專利名稱：作為前列腺癌相關(guān)抗原的RM2抗原(β1,4－GalNAc－disialyl－Lc的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于一種作為人前列腺癌相關(guān)抗原的特異性糖類抗原的鑒定。
背景技術(shù)：
在美國每2.75分鐘診斷出一例前列腺癌，每年出現(xiàn)超過230000例的新病例。前列腺癌是男性中診斷出的最常見的癌癥(占所有新癌癥病例的32％以上)，每年估計(jì)有29900名男性死于前列腺癌。在美國，前列腺癌在所有類型癌癥中的發(fā)病率最高。在其他發(fā)達(dá)國家也觀察到類似趨勢。
目前前列腺特異性抗原(Prostate-specific antigen，PSA)用于診斷前列腺癌，因?yàn)樗黾膊〕３０殡S著該抗原在血清水平(＞6.1納克/毫升)上的升高。但是，PSA是一種蛋白抗原，在正常前列腺和前列腺癌中都有發(fā)現(xiàn)。良性前列腺肥大(Benign Prostate Hypertrophy，BPH)和前列腺炎也伴隨著PSA水平升高，因此PSA水平不能作為前列腺癌的決定性指標(biāo)。
很多類型的癌癥發(fā)生異常糖基化作用(細(xì)胞表面形成異常糖鏈)。異常糖基化作用的模式和伴隨特定類型癌的特異性糖基表位表達(dá)已經(jīng)被用作診斷多種類型人類癌癥的標(biāo)準(zhǔn)。
已經(jīng)開始尋找伴隨人前列腺癌表達(dá)、但不伴隨正常前列腺或良性前列腺肥大表達(dá)的異常糖鏈。本發(fā)明是關(guān)于一種被稱為“RM2抗原”(β1，4-GalNAc-disialyl-Lc4)的結(jié)構(gòu)的鑒定，該結(jié)構(gòu)特異結(jié)合單克隆抗體(monoclonal antibody，mAb)RM2。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于先前對腎細(xì)胞瘤(renal cell carcinoma，RCC)抗原的搜尋結(jié)果，將其應(yīng)用于前列腺癌的研究。最初，RCC細(xì)胞系TOS1被用作免疫原以得到與RCC反應(yīng)的單克隆抗體；該單克隆抗體被稱為“RM2”。被RM2識別的抗原結(jié)構(gòu)隨后被鑒定為β1，4-GalNAc-disialyl-Lc4(圖1)。RCC為相對罕見的癌癥類型，并且不是所有RCC都表達(dá)所述結(jié)構(gòu)。由于泌尿生殖系統(tǒng)的器官具有共同的胚胎發(fā)育，對代表不同疾病分期的35例前列腺癌病例中RM2抗原的表達(dá)進(jìn)行了系統(tǒng)檢查。所有這35例病例都顯示出與單克隆抗體RM2的陽性反應(yīng)性即存在RM2抗原，其中18例病例為中度或強(qiáng)陽性；17例病例為弱陽性。所有35例正常的腺體中都觀察到陰性或非常弱的染色，6例良性前列腺肥大未觀察到染色。中度/強(qiáng)陽性病例和弱陽性病例的中值格里森分?jǐn)?shù)(Gleason score)分別為8和7。
良性前列腺肥大中的陰性RM2表達(dá)，使RM2特別適用于診斷。良性前列腺肥大在PSA測定中常常伴隨輕度到中等程度的升高值(4-10納克/毫升)。由于RM2在良性前列腺肥大中不表達(dá)，RM2區(qū)分前列腺癌和良性前列腺肥大的能力將在升高的PSA為4-10納克/毫升的男性中，用血清RM2測試選擇活組織檢查病例時非常有用。9個根治性前列腺切除術(shù)(Radicalprostatectomy)樣本中，5個表現(xiàn)出中度/強(qiáng)陽性(moderately/strongly positive，m/s)染色，4個表現(xiàn)出弱陽性染色(weakly positive，w)。5個m/s染色病例中的4個為病理非器官局限性的(non-organ confined)，而4個w染色病例均為器官局限性的。雖然檢查的病例數(shù)目少，但RM2陽性和病理分期之間存在明顯相關(guān)性(p＜0.02)。臨床局部前列腺癌中的病理分期預(yù)測對選擇治療方案非常重要，即選擇根治性前列腺切除術(shù)還是放射治療。上述數(shù)據(jù)表明RM2還可以用于預(yù)測臨床局部前列腺癌中的病理分期，其中在約40％的同時期根治性前列腺切除術(shù)組中發(fā)現(xiàn)了病理非器官局限性癌。
根據(jù)現(xiàn)有數(shù)據(jù)，經(jīng)過PSA測試的大多數(shù)男性病人的PSA值顯示為4-10納克/毫升。然而，通過活組織檢查發(fā)現(xiàn)，PSA值在此范圍的病人只有25％患有前列腺癌，即具有“高”PSA值的病人超過70％未患有前列腺癌。世界范圍使用PSA測試意味著金錢、時間和勞動力的巨大浪費(fèi)，并使病人有心理壓力。
因此發(fā)現(xiàn)伴隨人前列腺癌但并不伴隨正常前列腺或良性前列腺肥大表達(dá)的特異性抗原，是非常重要的醫(yī)學(xué)進(jìn)步。本發(fā)明提供了一種診斷前列腺癌的方法，該方法包括在從懷疑患有前列腺癌的病人取得的樣本中，檢測具有以下所示的表位結(jié)構(gòu)的RM2抗原的存在或水平升高 其中，R表示載體。
在優(yōu)選實(shí)施方式中，用特異性結(jié)合RM2抗原的抗體檢測RM2抗原。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述抗體為RM2單克隆抗體。
本發(fā)明還提供了用于診斷前列腺癌的試劑盒，該試劑盒包括(a)至少一個特異性結(jié)合RM2抗原的部分(moiety)，所述RM2抗原具有以下所示的表位結(jié)構(gòu)，取自從懷疑患有前列腺癌的病人中獲得的樣本 其中，R表示載體；(b)用所述試劑盒診斷前列腺癌的說明書(instruction)；以及(c)選擇性地包括的通過所述部分與所述抗原的特異性結(jié)合檢測所述抗原的存在的裝置。


圖1RM2抗原的結(jié)構(gòu)；
圖2在具有不同格里森分?jǐn)?shù)的前列腺癌活組織檢查樣本中RM2抗原表達(dá)的免疫組織學(xué)圖；A組樣本1(格里森分?jǐn)?shù)5+4)；B組樣本2(格里森分?jǐn)?shù)4+5)；C組樣本3(格里森分?jǐn)?shù)5+4)；D組樣本4(格里森分?jǐn)?shù)3+3)；E組樣本5(格里森分?jǐn)?shù)4+3)；F組樣本6(格里森分?jǐn)?shù)4+3)；放大倍數(shù)200倍；在正常腺體中觀察到陰性RM2免疫染色或只觀察到弱的RM2免疫染色；圖3根治性前列腺切除術(shù)樣本中RM抗原表達(dá)的免疫組織學(xué)圖；A組樣本1(格里森分?jǐn)?shù)3+4)；B組樣本2(格里森分?jǐn)?shù)4+4)；C組樣本3(格里森分?jǐn)?shù)4+5)；放大倍數(shù)200倍；ms中度/強(qiáng)，w弱，RP根治性前列腺切除術(shù)；圖4良性前列腺肥大(A組)和正常前列腺(B組)病例的根治性前列腺切除術(shù)樣本中RM2抗原表達(dá)的免疫組織學(xué)圖；在良性前列腺肥大中未觀察到RM2免疫染色，并且在正常腺體中只觀察到很弱的RM2染色；放大倍數(shù)100倍；圖5通過RM2對前列腺癌細(xì)胞系的蛋白印跡分析(Western blotanalysis)；A組RM2免疫染色；B組小鼠IgM免疫染色(陰性對照)；1、PC3(5微克)，2、LNCap(5微克，3、PC3(10微克)，4、LNCap(10微克)，5、PC3(15微克)，6、LNCap(15微克)，7、PC3(20微克)，8、LNCap(20微克)，M分子量標(biāo)記(size marker)；除了LNCap和PC3中的幾條其它帶，RM2檢測到作為主要帶的49千道爾頓糖蛋白。
具體實(shí)施例方式
A、RM2抗原和抗體。人類腫瘤通過與鞘糖脂或糖蛋白結(jié)合的特異性糖類抗原的表達(dá)而得到辨別(Hakomori，S.1989 Adv.Cancer Res.52，257-331；Hakomori，S.1996 Cancer Res.56，5309-5318)，基于這一普通概念，描述在RCC中高度表達(dá)的慢遷移神經(jīng)節(jié)苷脂(slow-migrating ganglioside)的存在(Saito，S.，Orikasa，S.，Ohyama，C.，Satoh，M.和Fukushi，Y(1991)Int.J.Cancer 49，329-334)。通過用RCC細(xì)胞系TOS1免疫小鼠，然后反復(fù)克隆分泌能識別由RCC組織表達(dá)的慢遷移神經(jīng)節(jié)苷脂的抗體的雜交瘤，建立單克隆抗體RM2(Saito，S.，Levery，S.B.，Salyan，M.E.K.，Goldberg，R.I.，和Hakomori，S.1994 J.Biol.Chem.269，5644-5652)。通過一維和二維的1H核磁共振(1H-NMR)以及質(zhì)譜對由所述稱作“RM2抗原”的單克隆抗體RM2識別的抗原的結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步系統(tǒng)研究明確了該結(jié)構(gòu)為β1，4-GalNAc-disialyl-Lc4(圖1)。所述結(jié)構(gòu)非常新，由“神經(jīng)節(jié)系列(ganglio-series)”(圖1中1區(qū))和“二唾液酸乳糖系列1型鏈(disialyl lacto-series type 1 chain)”(圖1中2區(qū))基團(tuán)組成(Ito，A.，Levery，S.B.，Saito，S.，Satoh，M.，和Hakomori，S.2001J.Biol.Chem.276，16695-16703)。
B、作為前列腺癌相關(guān)抗原的RM2抗原。由于泌尿生殖組織和器官與個體發(fā)育相關(guān)，本發(fā)明的發(fā)明人假定在RCC中表達(dá)的抗原可能也在其他泌尿生殖癌中，特別是在發(fā)生率和死亡率最高的前列腺癌中表達(dá)。對從40例前列腺癌病例中取得的活組織檢查樣本進(jìn)行了初步研究?；罱M織檢查樣本包括了前列腺癌的所有分期，大多數(shù)為晚期的樣本。也就是說約66％的活組織檢查樣本取自患有“非器官局限性”前列腺癌的患者。用標(biāo)準(zhǔn)組織學(xué)操作將組織用福爾馬林固定并用石蠟包埋。40個樣本中，35個樣本的結(jié)構(gòu)保存完好，能夠評價免疫組織學(xué)結(jié)果。18例為中度或強(qiáng)陽性，17例為弱陽性。下面描述這些病例。
活組織檢查樣本1、18例中度/強(qiáng)陽性病例·年齡(中值)72.5歲·PSA值(中值)40納克/毫升(值域2.5-3797納克/毫升)
·格里森分?jǐn)?shù)(中值)8(全部18個病例)3個病例評分為65個病例評分為73個病例評分為87個病例評分為9·臨床分期局部化(localization)程度(T)T2及低于T26例T3及高于T312例發(fā)生轉(zhuǎn)移D2分期(轉(zhuǎn)移至骨或遠(yuǎn)淋巴結(jié)，超越局部淋巴結(jié))5例D1分期(轉(zhuǎn)移至局部淋巴結(jié))1例未發(fā)生轉(zhuǎn)移Tlc-T4N0M012例(Tlc4例，T22例，T35，T41例)2、17例弱陽性病例·年齡(中值)71歲·PSA值(中值)37納克/毫升(值域7-1723納克/毫升)·格里森分?jǐn)?shù)(中值)7(全部17個病例)3個病例評分為67個病例評分為74個病例評分為83個病例評分為9·臨床分期局部化(localization)程度(T)
T2及低于T26例T3及高于T311例發(fā)生轉(zhuǎn)移D2分期(轉(zhuǎn)移至骨或遠(yuǎn)淋巴結(jié)，超越局部淋巴結(jié))4例D1分期(轉(zhuǎn)移至局部淋巴結(jié))1例未發(fā)生轉(zhuǎn)移Tlc-T3N0M012例(Tlc3例，T23例，T36例)根治性前列腺切除術(shù)樣本(共9例)·年齡(中值)65歲·PSA值(中值)6.1納克/毫升(值域4.4-13.2納克/毫升)1、5例中度/強(qiáng)陽性病例·格里森分?jǐn)?shù)73例·格里森分?jǐn)?shù)81例·格里森分?jǐn)?shù)91例·非器官局限性(pT3及高于pT3)4例·器官局限性(pT2及低于pT2)1例2、4例弱陽性病例·格里森分?jǐn)?shù)82例·格里森分?jǐn)?shù)92例·器官局限性(pT2及低于pT2)4例C、作為腫瘤細(xì)胞糖蛋白的RM2抗原。如上面A部分所述，原本發(fā)現(xiàn)RM2為鞘糖脂(二唾液酸神經(jīng)節(jié)苷酯)。然而在腫瘤細(xì)胞中出現(xiàn)的一些抗原能通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)及隨后的蛋白印跡分析而檢測到。簡言之，細(xì)胞置于冰上，用冰冷的磷酸緩沖液(PBS)沖洗，并用細(xì)胞裂解緩沖液(20mM pH7.4的三羥甲基氨基甲烷(Tris)、150mM NaCl、2mM乙二胺四乙酸(EDTA)、1％乙基苯基聚乙二醇(NP40)、50mM NaF、10微克/毫升抑肽酶(aprotinin)、10微克/毫升亮肽酶素(leupeptin)、1mM苯甲基磺酰氟化物(PMSF)、1mM Na3VO4)裂解。通過12000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘使提取物澄清。含有等量蛋白的溶胞產(chǎn)物通過在10％的SDS-PAGE上電泳而解離然后轉(zhuǎn)移至Hybond P聚偏二氟乙烯膜(Amersham Biosciences，瑞典)。用含有1％牛血清白蛋白(BSA)的三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽水-吐溫封閉劑(TBS-Tween)封閉上述膜，然后和初級抗體孵育。用適當(dāng)?shù)倪^氧化物酶偶聯(lián)的次級抗體，然后用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)(ECL，BoehringerMannheim，德國)檢測結(jié)合的抗體。
重要的一點(diǎn)是，與鞘糖脂抗原相比，糖蛋白抗原更容易從細(xì)胞中釋放出來。許多在血清檢查時用作診斷探針的腫瘤相關(guān)抗原是糖蛋白而不是鞘糖脂D、前列腺癌的診斷方法本發(fā)明提供了一種診斷前列腺癌的方法，該方法包括在從懷疑患有前列腺癌的病人取得的樣本中，檢測具有以下所示的表位結(jié)構(gòu)的RM2抗原的存在或水平升高 其中，R表示載體。
所述方法特別用于區(qū)別良性前列腺肥大和惡性前列腺癌。
適合的載體包括(i)N連接或O連接到糖蛋白上的乳糖胺(lactosamine)鏈、(ii)鞘糖脂中的4糖基β1-1神經(jīng)酰胺(4Glcβ1-1Cer)或者(iii)任何其它自然產(chǎn)生或合成的載體分子。
適合用于診斷前列腺癌的樣本包括癌性前列腺組織的活組織檢查樣本、來自全前列腺切除術(shù)的樣本以及血清。
根據(jù)本發(fā)明，診斷前列腺癌的方法可以為任何能夠檢測樣本中RM2抗原的存在或水平升高的方法，所述樣本中RM2抗原的存在或水平升高與前列腺癌的發(fā)生相互關(guān)聯(lián)。檢測RM2抗原存在或水平升高的方法的例子包括“三明治”免疫測定法(″sandwich″immunoassays)、電噴射離子化作用(electrospray ionization，ESI)和基質(zhì)輔助激光解吸/離子化作用(matrix-assisted laser desorption/ionization，MALDI)質(zhì)譜(mass spectrometry，MS)和表面胞質(zhì)基因共振(surface plasmon resonance，SPR)光譜法。
使用用于PSA分析的、具有雙重單克隆抗體化驗(yàn)的“三明治”法(McCormack RT等人，″Molecular forms of prostate-specific antigen and thehuman kallikrein gene familya new era″，Urology 45(5)729-44，1995；Karazanashvili G，Abrahamsson PA，″Prostate specific antigen and humanglandular kallikrein 2 in early detection of prostate cancer″，J.Urology 169(2)445-457，2003)，發(fā)現(xiàn)了一種與RM2抗原有反應(yīng)性的49千道爾頓的糖蛋白，正如蛋白印跡分析證實(shí)，該糖蛋白為從腫瘤細(xì)胞中釋放出來的主要糖蛋白。此外，通過用RM2進(jìn)行蛋白印跡分析在各種前列腺癌細(xì)胞系中檢測到較少的糖蛋白帶(88千道爾頓、98千道爾頓、130千道爾頓)(見圖5A及其

)。在雄激素依賴LNCap細(xì)胞和非雄激素依賴PC3細(xì)胞中都發(fā)現(xiàn)了所述RM2-反應(yīng)性糖蛋白。將定向在所述前列腺癌細(xì)胞系中表達(dá)的非RM2表位的RM2和其它單克隆抗體結(jié)合，將有助于建立高效的具有雙重單克隆抗體化驗(yàn)的三明治法。
基于電噴射離子化作用和基質(zhì)輔助激光解吸/離子化作用質(zhì)譜的顯著進(jìn)步，所述方法已經(jīng)被應(yīng)用于對患有特定癌癥的病人血清中腫瘤相關(guān)糖蛋白的分析，例如Johnson PJ等人，″Structures of disease-specific serumalpha-fetoprotein isoforms″，Br.J.Cancer 83(10)1330-1337，2000；Poon TC等人，″Comprehensive proteomic profiling...of hepatocellular carcinoma and itssubtypes″，Clin.Chem.49(5)752-760，2003。順應(yīng)這種趨勢，表面增強(qiáng)激光解吸/離子化作用-飛行時間-質(zhì)譜(surface-enhanced laserdesorption/ionization-time of flight-mass spectrometry，SELDI-TOF-MS)用于鑒定糖蛋白抗原的特征(Merchant M，Weinberger SR，″Recent advancements insurface-enhanced laser desorption/ionization-time of flight-mass spectrometry″，Electrophoresis 211164-1167，2000)。事實(shí)上，病人血清中的RM2糖蛋白可以被附著在凝膠上的抗體所捕獲，然后洗脫被吸附的抗原，并用ESI-MS、MALDI-MS或SELDI-TOF-MS分析。
表面胞質(zhì)基因共振光譜高度靈敏并且能檢測弱的相互作用(Matsuura K等人，″A quantitative estimation of carbohydrate-carbohydrate interaction...bysurface plasmon resonance″，J.Am.Chem.Soc.122(30)7406-7407，2000；Hemaiz MJ等人，″A model system mimicking glycosphingolipid clusters toquantify carbohydrate self-interactions by surface plasmon resonance″，Angew.Chem.Intl.Ed.41(9)1554-1557，2002)。這是一種通過結(jié)合附著在表面胞質(zhì)基因?qū)由系目贵w來測定病人血清中的抗原的很有前景的方法，例如用附著在金膜(gold film)(″自裝配單層(self-assembled monolayer)″，SAM)上的RM2抗體的抗原結(jié)合片段(Fab)衍生物來檢測病人血清中存在的抗原。
在優(yōu)選方法中，樣本與特異性結(jié)合RM2抗原的部分接觸，然后通過檢測該部分與RM2抗原的特異性結(jié)合，檢測該抗原的存在。與RM2抗原特異性反應(yīng)的部分的例子為特異性結(jié)合RM2抗原的抗體。
在本發(fā)明的上下文中，抗體可以理解為包括多克隆抗體和單克隆抗體、單鏈抗體、抗體片段(如抗體可變片段(Fv)、抗原結(jié)合片段(Fab)和胃蛋白酶消化后的抗體片段(F(ab′)2)、嵌合抗體、表面重建抗體(resurfacedantibody)和人源化抗體。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠從多種溫血動物，例如馬、牛、各種家禽、兔、小鼠、倉鼠或大鼠，很容易地制備抗RM2抗原的多克隆抗體。例如能用引起哺乳動物抗體應(yīng)答的免疫原形式的RM2抗原免疫哺乳動物(如小鼠、倉鼠或兔)?？梢酝ㄟ^檢測血漿或血清中的抗體滴度監(jiān)測免疫作用的進(jìn)展。免疫后可以得到抗血清，從所述抗血清中分離出多克隆抗體。
本發(fā)明的方法優(yōu)選使用單克隆抗體。特異性結(jié)合RM2抗原的單克隆抗體可以用常規(guī)的技術(shù)很容易地制得。例如，可以通過由Kohler和Milstein1975年首創(chuàng)的雜交瘤技術(shù)(Nature 256，495-497)制備單克隆抗體；還參見US RE32011、US 4902614、US 4543439和US 4411993，這些文件的全部內(nèi)容在此并入作為參考；還參見Monoclonal Antibodies，HybridomasA New Dimensionin Biological Analyses，Plenum Press，Kennett，McKeam和Bechtol(eds.)，1980以及AntibodiesA Laboratory Manual，Harlow and Lane(eds.)，Cold SpringHarbor Laboratory Press，1988。其他技術(shù)也可以用于構(gòu)建單克隆抗體(例如，見William D.Huse等人，1989，″Generation of a Large Combinational Library ofthe Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda，″Science 2461275-1281；L.Sastry等人，1989″Cloning of the Immunological Repertoire in Escherichia colifor Generation of Monoclonal Catalytic AntibodiesConstruction of a HeavyChain Variable Region-Specific cDNA Library，″Proc Natl.Acad.Sci.USA865728-5732；Kozbor等人，1983 Immunol.Today 4，72 re the human B-cellhybridoma technique；Cole等人，1985 Monoclonal Antibodies in Cancer Therapy，Allen R.Bliss，Inc.，pages 77-96 re the EBV-hybridoma technique to producehuman monoclonal antibodies；并還參見Michelle Alting-Mees等人，1990″Monoclonal Antibody Expression LibrariesA Rapid Alternative toHybridomas，″Strategies in Molecular Biology 31-9)。免疫化學(xué)篩選雜交瘤細(xì)胞以產(chǎn)生與RM2抗原特異性反應(yīng)的抗體，單克隆抗體得以分離。
在此使用的術(shù)語“抗體”意指包括與RM2抗原特異性反應(yīng)的抗體片段?？贵w可以用常規(guī)技術(shù)片段化并用與上述完整抗體同樣方法篩選有用的片段。例如，F(xiàn)(ab′)2片段可以通過用胃蛋白酶(pepsin)處理抗體產(chǎn)生?？梢蕴幚淼玫降腇(ab′)2片段，還原二硫鍵以制備Fab′片段。
單鏈抗體可以通過用聯(lián)結(jié)子(linker)連接可變重鏈和可變輕鏈而制備(參見例如Huston等人，1988 Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，85，5879-5883和Bird等人，1988 Science，242，423-426這兩篇文件的全部內(nèi)容在此并入作為參考)。
本發(fā)明還考慮到了嵌合抗體衍生物，即結(jié)合了非人類動物的可變區(qū)和人類恒定區(qū)的抗體分子。嵌合抗體分子可以包括，例如，結(jié)合來源于小鼠、大鼠或其它種的抗體的結(jié)構(gòu)域和人類恒定區(qū)的抗原。制備嵌合抗體的各種方法已經(jīng)得到描述，并且能用于制備包括免疫球蛋白可變區(qū)的嵌合抗體，所述免疫球蛋白可變區(qū)能夠識別分化細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞表面的挑選的抗原。參見例如，Morrison等人，1985；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81，6851；Takeda等人，1985，Nature 314，452；Cabilly等人，US 4816567；Boss等人，US 4816397；Tanaguchi等人，歐洲專利公開EP 171496；歐洲專利公開EP 0173494、英國專利GB 2177096B。
本發(fā)明還考慮了表面重建單克隆抗體的應(yīng)用。文獻(xiàn)例如參見US5639641中清楚地描述了表面重建抗體的方法，所述文獻(xiàn)的全部內(nèi)容在此并入作為參考。
人源化抗體也可以用于本發(fā)明的方法。人源化抗體的方法為本領(lǐng)域公知，在文獻(xiàn)中得以描述，例如，Padlan，E.等人，1991 Molecular Immunology，vol.28，pp.489-498、美國專利公開20020034765 A1以及美國專利公開2004/0058414 A1。
因此，用于本發(fā)明方法的適合的抗體包括多克隆抗體、單鏈多克隆抗體、多克隆抗體片段、單克隆抗體、單鏈單克隆抗體、單克隆抗體片段、嵌合抗體、單鏈嵌合抗體、嵌合抗體片段、表面重建抗體、表面重建單鏈抗體、表面重建抗體片段、人源化抗體、人源化單鏈抗體和人源化抗體片段。
特別優(yōu)選用于本發(fā)明的是RM2單克隆抗體及其片段。在Saito，S.，Levery，S.B.，Salyan，M.E.K.，Goldberg，R.I.和Hakomori，S.1994 J.Biol.Chem.269，5644-5652中描述了單克隆抗體RM2及其制備方法，該文獻(xiàn)的全部內(nèi)容在此并入作為參考。
檢測抗體和RM2抗原的特異性結(jié)合的方法已為本領(lǐng)域公知，包括免疫組織學(xué)；十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后蛋白印跡分析；定向到結(jié)合所述抗原的初級抗體的標(biāo)記次級抗體；表面等離子體共振(SPR)光譜和分子力顯微法。
E、用于診斷前列腺癌的試劑盒本發(fā)明還提供了一種用于診斷前列腺癌的試劑盒，該試劑盒包括(a)至少一個特異性結(jié)合RM2抗原的部分，所述RM2抗原具有以下所示的表位結(jié)構(gòu)，取自從懷疑患有前列腺癌的病人中獲得的樣本 其中，R表示載體，(b)用所述試劑盒診斷前列腺癌的說明書，以及(c)選擇性地包括的通過所述部分與所述抗原的特異性結(jié)合檢測所述抗原的存在的裝置。
適合的載體如上所述。
適合的特異性結(jié)合RM2抗原的部分(moiety)可以為任何用于診斷方法的所述的部分。
說明書包括適于診斷化驗(yàn)的樣本類型，例如用于診斷方法的上述樣本類型。
F、物質(zhì)組合物本發(fā)明還提供了一種分離的或純化的含有RM2抗原的前列腺組織樣本。所述組織樣本通過用本領(lǐng)域公知的方法分離和/或純化。在Hakomori S和Kannagi R，″Carbohydrate antigens in higher animals″，inHandbook of Experimental Immunology；Vol.1Immunochemistry(Weir DM，Herzenberg LA，Blackwell C，Herzenberg LA，eds.)，4th ed.，Blackwell ScientificPublications(Oxford；Boston)，chap.9(pp.9.1-9.39)中總結(jié)了鞘糖脂和糖蛋白的分離方法。如上述所指出的，所述抗原為糖蛋白(相對分子質(zhì)量(Mr)為50千道爾頓)。這很重要，因?yàn)樵S多病例中，與糖蛋白抗原相比，鞘糖脂抗原并不以高水平釋放。
通過本領(lǐng)域公知的方法，不論純化的、分離的或未分離純化的組織樣品都能用于制備特異性結(jié)合RM2抗原的單克隆抗體。參見例如Saito，S.，Levery，S.B.，Salyan，M.E.K.，Goldberg，R.I.和Hakomori，S.1994 J.Biol.Chem.269，5644-5652，該文獻(xiàn)的全部內(nèi)容在此并入作為參考。
在此所有出版物和專利申請?jiān)谙嗤潭壬喜⑷胱鳛閰⒖?，相?dāng)于每篇單獨(dú)的出版物和專利申請是特別并且單獨(dú)指明需要并入作為參考的。雖然為了清楚和理解的目的，通過附圖和實(shí)施例在一定程度上詳細(xì)描述了本發(fā)明，很顯然一定的改變和變化都包含在本發(fā)明權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種診斷前列腺癌的方法，該方法包括在從懷疑患有前列腺癌的病人取得的樣本中，檢測具有以下所示的表位結(jié)構(gòu)的RM2抗原的存在或水平升高 其中，R表示載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述方法還包括將所述樣本與至少一種特異性結(jié)合所述RM2抗原的抗體接觸，并通過抗體與抗原的特異性結(jié)合檢測所述抗原的存在。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述至少一種抗體選自由多克隆抗體、單鏈多克隆抗體、多克隆抗體片段、單克隆抗體、單鏈單克隆抗體、單克隆抗體片段、嵌合抗體、單鏈嵌合抗體、嵌合抗體片段、表面重建抗體、表面重建單鏈抗體、表面重建抗體片段、人源化抗體、人源化單鏈抗體和人源化抗體片段所組成的組中。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述至少一種抗體為單克隆抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述至少一種抗體定向到由RM2單克隆抗體識別的表位。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述樣本為前列腺活組織檢查樣本。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述樣本為從全前列腺切除術(shù)中獲得的樣本。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述樣本為血清樣本。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，通過免疫組織學(xué)；十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后蛋白印跡分析；定向到結(jié)合所述抗原的初級抗體的標(biāo)記次級抗體；表面等離子體共振光譜法；或分子力顯微法檢測所述抗原的存在。
10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述樣本為前列腺活組織檢查樣本，通過免疫組織學(xué)、定向到結(jié)合所述抗原的初級抗體的標(biāo)記次級抗體、表面等離子體共振光譜法或分子力顯微法檢測所述抗原的存在。
11.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述樣本為從全前列腺切除術(shù)中獲得的樣本，通過免疫組織學(xué)、定向到結(jié)合所述抗原的初級抗體的標(biāo)記次級抗體、表面等離子體共振光譜法或分子力顯微法檢測所述抗原的存在。
12.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述樣本為血清樣本，通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳、然后蛋白印跡分析檢測所述抗原的存在。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述至少一種抗體定向到由RM2單克隆抗體識別的表位。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述至少一種抗體定向到由RM2單克隆抗體識別的表位。
15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述至少一種抗體定向到由RM2單克隆抗體識別的表位。
16.一種用于診斷前列腺癌的試劑盒，該試劑盒包括(a)至少一個特異性結(jié)合RM2抗原的部分，所述RM2抗原具有以下所示的表位結(jié)構(gòu)并來自從懷疑患有前列腺癌的病人中獲得的樣本 其中，R表示載體，(b)用所述試劑盒診斷前列腺癌的說明書，以及(c)選擇性地包括的通過所述部分與所述抗原的特異性結(jié)合檢測所述抗原的存在的裝置。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的試劑盒，其中，特異性結(jié)合所述RM2抗原的部分為抗體。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的試劑盒，其中，所述抗體選自由多克隆抗體、單鏈多克隆抗體、多克隆抗體片段、單克隆抗體、單鏈單克隆抗體、單克隆抗體片段、嵌合抗體、單鏈嵌合抗體、嵌合抗體片段、表面重建抗體、表面重建單鏈抗體、表面重建抗體片段、人源化抗體、人源化單鏈抗體和人源化抗體片段所組成的組中。
19.根據(jù)權(quán)利要求16所述的試劑盒，其中，所述特異性結(jié)合所述RM2抗原的部分為抗體。
20.根據(jù)權(quán)利要求16所述的試劑盒，其中，所述特異性結(jié)合所述RM2抗原的部分為單克隆抗體。
21.根據(jù)權(quán)利要求16所述的試劑盒，其中，所述特異性結(jié)合所述RM2抗體的部分定向到由RM2單克隆抗體識別的表位。
22.根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的試劑盒，其中，所述樣本為前列腺活組織檢查樣本。
23.根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的試劑盒，其中，所述樣本為從全前列腺切除術(shù)中獲得的樣本。
24.根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的試劑盒，其中，所述樣本為血清樣本。
25.根據(jù)權(quán)利要求16所述的試劑盒，其中，通過免疫組織學(xué)；十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后蛋白印跡分析；定向到結(jié)合所述抗原的初級抗體的標(biāo)記次級抗體；表面等離子體共振光譜法；或分子力顯微法檢測所述抗原的存在。
26.根據(jù)權(quán)利要求17所述的試劑盒，其中，所述樣本為前列腺活組織檢查樣本，通過免疫組織學(xué)、定向到結(jié)合所述抗原的初級抗體的標(biāo)記次級抗體、表面等離子體共振光譜法或分子力顯微法檢測所述抗原的存在。
27.根據(jù)權(quán)利要求17所述的試劑盒，其中，所述樣本為從全前列腺切除術(shù)中獲得的樣本，通過免疫組織學(xué)、定向到結(jié)合所述抗原的初級抗體的標(biāo)記次級抗體、表面等離子體共振光譜法或分子力顯微法檢測所述抗原的存在。
28.根據(jù)權(quán)利要求17所述的試劑盒，其中，所述樣本為血清樣本，通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后蛋白印跡分析檢測所述抗原的存在。
29.根據(jù)權(quán)利要求17所述的試劑盒，其中，所述樣本為來自機(jī)體分泌物的樣本，通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳、然后蛋白印跡分析檢測所述抗原的存在。
30.根據(jù)權(quán)利要求26所述的試劑盒，其中，所述至少一種抗體定向到由RM2單克隆抗體識別的表位。
31.根據(jù)權(quán)利要求27所述的試劑盒，其中，所述至少一種抗體定向到由RM2單克隆抗體識別的表位。
32.根據(jù)權(quán)利要求28所述的試劑盒，其中，所述至少一種抗體定向到由RM2單克隆抗體識別的表位。
33.一種分離的前列腺組織樣本，該樣本包括RM2抗原。
全文摘要
一種由單克隆抗體RM2定義的新型糖類抗原β1，4－GalNAc－disialyl－Lc
文檔編號G01N33/574GK1997896SQ200580010431
公開日2007年7月11日 申請日期2005年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月30日
發(fā)明者箱守仙一郎, 齋藤清一 申請人:北海道科學(xué)技術(shù)振興財(cái)團(tuán)