專利名稱：一種癌抗原ca15-3的納米磁微?；瘜W發(fā)光測定試劑盒及其制備方法和檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種結(jié)合了免疫磁微粒分離技術(shù)和化學發(fā)光免疫分析技術(shù)的癌抗原CA15-3的納米磁微?；瘜W發(fā)光測定試劑盒及其制備方法和檢測方法。
背景技術(shù)：
癌抗原CA15-3(Carbohydrate Antigen 15-3, CA15-3)是一種多形態(tài)上皮糖蛋白，分子量約為400kD，分子結(jié)構(gòu)尚不完全清楚。CA15-3是1984年由Hilkens等從人乳脂肪球膜上糖蛋白MAM-6制成的單克隆抗體(115-DB),與此同時Kufu等自肝轉(zhuǎn)移乳腺癌細胞膜制成單克隆抗體(DF-3)，兩者合起來故被命名CA15-3。CA15-3主要用于乳腺癌的監(jiān)測和篩選，以及用于評價患者預后情況的指標。乳腺癌患者30-50%CA15-3含量增高，有轉(zhuǎn)移灶者增高可達80% ;發(fā)現(xiàn)癌轉(zhuǎn)移的敏感性比癌胚抗原和組織多肽抗原高，且早于臨床發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移；CA15-3是監(jiān)測病人術(shù)后復發(fā)情況，特別是癌癥轉(zhuǎn)移患者的術(shù)后監(jiān)測的重要指標，血清CA15-3水平增高，提示乳腺癌的局部或全身復發(fā)，且增高早于核素檢查和臨床檢查；用于對治療的隨查評估及早期發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶，CA15-3的增高比臨床診斷出轉(zhuǎn)移灶要早幾個月時間；CA15-3可與CA125聯(lián)合檢查，用于卵巢癌復發(fā)的早期診斷；與CEA聯(lián)合檢測時，可提高乳腺癌早期診斷的敏感性和特異性；其他惡性腫瘤，如肺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、肝癌等，也可出現(xiàn)血清CA15-3增高。非惡性腫瘤疾病，如良性乳腺疾病、卵巢疾病等可引起CA15-3的水平增高。目前用于檢測CA15-3的免疫分析方法主要有酶聯(lián)免疫分析法、化學發(fā)光免疫分析法等。酶聯(lián)免疫分析法存在靈敏度低，線性范圍窄、不易實現(xiàn)全自動化等方法學限制因素?；瘜W發(fā)光免疫分析法是在酶聯(lián)免疫分析法基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種免疫檢測技術(shù)，具有靈敏度高、檢測線性范圍寬、操作簡便，自動化程度高等優(yōu)勢。目前化學發(fā)光免疫分析技術(shù)因其具有上述諸多優(yōu)點得到了廣泛的應(yīng)用。然而，在實際的免疫檢測中，由于待測樣品中所含的雜質(zhì)成分較多，一定程度上影響了檢測靈敏度和準確性，所以從復雜的樣品基質(zhì)中快速分離、純化出目的待測物，是臨床檢驗工作者面臨的難題之一。磁微粒免疫檢測技術(shù)是利用高分子材料合成一定粒度大小的磁性固相微粒作載體，以物理吸附、化學偶聯(lián)等方法包被上具有特異性親和力的抗體或抗原等各種免疫活性物質(zhì)，具有分離速度快、效率高、可重復性好、操作簡單、不影響被分離細胞或其他生物材料的生物學性狀和功能等特點，在外加磁場作用下可定向運動，使得某些特殊成分得以分離、濃集或純化。中國發(fā)明專利公開CN102288766A公開了一種了糖類抗原15_3(CA15_3)的定量檢測試劑盒，該試劑盒包括含有標記有抗CA15-3單克隆抗體的磁性微球的CA15-3磁分離試齊U，含有堿性磷酸酶標記的抗CA15-3單克隆抗體的酶反應(yīng)物，反應(yīng)增強液，稀釋液，CA 15-3標準品，CA15-3質(zhì)控品，清洗濃縮液以及底物溶液。該試劑盒雖然能夠?qū)崿F(xiàn)快速、準確地檢測，但是其中，含有標記有抗CA15-3單克隆抗體的磁性微球的CA15-3磁分離試劑和含有堿性磷酸酶標記的抗CA15-3單克隆抗體的酶反應(yīng)物的制備過程非常繁瑣，工藝穩(wěn)定性不好，且標記率低，限制其檢測效果特別是精密度和導致成本增加。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種癌抗原CA15-3的納米磁微粒化學發(fā)光測定試劑盒，其能夠以較低的成本制備得到，且能夠?qū)崿F(xiàn)癌抗原CA15-3準確和高精確地定量測定。本發(fā)明同時還提供一種癌抗原CA15-3的納米磁微?；瘜W發(fā)光測定試劑盒的制備方法，該方法工藝穩(wěn)定，成本低，且所得試劑盒的精密度高。癌抗原所用的試劑盒的簡便和低成本的制備方法。一種癌抗原CA15-3的納米磁微?；瘜W發(fā)光測定試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括 第一試劑含突光素標記的癌抗原CA15-3抗體的溶液；第二試劑含堿性磷酸酶(ALP)標記的癌抗原CA15-3抗體的溶液；磁分離劑含包被著熒光素抗體的磁微粒的懸浮液；其中，該堿性磷酸酶標記的癌抗原CA15-3抗體由堿性磷酸酶與癌抗原CA15-3抗體通過交聯(lián)劑4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己燒-1-羧酸琥拍酰亞胺酯(Succinimidyl4-(N-Maleimidomethyl)Cyclohexane-l-Carbo, SMCC)和 2_ 亞氨基硫燒鹽酸鹽(2-1minothiolane HCl, 2-1T)連接構(gòu)成。進一步地，所述磁微粒試劑中，包被有熒光素抗體的磁微粒由熒光素抗體與磁微粒通過偶聯(lián)劑相化學偶聯(lián)。進一步地，所述第一試劑中的熒光素標記的癌抗原CA15-3抗體的濃度為O. 5 lyg/mL，所述第一試劑的pH為7-9 ;所述第二試劑中的堿性磷酸酶標記的癌抗原CA 15-3抗體的濃度為O. 5^1 μ g/mL，所述第二試劑的pH為7_9。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知曉，本發(fā)明的試劑盒還可以進一步包括有其它檢測所需的試齊U，例如底物溶液。但是諸如底物溶液等其它試劑可以另行購買或配制，因此，雖然試劑盒中可以包括這些試劑，但它們對于本發(fā)明試劑盒來說并非必不可少。本發(fā)明采取的又一技術(shù)方案是一種癌抗原CA15-3的納米磁微?；瘜W發(fā)光測定試劑盒的制備方法，其包括分別制備所述第一試劑、所述第二試劑以及磁分離劑的步驟，其中所述第二試劑的制備過程如下①將癌抗原CA15-3抗體加入交聯(lián)劑2-亞氨基硫烷鹽酸鹽溶液中室溫靜置后，再加入甘氨酸溶液，再次室溫靜置，收集活化后的癌抗原CA15-3抗體，于2l°C下保存?zhèn)溆茫?br> ②將堿性磷酸酶溶液加入交聯(lián)劑4- (N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯溶液，室溫靜置，收集活化后的堿性磷酸酶，于疒8°C下保存?zhèn)溆?；③將上述步驟①所得活化后的癌抗原CA15-3抗體與步驟②所得活化后的堿性磷酸酶混合，靜置反應(yīng)，使生成堿性磷酸酶標記的癌抗原CA15-3抗體，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液用Supperdex200凝膠純化柱純化,選擇具有適當pH值的緩沖液調(diào)整濃度和pH值即得所述第二試劑；其中，所述的癌抗原CA15-3抗體、所述堿性磷酸酶的純度均大于等于95wt%，且所述堿性磷酸酶的比活性超過1000u/mg。優(yōu)選地，步驟①中，取癌抗原CA15-3抗體，加入偶聯(lián)劑2_IT溶液溶解，室溫靜置10mirT30min，加入甘氨酸溶液，室溫靜置2 10min，用G-25凝膠純化柱除鹽，收集活化后的癌抗原CA15-3抗體，于2-8°C保存?zhèn)溆?。?yōu)選地，步驟②中，取濃度大于等于5mg/mL的堿性磷酸酶溶液，加入用SMCC溶液，室溫靜置2(T40min，用G-25凝膠柱除鹽，收集活化后堿性磷酸酶，于2_8°C保存?zhèn)溆?。?yōu)選地，步驟③中，將上述活化的癌抗原CA15-3抗體與活化的堿性磷酸酶按分子摩爾比為1:1 I 2混合，于2-8°C條件下靜置12-24h。其中適當pH值的緩沖液可以為例如含有O. 5%牛血清白蛋白、pH8. O的TRIS緩沖液。進一步地，所述的第一試劑的制備方法如下配制含有熒光素的pH為擴10的緩沖液，然后按照熒光素與癌抗原CA15-3抗體的分子比為2(Γ200:1的比例,將所述含有熒光素的PH為9 10的緩沖液與癌抗原CA15-3抗體的pH為9 10的緩沖液混合，混勻后，室溫靜置反應(yīng)，然后將反應(yīng)液通過G-25凝膠柱進行分離，除去游離的熒光素，得到含有熒光素標記的抗癌抗原CA15-3抗體的溶液，接著用具有適當pH值的緩沖液調(diào)整濃度和pH，即得。其中適當PH值的緩沖液可以為例如含有O. 5%牛血清白蛋白、pH8. O的TRIS緩沖液。進一步地，所述磁分離劑的制備方法如下將含有羧基活性基團的磁微粒與熒光素抗體在偶聯(lián)劑碳二亞胺的 存在下，室溫反應(yīng)2 18小時，反應(yīng)結(jié)束，磁分離，去上清，用具有適當PH值的緩沖液調(diào)整pH和濃度，即得所述的磁分離劑。其中所述的磁微粒具有超順磁性，其直徑為O. 5^2 μ m,每克磁微粒上所帶的羧基活性基團的含量不低于O. 4mmol ;所述的熒光素抗體為單克隆抗體或多克隆抗體，純度大于等于90wt%，稀釋效價大于1:100萬。優(yōu)選地，上述的具有適當pH值的緩沖液為含有O. 5%牛血清白蛋白、pH8. O的TRIS緩沖液。本發(fā)明所述的熒光素可以是已知的各種熒光素，常用的有例如異硫氰酸熒光素，四乙基羅丹明，四甲基異硫氰酸羅丹明等。本發(fā)明同時還提供了一種采用上述的試劑盒應(yīng)用于癌抗原CA15-3定量檢測的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟(I)免疫反應(yīng)在檢測管中加入待測樣本稀釋液，依次加入第一試劑和第二試劑，混勻，在25 40°C下進行第一次溫育，然后加入磁分離試劑，混勻，在25 40°C下進行第二次溫育；(2)洗滌使磁微粒在磁場中沉降，去除上清，加入清洗液，去除磁場，震蕩使磁微粒充分混懸，然后磁分離，去除上清；(3)加底物溶液檢測發(fā)光強度在檢測管中加入堿性磷酸酶催化的化學發(fā)光底物，去除磁場，充分混懸后檢測發(fā)光強度值。進一步地，所述第一次溫育的時間可以為2(T40min，通常為30min ;第二次溫育的時間可以為2 15min,通常為lOmin。由于以上技術(shù)方案的實施，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點
1.采用本發(fā)明的試劑盒可以實現(xiàn)癌抗原CA15-3準確、精密的檢測，其三種試劑均可以通過穩(wěn)定的制備工藝制備得到，生產(chǎn)成本低，且由于制備工藝的穩(wěn)定性，試劑盒分析批間差異小，檢測的分析間精密度提高；2.本發(fā)明的試劑盒中的含有堿性磷酸酶標記的癌抗原CA15-3抗體的溶液的制備方法，能夠有效將癌抗原CA15-3抗體與堿性磷酸酶偶聯(lián)，偶聯(lián)效率高，進一步降低試劑盒的成本低和確保試劑盒的檢測效果；3.采取本發(fā)明的試劑盒進行檢測，準確度好，精密度高，靈敏度高，檢測范圍寬，樣品無需預稀釋，操作簡單省時，與采用進口試劑盒進行檢測的方法相比，本發(fā)明的檢測方法在成本上具有顯著的優(yōu)勢。


圖1為測試校準品標準曲線；圖2為靈敏度評價擬合曲線；圖3為血清樣本檢測結(jié)果相關(guān)性(其中橫坐標X為實施例4制備得的試劑盒樣本測值，濃度單位為U/mL，縱坐標y為ROCHE公司試劑盒樣本測值，濃度單位為U/mL)。
具體實施例方式實施例1第一試劑的制備(I)材料與儀器以磷酸鹽緩沖液保存的癌抗原CA15-3 (CA15-3)單克隆抗體(純度超過95wt%，濃度為2mg/mL);異硫氰酸熒光素(FITC)，碳酸鈉等試劑應(yīng)達到化學純；G_25凝膠純化柱采購自GE公司。

(2)制備步驟①用O.1 O. 2mol/L pH 9. (TlO. O的碳酸鹽緩沖液配制O. 5mg/mL的FITC溶液；②按照CA15-3抗體與FITC分子比為1:20的比例在抗體溶液中加入步驟①所配FITC溶液，混合均勻，室溫靜置12h小時，反應(yīng)生成CA15-3抗體-FITC連接物；③將經(jīng)過步驟②的反應(yīng)液通過G-25凝膠柱進行分離，除去未反應(yīng)的FITC，得到含有CA15-3抗體-FITC連接物(即FITC標記的CA15-3抗體)的溶液；④將步驟③所得含有CA15-3抗體-FITC連接物的溶液用含O. 5%牛血清白蛋白(BSA) pH 8. O的O. lmol/L的TRIS緩沖液稀釋到CA15-3抗體-FITC連接物濃度為O. 5^1 μ g/mL,即為第一試劑。實施例2第二試劑的制備(I)材料與儀器以磷酸鹽緩沖液保存的CA15-3單克隆抗體(純度超過95wt%，濃度為2mg/mL);以磷酸緩沖液保存的堿性磷酸酶(ALP溶液，ALP純度為約99%，比活性為約1500U/mg，濃度為10mg/mL);交聯(lián)劑SMCC, 2-1T購自THERMO公司，TRIS等化學試劑應(yīng)達到化學純；G-25凝膠純化柱為GE公司產(chǎn)品。(2)制備步驟①取Img CA 15-3抗體，加入10mg/mL的偶聯(lián)劑2-1T溶液2-4 μ L，室溫靜置20min，加入O. lmol/L的甘氨酸溶液10 μ L，室溫靜置5min，用G-25凝膠柱除鹽，收集活化后CA 15-3抗體，2-8°C保存?zhèn)溆茫?br> ②取1. 5mg的ALP溶液，加入5mg/mL的SMCC溶液10-20 μ L，室溫靜置30min，用G-25凝膠柱除鹽，收集活化后ALP，2-8°C保存?zhèn)溆?；③將上述活化的癌抗原CA15-3抗體與活化的ALP混合，2_8°C條件下靜置12_24h，用Supperdex200凝膠純化柱純化偶聯(lián)物，獲得CA15-3抗體-ALP連接物濃溶液，2_8°C保存?zhèn)溆谩＂軐A15-3抗體-ALP連接物濃溶液用含O. 5%牛血清白蛋白(BSA) pH8. O的O. lmol/L的TRIS緩沖液稀釋到O. 5-1 μ g/mL，完成第二試劑的制備。實施例3磁分離試劑的制備(I)材料與儀器磁微粒的懸浮液磁微粒含量5wt%，磁微粒含羧基(COOH)活性集團，每克(g)磁微粒(干重)羧基含量不低于O. 4毫摩爾(mmol)，具有超順磁性，直徑在O. 5_2μπι之間?？笷ITC抗體可以是多克隆抗體，也可以是單克隆抗體，純度為90wt%以上，稀釋效價超過1:100萬；2-嗎啉乙磺酸(MES)、碳二亞胺(EDC)、TRI S和其他試劑應(yīng)達到化學純。(2)制備步驟①取IOOmg磁微粒的懸浮液，磁分離去上清，用O. 05mol/L, pH 4. 5 5MES緩沖液IOmL重懸；②加入2 4mg的抗FITC抗體,室溫混懸30 60min ；③加入O. 5 ImL新鮮配制的10mg/mL的EDC水溶液，室溫混懸2 12h ；④磁分離，去上清，用含O. 5%牛血清白蛋白(BSA) pH 8. O的O. lmol/L的TRIS緩沖液重懸到lmg/mL, pH 8. O,即為磁分離試劑。實施例4癌抗原CA15-3的納米磁微?；瘜W發(fā)光測定試劑盒該試劑盒包括按照實施例1方法制備的第一試劑(濃度為O. 75 μ g/mL), 50mL ；按照實施例2方法制備的第二試劑(濃度為O. 75 μ g/mL), 50mL ；按照實施例3方法制備的磁分離試劑50mL。實施例5癌抗原CA15-3的納米磁微粒化學發(fā)光測定試劑盒該試劑盒包括按照實施例1方法制備的第一試劑(濃度為O. 5 μ g/mL), 50mL ；按照實施例2方法制備的第二試劑(濃度為O. 5 μ g/mL), 50mL ；按照實施例3方法制備的磁分離試劑50mL。實施例6癌抗原CA15-3的納米磁微?；瘜W發(fā)光測定試劑盒該試劑盒包括按照實施例1方法制備的第一 試劑(濃度為I μ g/mL), 50mL ；按照實施例2方法制備的第二試劑(濃度為I μ g/mL), 50mL ；按照實施例3方法制備的磁分離試劑50mL。實施例7采取實施例4的試劑盒進行癌抗原CA15-3的定量檢測(I)檢測步驟①免疫反應(yīng)在檢測管中加入10 μ L待測樣本(血清或血漿)稀釋液，然后加入50 μ L第一試劑,50 μ L第二試劑，混勻，37± I °C條件下溫育30min ;加入50 μ L磁分離試齊IJ，混勻，37 ± I °C條件下溫育IOmin ；②洗滌使磁微粒在磁場中沉降，去除上清，加入300 μ L的清洗液，去除磁場，震蕩使磁微粒充分混懸，然后磁分離，去除上清；此步驟重復3次；③加底物溶液檢測發(fā)光強度在檢測管中加入100 μ L堿性磷酸酶化學發(fā)光底物溶液(北京阿匹斯生物技術(shù)有限公司APCL-1 )，震蕩使磁微粒充分混懸，在5min內(nèi)檢測發(fā)光強度。(2)繪制校準品標準曲線校準品標準曲線參見圖1。(3)靈敏度評價檢測“O”濃度樣本，重復檢測20次，計算相對發(fā)光強度(RLU)的平均值(M)和標準差(SD)，并計算M+2SD值，根據(jù)零濃度校準品和相鄰校準品之間的濃度-RLU進行兩點回歸擬合得出一次方程，將M+2SD值帶入上述方程中，求出對應(yīng)的濃度值，即為最低檢測限。本方法的靈敏度不大于lU/mL。其中A點發(fā)光值分別參見表1:表I
權(quán)利要求
1.一種癌抗原CA15-3的納米磁微?；瘜W發(fā)光測定試劑盒，所述試劑盒包括第一試劑含突光素標記的癌抗原CA15-3抗體的溶液；第二試劑含堿性磷酸酶標記的癌抗原CA15-3抗體的溶液；磁分離劑含包被著熒光素抗體的磁微粒的懸浮液；其中，該堿性磷酸酶標記的癌抗原CA15-3抗體由堿性磷酸酶與癌抗原CA15-3抗體通過交聯(lián)劑4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯和2-亞氨基硫烷鹽酸鹽連接構(gòu)成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的癌抗原CA15-3的納米磁微?；瘜W發(fā)光測定試劑盒，其特征在于所述磁分離試劑中，熒光素抗體與磁微粒之間相化學偶聯(lián)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的癌抗原CA15-3的納米磁微粒化學發(fā)光測定試劑盒，其特征在于所述第一試劑中的熒光素標記的癌抗原CA15-3抗體的濃度為O. 5^1 μ g/mL，所述第一試劑的pH為7-9 ;所述第二試劑中的堿性磷酸酶標記的癌抗原CA15-3抗體的濃度為O.5^1 μ g/mL，所述第二試劑的pH為7-9。
4.一種如權(quán)利要求3所述的癌抗原CA15-3的納米磁微?；瘜W發(fā)光測定試劑盒的制備方法，其包括分別制備所述含有熒光素標記的癌抗原抗體的溶液、所述含有堿性磷酸酶標記的癌抗原CA15-3抗體的溶液以及所述包被有熒光素抗體的磁微粒的懸浮液的步驟，其特征在于所述含有堿性磷酸酶標記的癌抗原CA15-3抗體的溶液的制備過程如下①將癌抗原CA15-3抗體加入交聯(lián)劑2-亞氨基硫烷鹽酸鹽溶液中室溫靜置后，再加入甘氨酸溶液，再次室溫靜置，收集活化后的癌抗原CA15-3抗體，于2l°C下保存?zhèn)溆?；②將堿性磷酸酶溶液加入交聯(lián)劑4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯溶液，室溫靜置，收集活化后的堿性磷酸酶，于2l°C下保存?zhèn)溆?；③將上述步驟①所得活化后的癌抗原CA15-3抗體與步驟②所得活化后的堿性磷酸酶混合，靜置反應(yīng)，使生成堿性磷酸酶標記的癌抗原CA15-3抗體，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液用Supperdex200凝膠純化柱純化,選擇具有適當pH值的緩沖液調(diào)整濃度和pH值即得所述第二試劑；其中，所述的癌抗原CA15-3抗體、所述堿性磷酸酶的純度均大于等于95wt%，且所述堿性磷酸酶的比活性超過1000u/mg。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于步驟①中，取癌抗原CA15-3抗體，加入偶聯(lián)劑2-1T溶液溶解，室溫靜置10mirT30min，加入甘氨酸溶液，室溫靜置2 lOmin，用G-25凝膠純化柱除鹽，收集活化后的癌抗原CA15-3抗體，于2_8°C保存?zhèn)溆谩?br> 6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的制備方法，其特征在于步驟②中，取濃度大于等于5mg/mL的堿性磷酸酶溶液，加入4- (N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯溶液，室溫靜置2(T40min，用G-25凝膠柱除鹽，收集活化后堿性磷酸酶，于2_8°C保存?zhèn)溆谩?br> 7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述第一試劑的制備方法如下配制含有熒光素的pH為9 10的緩沖液,然后按照熒光素與抗癌抗原CA15-3抗體的分子比為20^200:1的比例，將所述含有熒光素的pH為擴10的緩沖液與抗癌抗原CA15-3抗體的pH為擴10的緩沖液混合，混勻后，室溫靜置反應(yīng)，然后將反應(yīng)液通過G-25凝膠柱進行分離，除去游離的熒光素，得到含有熒光素標記的抗癌抗原CA15-3抗體的溶液，接著用具有適當pH值的緩沖液調(diào)整濃度和PH，即得第一試劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述磁分離劑的制備方法如下使含有羧基活性基團的磁微粒與熒光素抗體在偶聯(lián)劑碳二亞胺的存在下，室溫反應(yīng)2 18小時，反應(yīng)結(jié)束，磁分離，去上清，用具有適當PH值的緩沖液調(diào)整pH和濃度，即得所述的磁分離劑；其中所述的磁微粒具有超順磁性，其直徑為O. 5 2 μ m，每克磁微粒上所帶的羧基活性基團的含量大于等于O. 4mmol ;所述的熒光素抗體為單克隆抗體或多克隆抗體，純度大于等于90wt%,稀釋效價大于1:100萬。
9.根據(jù)權(quán)利要求4或7或8所述的制備方法，其特征在于所述的具有適當pH值的緩沖液為含有O. 5%牛血清白蛋白、pH8. O的TRIS緩沖液。
10.采用權(quán)利要求Γ3中任一項權(quán)利要求所述的試劑盒用于對癌抗原CA15-3定量檢測的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟(1)免疫反應(yīng)在檢測管中加入待測樣本稀釋液，依次加入第一試劑和第二試劑，混勻，在25 4(TC下進行第一次溫育，然后加入磁分離試劑，混勻，在25 4(TC下進行第二次溫育；(2)洗滌使磁微粒在磁場中沉降，去除上清，加入清洗液，去除磁場，震蕩使磁微粒充分混懸，然后磁分離，去除上清；(3)加底物溶液檢測發(fā)光強度在檢測管中加入堿性磷酸酶催化的化學發(fā)光底物，去除磁場，充分混懸后檢測發(fā)光強度值。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種癌抗原CA15-3的納米磁微?；瘜W發(fā)光測定試劑盒及其制備方法和檢測方法，試劑盒包括含有熒光素標記的癌抗原CA15-3抗體的溶液、包被有熒光素抗體的磁微粒的懸浮液，以及含有堿性磷酸酶標記的癌抗原CA15-3抗體的溶液，該堿性磷酸酶標記的癌抗原CA15-3抗體由堿性磷酸酶與癌抗原CA15-3抗體通過交聯(lián)劑SMCC和2-IT連接構(gòu)成。本發(fā)明使得能夠以更低成本和更高準確度和精密度對癌抗原CA15-3進行定量檢測。
文檔編號G01N33/574GK103048461SQ20121055017
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月18日
發(fā)明者于大為, 程曉蕾, 趙文姬 申請人:蘇州浩歐博生物醫(yī)藥有限公司