng)生產(chǎn)麥角固醇或谷胱甘肽的酵母得到產(chǎn)品。為了提高該方法生產(chǎn)產(chǎn)品的水平,人們通過選育(或構(gòu)建)合成能力強(qiáng)和胞內(nèi)含量高的菌種,篩選和優(yōu)化培養(yǎng)基配方,建立和優(yōu)化發(fā)酵控制,改進(jìn)和提高下游工程技術(shù)等多方面來提高產(chǎn)率和質(zhì)量。如Wenck采用曲霉菌生產(chǎn)麥角固醇,麥角固醇含量占細(xì)胞干重2.23%[Wenck P R,Peterson W.The production of yeast fat.Bacteriol Parasitenk.1935.92330-338]。Savard采用青霉素菌生產(chǎn)麥角固醇,含量達(dá)到細(xì)胞干重1.8%[Savard K,Grant G A.Ergosterolaccumulation in yeast cells.Science.1994.104459-460]。Eugene選育了不同酵母菌生產(chǎn)麥角固醇,含量可達(dá)到細(xì)胞干重的2%-3%[Eugene L D,Stapley E O,Katherine S.App Microbial.1954.2371-379]。張博潤等人對產(chǎn)麥角固醇酵母進(jìn)行了原生質(zhì)體融合,得到了高產(chǎn)麥角固醇菌種,產(chǎn)品含量達(dá)到細(xì)胞干重的2.7%[張博潤.麥角固醇高產(chǎn)菌株的構(gòu)建及其培養(yǎng)優(yōu)化條件的研究。應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報。1999.15(1)77-80]。高樺采用控制溶氧的脈沖式流加,使麥角固醇的產(chǎn)量穩(wěn)定在1000mg/L左右[高樺.酵母發(fā)酵生產(chǎn)麥角固醇工藝的研究及應(yīng)用。北京化工大學(xué)碩士學(xué)位論文.2002]。
發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽的工藝及方法也不斷改進(jìn),其中以誘變處理獲得高谷胱甘肽含量的酵母變異菌株來生產(chǎn)谷胱甘肽最為常見。李寅等研究了谷胱甘肽發(fā)酵條件,確定了合適的搖瓶補(bǔ)糖策略,補(bǔ)糖結(jié)束時谷胱甘肽總量達(dá)到119mg/L[李寅,陳堅(jiān),倫世儀.高密度培養(yǎng)工程菌生產(chǎn)谷胱甘肽。中國醫(yī)藥工業(yè)雜志。1999.30(1)1-4]。Sakato等同時利用補(bǔ)糖和乙醇控制方法,使谷胱甘肽總量和含量分別達(dá)到2360mg/L和3.7%[Sakato K,Tanaka H.Advanced control ofglutathione fermentation process.Biotechnol.Bioeng.1992.40(8)904-912]。
綜上所述,現(xiàn)有的技術(shù)所做的都是利用酵母菌培養(yǎng)來單獨(dú)生產(chǎn)麥角固醇或單獨(dú)生產(chǎn)谷胱甘肽一種產(chǎn)物,存在原料利用率低、成本高等問題。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提出了利用酵母發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)麥角固醇和谷胱甘肽的方法,同時通過酵母細(xì)胞的高密度培養(yǎng),使酵母表達(dá)聯(lián)產(chǎn)麥角固醇和谷胱甘肽的生物量水平達(dá)到單獨(dú)發(fā)酵麥角固醇或谷胱甘肽的較高水平,從而提高了原料的利用率。
本發(fā)明以酵母作為培養(yǎng)菌株,采用優(yōu)化的聯(lián)產(chǎn)培養(yǎng)基配方,包括接入菌種、向發(fā)酵液中流加營養(yǎng)物和添加調(diào)節(jié)劑,控制發(fā)酵液生產(chǎn)酵母細(xì)胞以及酵母代謝產(chǎn)物的條件等發(fā)酵工藝過程,其中酵母培養(yǎng)基中按每升發(fā)酵液的質(zhì)量含量配制碳元素16g/L-25g/L,氮元素2g/L-3g/L,無機(jī)鹽及金屬離子7g/L-41g/L,所述的碳元素碳源來自葡萄糖、蔗糖或麥芽汁,氮元素氮源來自玉米漿、酵母粉或蛋白胨,無機(jī)鹽是硫酸鎂和磷酸鹽;發(fā)酵過程中向發(fā)酵液中流加營養(yǎng)物質(zhì)是葡萄糖,玉米漿和糖蜜;添加的調(diào)節(jié)劑為KOH、NH4NO3、尿素或氨水,控制發(fā)酵液中乙醇濃度為10-50g/L,發(fā)酵液的pH值調(diào)節(jié)在2-8之間,發(fā)酵液的溫度控制范圍在20-35℃,發(fā)酵周期為1-3天,得到聯(lián)產(chǎn)麥角固醇和谷胱甘肽發(fā)酵液。
上述的金屬離子是發(fā)酵液中通常用的Zn2+、Fe2+、Cu2+和Mn2+。
上述的磷酸鹽是發(fā)酵中常用的磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀或磷酸氫二銨。
上述所用菌種包括釀酒酵母、產(chǎn)朊假絲酵母、熱帶假絲酵母或通過誘變和基因工程改造的工程菌。
在上述的發(fā)酵液中還可以加入硝酸鈉,以促進(jìn)產(chǎn)物的合成。
本發(fā)明利用優(yōu)化的培養(yǎng)基配方,同時通過含氮的弱堿性調(diào)節(jié)劑和添加劑調(diào)節(jié)控制合理的發(fā)酵條件,促進(jìn)產(chǎn)物合成,實(shí)現(xiàn)一次發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)麥角固醇和谷胱甘肽,使培養(yǎng)基底物得到充分利用,提高了原料的利用率,降低了生產(chǎn)成本;實(shí)現(xiàn)了酵母細(xì)胞的高密度培養(yǎng),使酵母表達(dá)聯(lián)產(chǎn)麥角固醇和谷胱甘肽的生物量水平達(dá)到單獨(dú)發(fā)酵麥角固醇或谷胱甘肽時的較高水平。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明較好的實(shí)施方式是配制發(fā)酵培養(yǎng)基配方為(以每升發(fā)酵液中質(zhì)量含量配置)葡萄糖40g/L-60g/L,玉米漿15g/L-45g/L,磷酸氫二鉀2g/L-15g/L,磷酸二氫鉀2g/L-20g/L,硫酸鎂3g/L-6g/L,NaNO34g/L-8g/L,Zn2+8-15ppm,F(xiàn)e2+、Cu2+、Mn2+各2-6ppm,按常規(guī)的滅菌方式在121℃下實(shí)罐滅菌30分鐘,待培養(yǎng)基溫度降至30℃后接入菌種,按10%的(種子液與發(fā)酵液的體積比)接種量接入發(fā)酵罐,攪拌轉(zhuǎn)速在200-600rpm,通風(fēng)比為1.0-1.5VVM,控制溫度30℃左右開始發(fā)酵,發(fā)酵液的溫度控制范圍在20-35℃,從發(fā)酵后第9-10小時開始流加葡萄糖溶液和玉米漿溶液,以及尿素和氨水,發(fā)酵進(jìn)行至22-24小時,乙醇濃度降至17g/L-30g/L,此時根據(jù)乙醇濃度調(diào)節(jié)流加營養(yǎng)物速率,當(dāng)乙醇濃度上升時,減小流加速率,當(dāng)乙醇濃度下降時,增大流加速率,以控制發(fā)酵液中的乙醇濃度維持在10g/L-20g/L,發(fā)酵液的pH值控制在2-8之間,經(jīng)過24-72小時發(fā)酵,生物量達(dá)到96g/L-124g/L(干重),麥角固醇總量為810mg/L-1220mg/L,谷胱甘肽總量為930mg/L-1561mg/L。
上述所用菌種是釀酒酵母、產(chǎn)朊假絲酵母、熱帶假絲酵母或通過誘變和基因工程改造的工程菌。其中通過誘變和基因工程改造的工程菌是指通過紫外線或化學(xué)試劑常規(guī)的誘變手段,以及通過PCR技術(shù)擴(kuò)增表達(dá)基因并構(gòu)建人工質(zhì)粒等方法改造的菌種。
實(shí)施例1培養(yǎng)熱帶假絲酵母生產(chǎn)麥角固醇和谷胱甘肽使用5L通用式發(fā)酵罐配制3L發(fā)酵培養(yǎng)基,培養(yǎng)基配方葡萄糖40g/L,玉米漿45g/L,麥芽汁20g/L,硫酸鎂4.5g/L,磷酸氫二鉀12g/L,磷酸二氫鉀12g/L,Zn2+14ppm,F(xiàn)e2+、Cu2+、Mn2+各6ppm,在121℃下實(shí)罐滅菌30分鐘。待培養(yǎng)基溫度降至30℃后,按10%的(種子液與發(fā)酵液的體積比)接種量接種,調(diào)節(jié)通風(fēng)比為1.3VVM,攪拌轉(zhuǎn)速為400rpm,開始發(fā)酵,發(fā)酵12小時,發(fā)酵液的溫度控制范圍在20-35℃,此時發(fā)酵液中的乙醇濃度為降至50g/L,開始流加濃度為700g/L的葡萄糖、糖蜜和玉米漿水溶液,調(diào)節(jié)流加速率,維持發(fā)酵液中的乙醇濃度在35-40g/L,同時添加葡萄糖和氨水使發(fā)酵液pH值在5.5-6.5之間,發(fā)酵后期加入硝酸鈉4g/L,發(fā)酵24小時,生物量達(dá)到96g/L(干重),麥角固醇總量為810mg/L,谷胱甘肽總量為930mg/L。
實(shí)施例2培養(yǎng)產(chǎn)朊假絲酵母生產(chǎn)麥角固醇和谷胱甘肽使用5L通用式發(fā)酵罐發(fā)酵。配制3L發(fā)酵培養(yǎng)基,培養(yǎng)基配方葡萄糖60g/L,玉米漿30g/L,麥芽汁10g/L,磷酸氫二銨7g/L,硫酸鎂6g/L,磷酸氫二鉀10g/L,磷酸二氫鉀20g/L,Zn2+15ppm,F(xiàn)e2+、Cu2+、Mn2+各2ppm,在121℃下實(shí)罐滅菌30分鐘。待培養(yǎng)基溫度降至30℃后按10%的(種子液與發(fā)酵液的體積比)接種量接種,調(diào)節(jié)通風(fēng)比為1.0VVM,攪拌轉(zhuǎn)速為300rpm,開始發(fā)酵。發(fā)酵液的溫度控制范圍在20-35℃,發(fā)酵13小時,此時發(fā)酵液中的乙醇濃度為降至45g/L,開始流加濃度為600g/L的葡萄糖、玉米漿和糖蜜水溶液,調(diào)節(jié)流加速率,維持發(fā)酵液中的乙醇濃度在30-35g/L,同時添加葡萄糖、氨水和尿素,使發(fā)酵液pH值在2.2-4.3之間,發(fā)酵后期加入硝酸鈉8g/L,發(fā)酵56小時,生物量達(dá)到110g/L(干重),麥角固醇總量為960mg/L,谷胱甘肽總量為972mg/L。
實(shí)施例3培養(yǎng)釀酒酵母生產(chǎn)麥角固醇和谷胱甘肽使用5L通用式發(fā)酵罐發(fā)酵。配制2.5L發(fā)酵培養(yǎng)基,培養(yǎng)基配方葡萄糖60g/L,玉米漿44g/L,磷酸二氫鉀2g/L,硫酸鎂3g/L,Zn2+12ppm,F(xiàn)e2+、Cu2+、Mn2+各4ppm),在121℃下實(shí)罐滅菌30分鐘。待培養(yǎng)基溫度降至30℃后按10%的(種子液與發(fā)酵液的體積比)接種量接種,調(diào)節(jié)通風(fēng)比為1.0VVM,攪拌轉(zhuǎn)速為200rpm,開始發(fā)酵。發(fā)酵液的溫度控制范圍在20-35℃,從發(fā)酵后第10小時開始流加濃度為600g/L的葡萄糖溶液和濃度為100g/L的玉米漿溶液,發(fā)酵進(jìn)行至22小時,乙醇濃度降至17g/L,此時根據(jù)乙醇濃度調(diào)節(jié)流加速率,發(fā)酵液中的乙醇濃度維持在15-25g/L。同時添加葡萄糖、尿素和KOH,使發(fā)酵液pH值在6.5-8之間,發(fā)酵后期加入硝酸鈉6g/L,經(jīng)過64小時發(fā)酵,生物量達(dá)到124g/L(干重),麥角固醇總量為1121mg/L,谷胱甘肽總量為1561mg/L。
實(shí)施例5培養(yǎng)通過基因工程改造的釀酒酵母生產(chǎn)麥角固醇和谷胱甘肽通過PCR技術(shù)構(gòu)建酵母菌表達(dá)質(zhì)粒,培養(yǎng)重組轉(zhuǎn)化釀酒酵母菌株。使用30L通用式發(fā)酵罐發(fā)酵。配制25L發(fā)酵培養(yǎng)基,培養(yǎng)基配方葡萄糖55g/L,玉米漿34g/L,麥芽汁30g/L,硫酸鎂4g/L,磷酸氫二鉀7g/L,磷酸二氫鉀7g/L,Zn2+12ppm,F(xiàn)e2+、Cu2+、Mn2+各4ppm,在121℃下實(shí)罐滅菌30分鐘。待培養(yǎng)基溫度降至30℃后接種,調(diào)節(jié)通風(fēng)比為1.0VVM,攪拌轉(zhuǎn)速為600rpm,開始發(fā)酵。發(fā)酵液的溫度控制范圍在20-35℃,發(fā)酵15小時,發(fā)酵液中的乙醇濃度為降至15g/L,開始流加濃度為600g/L的葡萄糖、玉米漿和糖蜜水溶液,調(diào)節(jié)流加速率,維持發(fā)酵液中的乙醇濃度在10-15g/L,發(fā)酵48小時,生物量達(dá)到112g/L(干重),麥角固醇總量為1220mg/L,谷胱甘肽總量為860mg/L。
實(shí)施例6培養(yǎng)通過誘變技術(shù)改良的釀酒酵母生產(chǎn)麥角固醇和谷胱甘肽通過人工誘變技術(shù)改良釀酒酵母菌株。使用30L通用式發(fā)酵罐發(fā)酵。配制25L發(fā)酵培養(yǎng)基,培養(yǎng)基配方葡萄糖60g/L,玉米漿35g/L,磷酸二氫鉀5g/L,硫酸鎂6g/L,Zn2+15ppm,F(xiàn)e2+、Cu2+、Mn2+各6ppm,在121℃下實(shí)罐滅菌30分鐘。待培養(yǎng)基溫度降至30℃后接種,調(diào)節(jié)通風(fēng)比為1.2VVM,攪拌轉(zhuǎn)速為300rpm,開始發(fā)酵。發(fā)酵液的溫度控制范圍在20-35℃,從發(fā)酵后第15小時開始流加濃度為600g/L的葡萄糖溶液和濃度為100g/L的玉米漿溶液,發(fā)酵進(jìn)行至26小時,乙醇濃度降至45g/L,此時根據(jù)乙醇濃度調(diào)節(jié)流加速率,發(fā)酵液中的乙醇濃度維持在35-40g/L。同時添加葡萄糖、NH4NO3和KOH,使發(fā)酵液pH值在6.5-8之間,發(fā)酵后期加入硝酸鈉4.5g/L,經(jīng)過72小時發(fā)酵,生物量達(dá)到130g/L(干重),麥角固醇總量為1217mg/L,谷胱甘肽總量為1344mg/L。
權(quán)利要求
1.一種酵母發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)麥角固醇和谷胱甘肽的方法,以酵母作為培養(yǎng)菌株,包括培養(yǎng)基配制、接入菌種、向發(fā)酵液中流加營養(yǎng)物和添加調(diào)節(jié)劑、控制發(fā)酵液生產(chǎn)酵母細(xì)胞以及酵母代謝產(chǎn)物的發(fā)酵工藝過程,其特征在于,酵母培養(yǎng)基中以每升發(fā)酵液的質(zhì)量含量配置碳元素16g/L-25g/L,氮元素2g/L-3g/L,無機(jī)鹽及金屬離子7g/L-41g/L;所述的碳元素碳源來自葡萄糖、蔗糖或麥芽汁,氮元素氮源來自玉米漿、酵母粉或蛋白胨,無機(jī)鹽是硫酸鎂和磷酸鹽,發(fā)酵過程中向發(fā)酵液中流加營養(yǎng)物質(zhì)是葡萄糖,玉米漿和糖蜜,添加的調(diào)節(jié)劑為KOH、NH4NO3、尿素或氨水;控制發(fā)酵液中乙醇濃度為10-80g/L,發(fā)酵液的pH值調(diào)節(jié)在2-8之間,發(fā)酵液的溫度控制范圍在20-35℃,發(fā)酵周期為1-3天。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于所用菌種包括釀酒酵母、產(chǎn)朊假絲酵母、熱帶假絲酵母或通過誘變和基因工程改造的工程菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于磷酸鹽是磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀或磷酸氫二銨。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于金屬離子是Zn2+、Fe2+、Cu2+和Mn2+。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于在發(fā)酵液中通過添加硝酸鈉來促進(jìn)產(chǎn)物合成。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速在200-600rpm,通風(fēng)比為1.0-1.5VVM。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于培養(yǎng)基以每升發(fā)酵液中質(zhì)量含量配制葡萄糖40g/L-60g/L,玉米漿15g/L-45g/L,磷酸氫二鉀2g/L-15g/L,磷酸二氫鉀2g/L-20g/L,硫酸鎂3g/L-6g/L,NaNO34g/L-8g/L,Zn2+8-15ppm,F(xiàn)e2+、Cu2+、Mn2+各2-6ppm。
全文摘要
本發(fā)明是一種酵母發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)麥角固醇和谷胱甘肽的方法,利用同一種酵母菌種發(fā)酵同時生產(chǎn)兩種代謝產(chǎn)物一麥角固醇和谷胱甘肽,發(fā)酵法所用菌種為釀酒酵母、產(chǎn)朊假絲酵母、熱帶假絲酵母或通過誘變和基因工程改造的工程菌等,采用的酵母培養(yǎng)基組分包括,碳源葡萄糖、麥芽汁、蔗糖、糖蜜等,氮源玉米漿、酵母粉、蛋白胨、尿素、氨水等,無機(jī)鹽及所需的金屬離子等。本發(fā)明在利用一次發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)麥角固醇和谷胱甘肽的同時實(shí)現(xiàn)了酵母細(xì)胞的高密度培養(yǎng),使酵母表達(dá)聯(lián)產(chǎn)的生物量達(dá)到現(xiàn)有單獨(dú)發(fā)酵麥角固醇和谷胱甘肽的較高水平,充分利用培養(yǎng)基底物,提高了原料的利用率,降低了生產(chǎn)成本。
文檔編號C12R1/85GK1844407SQ200510059998
公開日2006年10月11日 申請日期2005年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月6日
發(fā)明者譚天偉, 王璽, 尚飛 申請人:北京化工大學(xué)