專利名稱：用于單獨測定scca同形異構(gòu)體的免疫測定法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及單獨測定SCCA的各種同形異構(gòu)體，以及用不同的同形異構(gòu)體的血清學(xué)濃度和它們之間的比率作為診斷癌癥的一種方法。
背景技術(shù)：
鱗狀細胞癌抗原(SCCA)是子宮，子宮頸，肺部，頭頸部，陰門和食管的鱗狀細胞癌(SCC)的血清學(xué)標(biāo)記(1，2)。它最初在70年代末由Kato及其合作者從人類子宮頸的鱗狀細胞癌，分子量為42-48kDa的TA-4復(fù)合物中提純得到的(1，3)。TA-4復(fù)合物的電泳現(xiàn)象揭示了有10個以上的片斷，并且抗原等電位聚集暗示了有兩個亞片斷，一個酸性的(pI＜6.25)和一個中性的(pI≥6.25)同形異構(gòu)體(4)。
克隆SCCA的cDNA顯示，它屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑(serpins)一族(6)。進一步克隆染色體18q21.3上的基因區(qū)，顯示出兩個銜接排列的基因(7)。有較多端粒的一個，即原始的SCCA，叫做SCCA1；而有較多著絲粒的一個叫做SCCA2(圖1)。兩種都包含8個外顯子和假定的內(nèi)含子-外顯子界面，剪接部位，起始密碼子，以及相同的終止密碼子。它們有98％的核苷酸水平相同，有92％的氨基酸水平相同。SCCA1和SCCA2基因產(chǎn)物推導(dǎo)出的pI值顯示，中性的同形異構(gòu)體由SCCA1編碼，而酸性的同形異構(gòu)體由SCCA2編碼。
人類絲氨酸蛋白酶抑制劑圖譜對應(yīng)兩個染色體族之一。PI6，PI9和ELNAH2圖譜對應(yīng)6p25；而PI8，Bomapin，PAI2，SCCA1，SCCA2，Headpin和Maspin圖譜對應(yīng)18q21.3(圖1)(7-12)。人們認為通過兩個獨立染色體間的重復(fù)作用和幾輪染色體內(nèi)的重復(fù)作用，出現(xiàn)了這些族(9)。經(jīng)常有報道說染色體區(qū)18q是基因重排頻率很高的區(qū)域(9，13-16)。絲氨酸蛋白酶抑制劑的目標(biāo)和功能還沒有完全掌握。對大多數(shù)情況來說，其主要功能是調(diào)節(jié)與凝固作用，纖維蛋白溶解作用，編程性細胞死亡和炎癥相關(guān)的蛋白水解事件，而其它功能如運輸激素和調(diào)節(jié)血壓也曾經(jīng)報道過(17-24)。
盡管SCCA1和SCCA2幾乎相同，但它們的反應(yīng)活性部位環(huán)不同(圖2和3)。SCCA1抑制木瓜蛋白酶類的半胱氨酸蛋白酶組織蛋白酶S，K和L(25，26)，而SCCA2抑制胰凝乳蛋白酶類的絲氨酸蛋白酶組織蛋白酶G和肥大細胞類糜蛋白酶(27)。對SCCA1反應(yīng)活性部位環(huán)(RSL)的研究表明，反應(yīng)活性部位環(huán)(RSL)對于抑制半胱氨酸蛋白酶是必要的(28)。反應(yīng)活性部位環(huán)(RSL)的可變部分指明了由SCCA1和SCCA2交換突變體以及單個突變體的反應(yīng)活性部位環(huán)顯示出對目標(biāo)蛋白酶的專一性(28，29)。很可能絲氨酸蛋白酶抑制劑利用普通的基于反應(yīng)活性部位環(huán)(RSL)的機理來抑制絲氨酸和半胱氨酸蛋白酶。
對于SCCA1和SCCA2的生物學(xué)角色，人們還沒有完全了解。它們被認為是有抑制作用的絲氨酸蛋白酶抑制劑。資料顯示SCCA與編程性細胞死亡與表達有關(guān)，通過抑制編程性細胞死亡，使癌細胞抵抗各種致死機理(30)。
在正常的鱗狀上皮細胞的細胞質(zhì)里發(fā)現(xiàn)了SCCA1和SCCA2(31，33)。出現(xiàn)在病人血清中的抗原可能是由腫瘤細胞和它們的正常更新引起SCCA過度生產(chǎn)的作用(34)。已有報道，利用抗體放射免疫學(xué)測定或?qū)崟r-PCR，RT-PCR，在血清中發(fā)現(xiàn)的SCCA主要是SCCA2(1，35，36)；但利用PCR的其它研究表明兩種抗原都能在病人樣本中被放大并發(fā)現(xiàn)(37)。
患有SCC的病人的血清濃度與臨床階段和腫瘤的組織分化程度相關(guān)(1)。對于子宮頸癌，一些研究顯示了預(yù)處理值與臨床結(jié)果之間的關(guān)系(1，38-43)。研究還顯示了高的SCCA水平與腫瘤體積之間的關(guān)系。復(fù)發(fā)或病情加重能夠在出現(xiàn)臨床跡象前幾個月被發(fā)現(xiàn)(39)。在肺部，陰門，頭和頸部以及食道處的鱗狀細胞癌均可看到類似的結(jié)果(1，2，44，45)。在所有這些研究中，他們已測量出SCCA總量水平。
SCCA’s屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑家族，并且很可能在組織和循環(huán)中發(fā)現(xiàn)不同形式的絲氨酸蛋白酶抑制劑。絲氨酸蛋白酶抑制劑通常的功能是調(diào)節(jié)不同蛋白水解酶的活性，并且可以推測在組織和血清中的SCCA1和SCCA2也可以“游離的”絲氨酸蛋白酶抑制劑和與它們目標(biāo)蛋白酶結(jié)合形成的復(fù)合物存在。這類似于絲氨酸蛋白酶PSA，發(fā)現(xiàn)它在血清中主要是與絲氨酸蛋白酶抑制劑α1-抗胰凝乳蛋白酶的復(fù)合物。相對于“總量”SCCA，單獨測定SCCA1和SCCA2以及相應(yīng)絲氨酸蛋白酶抑制劑“游離的”和復(fù)合物形式也可以提供另外的臨床信息。
發(fā)明概述本發(fā)明公開了確立能分辨SCCA1和SCCA2以及分辨“游離的”和相應(yīng)絲氨酸蛋白酶抑制劑“總量”的單克隆抗體。另外，本發(fā)明描述了將確立的鑒別抗體用于實現(xiàn)測定SCCA1和SCCA2絲氨酸蛋白酶抑制劑的總量及“游離”形式的免疫測定法的意圖，以及將免疫測定法用于診斷癌癥并發(fā)現(xiàn)疾病復(fù)發(fā)。
詳細實施例分別確立對抗SCCA1和SCCA2抗原決定部位的單克隆抗體，以及暴露和隱藏在SCCA’s的絲氨酸蛋白酶復(fù)合物中的Pan SCCA，可能設(shè)計出用于測定SCCA相應(yīng)形式的特定免疫測定法。另外，本發(fā)明還公開了利用特定免疫測定法診斷癌癥的方法。
實施例1重組SCCA的制備1.1克隆SCCA利用快速制備微量mRNA純化試劑盒(QuickPrep Micro mRNA PurificationKit)(Pharmacia公司)制備來自細胞系Caski(子宮頸)，C-4I(子宮頸)，A549(肺部)和RPMI2650(咽部)的mRNAs，利用第一鏈cDNA合成試劑盒(First-Strand cDNA Synthesis Kit)(Pharmacia公司)制備cDNA。在100μl含有10mM Tris-HCl pH 8.85，25mM KCl，5mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4(Boehringer公司)，0.2mM dNTP(Pharmacia公司)，10μM SCCA 1-7F(所有引物的DNA序列在表1中列出)，10μM SCCA 391-397B，2μl cDNA和2.5U Pwo-聚合酶(Boehringer公司)的反應(yīng)液中，通過PCR反應(yīng)將覆蓋著SCCA編碼序列的1218bp DNA片斷放大。在96℃使樣本變性5分鐘后，完成總數(shù)為30次的循環(huán)，每次循環(huán)包括在96℃變性15秒，在60℃退火15秒，以及在72℃伸展30秒。最后在72℃伸展10分鐘完成PCR反應(yīng)。
SCCA1和SCCA2的發(fā)現(xiàn)通過用限制性內(nèi)切酶SacII剪切，產(chǎn)生兩個片斷，分別是245和973bp，或者通過SCCA1-特定PCR反應(yīng)，引物SCCA1-7F和SCCA1 323-329B用在標(biāo)準PCR反應(yīng)中(75mM Tris-HCl pH8.8，20mM(NH4)2SO4，0.01％特威恩(Tween)20，2mM MgCl2，0.2mM dNTP，每種引物10μM，模板，及0.025U/μl反應(yīng)Taq聚合酶；在96℃使樣本變性5分鐘后，完成總數(shù)為30次的循環(huán)，每次循環(huán)包括在96℃變性15秒，在最佳的退火溫度退火15秒，以及在72℃伸展30秒。最后在72℃伸展10分鐘完成PCR反應(yīng)。)，Ta＝50℃，產(chǎn)生997bp片斷，從而發(fā)現(xiàn)在PCR產(chǎn)物中存在SCCA1。通過標(biāo)準PCR反應(yīng)，使用SCCA1-7F和SCCA2-特定引物，SCCA2 357-363B，Ta＝60℃，給出1090bp片斷，發(fā)現(xiàn)SCCA2的存在。
克隆用PCR-Script Amp cloning kit(Stratagene公司)克隆PCR-產(chǎn)物。通過如1.2中所描述的PCR反應(yīng)完成菌落篩選。利用Wizard Plus微量制備質(zhì)粒DNA純化系統(tǒng)(Wizard Plus Minipreps DNA Purification System)(Promega公司)從選出的含有SCCA1或SCCA2的無性繁殖系中制備質(zhì)粒-DNAs。
DNA序列測定用ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing(PE Biosystems公司)對無性繁殖系進行測序。樣品在ABI Prism 310上檢測。
再克隆將選出的無性繁殖系再克隆到expression vector pGEX-6P-3中(Pharmacia公司)。用BamHI和XhoI從PCR-Script Amp vector上切除片斷，并在10μl含1×OPA，1mM ATP，50ng被剪切的載體，SCCA插入片斷，對應(yīng)于末端載體插入片斷的摩爾數(shù)比例為1∶5-1∶8，和7.5-10U T4DNAligase(所有都購自Pharmacia公司)的反應(yīng)液中將片斷連接到expression vector中。將反應(yīng)試管在10℃保溫過夜，并在65℃失活10分鐘。2-4μl的反應(yīng)物轉(zhuǎn)化成E.Coli JM109(46)。選出的無性繁殖系的Plasmid-DNAs轉(zhuǎn)化成E.Coli BL21用于蛋白質(zhì)表達(proteinexpression)。
克隆基因的保持Plasmid-DNA(含有SCCA1/A2融合基因的pGEX-6P-3)在10mM Tris-HCl(pH 8.0)緩沖溶液中在-80℃貯存。為恢復(fù)蛋白質(zhì)表達(protein expression)，根據(jù)Sambrook等(參考文獻46 1.82-1.84頁)，將plasmid-DNA轉(zhuǎn)化成具有反應(yīng)潛能的E.coli BL21。為制備更多的plasmid-DNA，優(yōu)選轉(zhuǎn)化成E.coli JM109。
1.1.2蛋白質(zhì)表達和純化蛋白質(zhì)表達小規(guī)模制備決定表達條件。對于大規(guī)模表達，將500ml 2×YT培養(yǎng)物和100μg氨芐青霉素/ml與5ml過夜的培養(yǎng)物接種，并在37℃培育。在OD600＝0.5-1.3通過加入IPTG直至最終濃度為0.1mM來誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達。
蛋白質(zhì)純化在2000g下離心10分鐘后采集細胞，用50ml TE pH8.0洗滌細胞，然后將細胞溶解于3ml TE/g細菌沉淀物中。加入溶菌酶直至最后濃度為800μg/g沉淀物，并將混合物在冰上培養(yǎng)30-60分鐘，然后將混合物在-70℃冷凍一晚。加入氯化鎂和DNA酶直至最后濃度分別為12mM和20μg/g沉淀物。在冰上培養(yǎng)30分鐘后，樣本在40000g下離心30分鐘。向每份上清夜中加入0.5ml 50％的谷胱甘肽Sepharose瓊脂糖凝膠(Pharmacia公司)，并在室溫平緩攪拌培養(yǎng)30分鐘-2小時。用1×PBS洗滌漿狀物5-7次。用0.5-1ml還原型谷胱甘肽(Pharmacia公司)洗脫GST-SCCA融合蛋白，并在室溫培養(yǎng)30-60分鐘或在4℃培養(yǎng)一夜，兩者均平緩攪拌。通過GST和SCCA之間剪切，洗脫SCCA蛋白。加入0.48ml剪切緩沖液(50mM Tris-HCl pH7.0，150mM NaCl，1mM EDTA，1mM DTT)和20μl PreScission蛋白酶，并在4℃培養(yǎng)樣本保持平緩攪拌4小時或一夜。用Phast-system全自動水平電泳系統(tǒng)(Pharmacia公司)在SDS-PAGE上分析蛋白質(zhì)。
實施例2雜交瘤和單克隆抗體的確立
2.1抗SCCA雜交瘤的免疫接種和初步選擇用重組SCC抗原給兔子進行皮下免疫接種并根據(jù)標(biāo)準程序收集免疫血清，由此獲得與SCC抗原反應(yīng)的多克隆抗血清。通過測定抗血清與固定在鏈霉抗生物素平皿(Labsystems Oy公司，芬蘭赫爾辛基)中的生物素化的SCCA2和SCCA1的反應(yīng)性，檢測多克隆抗血清的滴定度。根據(jù)標(biāo)準程序用生物素-N-琥珀酰亞胺己酸酯對重組SCCA2和SCCA1進行生物素化。
用Ribi佐劑中10-50μg的重組SCCA對Balb/c小鼠進行腹膜內(nèi)免疫接種，獲得與SCCA1和SCCA2反應(yīng)的單克隆抗體。經(jīng)過免疫接種，在60-90天內(nèi)接受2-4次促升劑量后，免疫接種了的小鼠的脾細胞與所述的P3×63Ag 8骨髓瘤細胞融合。
通過對處于覆蓋有抗小鼠IgG+M的親和性純化多克隆抗血清(Jackson免疫研究實驗室，美國)的微量滴定容皿中的雜交瘤上清夜進行ELISA篩選，選出產(chǎn)生抗體與SCCA1和/或SCCA2反應(yīng)的雜交瘤。然后用SCCA抗原培養(yǎng)容皿，經(jīng)過洗滌后，通過用多克隆兔子抗SCC(polyclonal Rabbit Anti SCC)和標(biāo)記為Swine抗兔子Ig的HRP(HRP labeled Swine Anti Rabbit Ig)(Dako公司，丹麥哥本哈根)培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)了結(jié)合抗原。
2.2選出的雜交瘤與SCC抗原的反應(yīng)性在ELISA中檢測確立的雜交瘤的反應(yīng)性類似于篩選程序。簡單地將由雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體固定在覆蓋有抗小鼠IgG+M的多克隆抗血清(Jackson免疫研究實驗室，美國)的微量滴定平皿中。然后用50μL不同的重組SCC抗原(SCCA1，SCCA2，SCCA1/A2和SCCA2/A1融合蛋白)在PBS 1％BSA中對容皿進行1小時的培養(yǎng)，洗滌后，用100μL兔子抗-SCC按1/5000的比例稀釋在PBS-1％BSA中的溶液對平皿進行培養(yǎng)，并再培養(yǎng)1小時。通過用HRP-Swine抗兔子Ig培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)結(jié)合的兔子抗-SCC，用OPD底物并測定450nm處OD值，使其顯現(xiàn)。
圖4列出了選出的雜交瘤的反應(yīng)性。其在以下的表1中也是很明顯的。
表1SCC單克SCCA1 SCCA2 SCCA1/A2 SCCA2/A1隆抗體SCC107 84 69 71 100SCC113 79 72 82 100SCC131 98 100100 92SCC133 99 80 87 97SCC134 81 58 99 66SCC136 88 89 78 79SCC140 10057 77 100SCC143 97 70 68 90SCC154 79 54 74 68SCC162 94 62 79 81SCC163 80 65 73 80SCC164 85 54 82 63SCC110 89 1 87 12SCC111 97 0 78 15SCC118 94 0 68 15SCC124 1002 88 16SCC141 5 42 080SCC161 0 43 045SCC103 0 10085 0SCC104 0 90 85 0SCC109 0 79 100 0
2.3選擇能鑒別游離和復(fù)合物-結(jié)合SCCA的單克隆抗體通過測定與SCCA-蛋白酶復(fù)合物的結(jié)合和與“游離”的SCCA的結(jié)合，選出與暴露在SCCA-蛋白酶復(fù)合物中的抗原決定部位反應(yīng)的單克隆抗體(MAb)及與“隱藏”在絲氨酸蛋白酶抑制物-蛋白酶復(fù)合物中的抗原決定部位反應(yīng)的單克隆抗體。
2.3.1 SCCA-蛋白酶復(fù)合物的確立將2μg SCCA-蛋白與0.5μg組織蛋白酶G(Biodesign公司)或0.9μg組織蛋白酶L(Calbiochem公司)于1×PBS緩沖液得到總體積為4.5μl的溶液0.5μg混合，得到SCCA與目標(biāo)蛋白酶結(jié)合的復(fù)合物。樣本在37℃培養(yǎng)30分鐘。向每份樣本中加入0.5μl 10×復(fù)合物-緩沖液(20％SDS，140mM巰基乙醇，溴酚藍)。樣本在95℃培養(yǎng)3分鐘，并在12.5％SDS-PAGE-凝膠上分析。
下面的表2和圖5明顯地反映出復(fù)合物結(jié)合的反應(yīng)性。
2.3.2與SCCA-蛋白酶復(fù)合物的反應(yīng)性。
單克隆抗體識別出抗原決定部位，其分別對SCCA1和組織蛋白酶L之間以及SCCA2和組織蛋白酶G之間的復(fù)合物形成無干擾，通過分別對能識別出位于SCCA1和SCCA2外顯子2-7中的抗原決定部位的抗體進行預(yù)溫育，然后在所描述的ELISA測定法中測定復(fù)合物形成，發(fā)現(xiàn)了此單克隆抗體。
由于能分別抑制SCCA1和組織蛋白酶L之間以及SCCA2和組織蛋白酶G之間的復(fù)合物形成，可推知，許多抗體識別出不受絲氨酸蛋白酶抑制物和目標(biāo)蛋白酶之間復(fù)合物形成影響的抗原決定部位。圖5和下面的表2顯示了抗體與絲氨酸蛋白酶抑制物-蛋白酶的反應(yīng)性。
表2SCC單克 SCCA1-組 組織蛋白 SCCA2-組織 組織蛋隆抗體織蛋白酶L 酶L 蛋白酶G 白酶GSCC10788 2 81 12SCC13386 3 75 21SCC15492 2 83 15SCC16279 4 85 16SCC16482 5 87 7SCC13494 2 39 15SCC13683 2 60 13SCC11393 5 100 17SCC14092 5 96 12SCC16378 4 70 9SCC13188 4 45 15SCC14380 5 28 12SCC12472 1 12 15SCC11877 1 12 18SCC11087 2 15 21SCC11194 3 8 12SCC14112 0 68 14SCC16115 0 56 17SCC1044 0 12 8SCC1092 0 8 17SCC1035 0 100 142.3.1中描述的抗體與處于外顯子8中的抗原決定部位反應(yīng)，這些抗體抑制相應(yīng)的絲氨酸蛋白酶抑制物和它的蛋白酶之間復(fù)合物的形成?？梢酝茢啵@些抗體識別“隱藏的”抗原決定部位。
與“游離的”SCCA的復(fù)合物如下面的表3及圖6所示。
表3SCC 單 SCCA1 SCCA2 SCCA1/A2 SCCA2/A1克隆抗體SCC10784697185SCC13399808790SCC15479547468SCC16294627981SCC16485548263SCC13481589966SCC13688897879SCC11379728289SCC140957777100SCC16380657380SCC13198100 100 92SCC14397706890SCC124852 8816SCC118940 6815SCC110891 8712SCC111970 785SCC14110520 80SCC1610 530 55SCC1040 90850SCC1090 79100 0SCC1030 100 850
2.3.3確立的單克隆抗體反應(yīng)性概述確立的單克隆抗體對不同形式SCCA的反應(yīng)性概括在表4中。
表4

A1b組和A3b組優(yōu)選與“游離的”SCC反應(yīng)；C1a組和C2a組識別“SCCA2總量”，而C1b組和C2b組僅識別“游離的SCCA2”。
2.4不同的單克隆抗體產(chǎn)物通過在試管中培養(yǎng)雜交瘤無性繁殖系，通過在旋轉(zhuǎn)瓶里將104細胞/mL接種于含5％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，產(chǎn)生單克隆抗體，并讓其生長10-14天。然后根據(jù)廠商的建議，利用蛋白A(Bioprocessing公司，英國達累姆)親合色譜法從培養(yǎng)基中提純單克隆抗體。
實施例3免疫測定法的確立利用確立的單克隆抗體和重組蛋白，很可能開發(fā)出用于單獨測定SCCA總量和“游離的”SCCA總量的免疫測定法，和用于分別單獨測定SCCA1總量和“游離的”SCCA1的測定法及用于單獨測定SCCA2總量和“游離的”SCCA2的測定法。
3.1用于測定SCCA總量的免疫測定法3.1.1用于測定“SCCA總量”的免疫測定法將A1a(表1)中的抗體與來自A2組或A3a組的抗體結(jié)合使用，設(shè)計出特定用于SCCA的測定法，即“游離的”SCCA1，“游離的”SCCA2，復(fù)合的SCCA1和復(fù)合的SCCA2之總和。
優(yōu)選組合是抗體SCC113用作捕獲抗體，SCC107用作檢測抗體。
用生物素NHRS己酸酯(Sigma化學(xué)公司，美國)，使用標(biāo)準程序?qū)CC113單克隆抗體進行生物素化，并用作捕獲抗體。根據(jù)Nakone程序的修飾，SCC107單克隆抗體與HRP結(jié)合。
根據(jù)下列方案，在一步酶免疫測定(one-step EIA)中使用生物素化的SCC113單克隆抗體和結(jié)合了HRP的SCC107單克隆抗體。
測定過程1.向覆蓋著鏈霉抗生物素蛋白的微量滴定皿(Labsystems Oy公司，芬蘭赫爾辛基)里的測定緩沖液中加入25μL SCCA重組抗原(在PBS緩沖液中的濃度為0-50μg/L，60g/L牛血清白蛋白(BSA)，pH7.2)，加入100μL生物素SCC113單克隆抗體，1μg/mL和HRPSCC107，1μg/mL。
2.培養(yǎng)1小時±10分鐘，并一直搖動。
3.用5mM Tris緩沖液，0.05％Tween 40，pH7.75洗滌6次。
4.加入100μL TMB，美國ELISA技術(shù)公司。
5.培養(yǎng)30分鐘±5分鐘6.ELISA讀數(shù)儀測620nm處OD值。
游離和復(fù)合的SCCA1和SCCA2抗原的劑量-反應(yīng)曲線顯示了此測定法識別出了所有形式的SCCA。
3.2用于單獨測定SCCA1的測定法3.2.1對SCCA1總量的測定將B1組的抗體與來自A1a組，A2組或A3a組的抗體結(jié)合使用，設(shè)計出特別測定SCCA1總量的測定法，即游離和復(fù)合的SCCA1，與SCCA2無顯著的反應(yīng)性。優(yōu)選組合是SCC110單克隆抗體用作捕獲抗體，SCC107用作檢測抗體。
用生物素NHRS己酸酯(Sigma化學(xué)公司，美國)利用標(biāo)準程序?qū)CC111單克隆抗體進行生物素化，并將其用作捕獲抗體。根據(jù)Nakone程序的修飾，SCC107單克隆抗體與HRP，V型(Sigma化學(xué)公司，美國)結(jié)合。
根據(jù)下列方案，在兩位點酶免疫測定(two-site EIA)中使用生物素化的SCC111單克隆抗體和結(jié)合了HRP的SCC107單克隆抗體。
測定過程1.向覆蓋著鏈霉抗生物素蛋白的微量滴定皿(Labsystems公司，芬蘭赫爾辛基)中的測定緩沖液中加入50μL SCC重組抗原(在PBS緩沖液中的濃度為0-100μg/L，60g/L牛血清白蛋白(BSA)，pH7.2)，和100μL生物素SCC111單克隆抗體，2μg/mL。
2.培養(yǎng)1小時±10分鐘，并一直搖動。
3.用5mM Tris緩沖液，0.05％Tween 40，pH7.75，洗滌3次。
4.在測定緩沖液中加入100μL HRP SCC107單克隆抗體2μg/mL。
5.培養(yǎng)1小時±10分鐘，并一直搖動。
6.用5mM Tris緩沖液，0.05％Tween 40，pH7.75，洗滌6次。
7.加入100μL TMB，ELISA技術(shù)公司，美國
8.培養(yǎng)30分鐘±5分鐘9.ELISA讀數(shù)儀測620nm處OD值。
基于SCCA1和SCCA2的劑量-反應(yīng)曲線圖，可推斷出，實施例3.2.1的測定法能識別出與SCCA2交叉反應(yīng)性＜5％的所有形式的SCCA1。
3.2.2對“游離的”SCCA1的測定將B2組抗體與A1a組抗體結(jié)合使用，設(shè)計出單獨測定“游離的”SCCA1的測定法，即特定用于非復(fù)合的SCCA1，與復(fù)合的SCCA1或SCCA2無顯著的反應(yīng)性。優(yōu)選組合是SCCK134單克隆抗體用作捕獲抗體，SCC107用作檢測抗體。
用生物素NHRS己酸酯(Sigma化學(xué)公司，美國)利用標(biāo)準程序?qū)CCK134單克隆抗體進行生物素化，并將其用作捕獲抗體。根據(jù)Nakone程序的修飾，SCC107單克隆抗體與HRP，V型(Sigma化學(xué)公司，美國)結(jié)合。
根據(jù)下列方案，在兩位點酶免疫測定(two-site EIA)中使用生物素化的SCCK134單克隆抗體和結(jié)合了HRP的SCC107單克隆抗體。
測定過程1.向覆蓋著鏈霉抗生物素蛋白的微量滴定皿(Labsystems公司，芬蘭赫爾辛基)里的測定緩沖液中，加入50μL SCC重組抗原(在PBS緩沖液中的濃度為0-100μg/L，60g/L牛血清白蛋白(BSA)，pH7.2)，和100μL生物素SCCK134單克隆抗體，2μg/mL。
2.培養(yǎng)1小時±10分鐘，并一直搖動。
3.用5mM Tris緩沖液，0.05％Tween 40，pH7.75，洗滌3次。
4.在測定緩沖液中加入100μL HRP SCC107單克隆抗體2μg/mL。
5.培養(yǎng)1小時±10分鐘，并一直搖動。
6.用5mM Tris緩沖液，0.05％Tween 40，pH7.75，洗滌6次。
7.加入100μL TMB，ELISA技術(shù)公司，美國8.培養(yǎng)30分鐘±5分鐘9.ELISA讀數(shù)儀測620nm處OD值。
基于SCCA1和SCCA2的劑量-反應(yīng)曲線圖，可推斷出，實施例3.2.2的測定法能識別出與復(fù)合SCCA1或SCCA2交叉反應(yīng)性＜5％的僅“游離”的SCCA1。
3.3用于單獨測定SCCA2的測定法3.3.1用于測定SCCA2總量的測定法將C1a組或C2a組的抗體與A1a組的抗體結(jié)合使用，設(shè)計出單獨測定SCCA2總量的測定法，即游離和復(fù)合的SCCA2，與SCCA1無顯著的反應(yīng)性。優(yōu)選組合是SCC103單克隆抗體用作捕獲抗體，SCC107用作檢測抗體。
用生物素NHRS己酸酯(Sigma化學(xué)公司，美國)利用標(biāo)準程序?qū)CC103單克隆抗體進行生物素化，并將其用作捕獲抗體。根據(jù)Nakone程序的修飾，SCC107單克隆抗體與HRP，V型(Sigma化學(xué)公司，美國)結(jié)合。
根據(jù)下列方案，在兩位點酶免疫測定(two-site EIA)中使用生物素化的SCC103單克隆抗體和結(jié)合了HRP的SCC107單克隆抗體。
測定過程1.向覆蓋著鏈霉抗生物素蛋白的微量滴定皿(Labsystems公司，芬蘭赫爾辛基)里的測定緩沖液中，加入50μL SCC重組抗原(在PBS緩沖液中的濃度為0-100μg/L，60g/L牛血清白蛋白(BSA)，pH7.2)，和100μL生物素SCC103單克隆抗體，2μg/mL。
2.培養(yǎng)1小時±10分鐘，并一直搖動。
3.用5mM Tris緩沖液，0.05％Tween 40，pH7.75，洗滌3次。
4.在測定緩沖液中加入100μL HRP SCC107單克隆抗體2μg/mL。
5.培養(yǎng)1小時±10分鐘，并一直搖動。
6.用5mM Tris緩沖液，0.05％Tween 40，pH7.75，洗滌6次。
7.加入100μL TMB，ELISA技術(shù)公司，美國8.培養(yǎng)30分鐘±5分鐘9.ELISA讀數(shù)儀測620nm處OD值。
基于SCCA1和SCCA2的劑量-反應(yīng)曲線圖，可推斷出，實施例3.3.1的測定法能識別出與SCCA2交叉反應(yīng)性＜5％的所有形式的SCCA2。
3.3.2對“游離的”SCCA2的測定將來自C2b組的抗體與A1a組的抗體結(jié)合使用，設(shè)計出單獨測定“游離的”SCCA2的測定法，即非復(fù)合的SCCA2，與SCCA2-蛋白酶復(fù)合物或SCCA1無顯著反應(yīng)性。優(yōu)選組合是SCC104單克隆抗體用作捕獲抗體，SCC107用作檢測抗體。
用生物素NHRS己酸酯(Sigma化學(xué)公司，美國)利用標(biāo)準程序?qū)CC104單克隆抗體進行生物素化，并將其用作捕獲抗體。根據(jù)Nakone程序的修飾，SCC107單克隆抗體與HRP，V型(Sigma化學(xué)公司，美國)結(jié)合。
根據(jù)下列方案，在兩位點酶免疫測定(two-site EIA)中使用生物素化的SCC104單克隆抗體和結(jié)合了HRP的SCC107單克隆抗體。
測定過程1.向覆蓋著鏈霉抗生物素蛋白的微量滴定皿(Labsystems公司，芬蘭赫爾辛基)里的測定緩沖液中，加入50μL SCC重組抗原(在PBS緩沖液中的濃度為0-100μg/L，60g/L牛血清白蛋白(BSA)，pH7.2)，和100μL生物素SCC104單克隆抗體，2μg/mL。
2.培養(yǎng)1小時±10分鐘，并一直搖動。
3.用5mM Tris緩沖液，0.05％Tween 40，pH7.75，洗滌3次。
4.在測定緩沖液中加入100μL HRPSCC107單克隆抗體2μg/mL。
5.培養(yǎng)1小時±10分鐘，并一直搖動。
6.用5mM Tris緩沖液，0.05％Tween 40，pH7.75，洗滌6次。
7.加入100μL TMB，ELISA技術(shù)公司，美國8.培養(yǎng)30分鐘±5分鐘9.ELISA讀數(shù)儀測620nm處OD值。
基于SCCA1和SCCA2的劑量-反應(yīng)曲線圖，可推斷出，實施例3.3.2的免疫測定法能識別出與復(fù)合SCCA2或SCCA1交叉反應(yīng)性＜5％的僅“游離”的SCCA2。
實施例4用鑒別“游離的”SCCA的免疫測定法診斷癌癥。
將實施例3的免疫測定法用于測定健康個體和患有鱗狀細胞癌病人體內(nèi)不同形式的SCCA。
正如所料，所有的測定法都顯示出了健康個體與癌癥患者之間的區(qū)別。然而，對于測定SCCA2的測定法，健康受測體和癌癥患者之間的鑒別比率較高，此測定法可通過測定游離與復(fù)合的SCCA2之間的比率以及SCCA2與SCCA1之間的比率得以進一步改善。
測定50名供血者和50名健康受測者年齡在50-65歲的SCCA同型異構(gòu)體以便得到測定的正常水平上限。根據(jù)實施例3的測定法，測定94個診斷患有子宮頸癌的女性樣本和20名患有鱗狀細胞肺癌患者的SCCA同型異構(gòu)體。
實施例4.1圖2顯示了鱗狀細胞肺癌的結(jié)果。有14個病人SCCA1高于正常水平上限，而SCCA2高于正常水平上限的病人增加到18個。相比于SCCA1，SCCA2水平也相對高些，從而增大了健康受測者與惡性病患者之間的區(qū)別。
實施4.2子宮頸癌中的SCCA圖7-10顯示了來自患子宮頸癌的女性預(yù)治療樣本中SCCA1和SCCA2的水平。與SCCA1相比，SCCA2一般增加地相對高些。從而增大了健康受測者與子宮頸癌患者之間的區(qū)別。
實施例4.3治療控制子宮頸癌中的SCCA1和SCCA2利用實施例3的測定法，在治療控制期間，對6位病人的SCCA1和SCCA2進行測定。無論SCCA1和SCCA2都伴隨著疾病臨床發(fā)病病程，并在4/4病人疾病臨床癥狀出現(xiàn)之前，SCCA1和SCCA2發(fā)現(xiàn)疾病復(fù)發(fā)。而病人中，SCCA2的相對增加高于SCCA1，從而提供了疾病復(fù)發(fā)的早期信號。有NED的病人經(jīng)過治療后，無論SCCA1和SCCA2均能達到正常。
病人53在治療后18個月發(fā)現(xiàn)病情復(fù)發(fā)。SCCA1和SCCA2升高說明病情復(fù)發(fā)，但SCCA2與SCCA1相比，作出反應(yīng)更早，并且對于指示復(fù)發(fā)跡象顯示出更高的水平。
經(jīng)過治療后16個月臨床發(fā)現(xiàn)病人29病情復(fù)發(fā)，從治療后8個月的時候，SCCA2升高指示出復(fù)發(fā)情況，這比SCCA1早了2-3個月。
病人83在開始治療后7個月表現(xiàn)出病情加重。SCCA2從未正常過，而SCCA1在開始治療后3個月正常，然后在臨床診斷出病情加重時胃里的SCCA1或多或少地有所升高。
13個月后臨床診斷出病人70病情復(fù)發(fā)。治療后5-6個月之間SCCA2處于上升狀態(tài)。治療后9個月SCCA1也輕微升高，后來伴隨著臨床發(fā)病病程。而SCCA2在臨床診斷前5-7個月就更加清楚地指示出病情復(fù)發(fā)。
病人48的SCCA2的水平從未正常過，這暗示了在治療后2個月病情已經(jīng)復(fù)發(fā)并加重。SCCA1在治療后5個月之前一直都處于正常水平上限，之后才開始升高。
病人45對治療有響應(yīng)，治療后沒有觀察到疾病跡象。通過SCCA1和SCCA2的水平均正常并停留在正常范圍內(nèi)，說明了這一點。
無論SCCA1還是SCCA2都跟隨著疾病的臨床發(fā)病病程。而SCCA2與SCCA1相比，對病情復(fù)發(fā)作出的反應(yīng)更早且更明顯。


圖1人類絲氨酸蛋白酶抑制劑圖譜對應(yīng)兩種染色體族之一。PI6，PI9和ELNAH2圖譜對應(yīng)6p25；而PI8，Bomapin，PAI2，SCCA1，SCCA2，Headpin和Maspin圖譜對應(yīng)18q21.3。
圖2-3顯示了SCCA1和SCCA2的反應(yīng)活性部位環(huán)。
圖4顯示了SCC單克隆抗體相關(guān)的反應(yīng)性。
圖5顯示了復(fù)合物結(jié)合的SCC單克隆抗體相關(guān)的反應(yīng)性。
圖6顯示了“游離的”SCC單克隆抗體相關(guān)的反應(yīng)性。
圖7顯示了在20個鱗狀細胞肺癌，限制病情，樣本中的SCCA1和SCCA2。
橫條分別指示SCCA1和SCCA2的參考水平上限。
圖8第I階段子宮頸癌中的SCCA1和SCCA2。
橫條分別指示SCCA1和SCCA2的參考水平上限。
圖9第II階段子宮頸癌中的SCCA1和SCCA2。
橫條分別指示SCCA1和SCCA2的參考水平上限。
圖10第III-IV階段子宮頸癌中的SCCA1和SCCA2。
橫條指示正常水平上限。
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權(quán)利要求
1.單克隆抗體，能分辨游離的SCCA與SCCA總量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的單克隆抗體，能分辨游離的SCCA1與SCCA1總量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的單克隆抗體，其中抗體由雜交瘤產(chǎn)生。
4.單克隆抗體，抗體片斷，重組抗體，scFv或肽片斷具有與根據(jù)權(quán)利要求1和3的抗體基本相同的結(jié)合特性。
5.基于根據(jù)權(quán)利要求1-3的抗體或其它結(jié)合結(jié)構(gòu)的免疫測定法用于單獨測定游離的SCCA1。
6.用根據(jù)權(quán)利要求5的免疫測定法，診斷癌癥或發(fā)現(xiàn)癌癥疾病復(fù)發(fā)的方法。
7.計算游離的SCCA1與SCCA1總量或復(fù)合物-結(jié)合的SCCA1之間的比率，診斷癌癥的方法。
8.計算游離的SCCA1與SCCA總量之間比率，診斷癌癥的方法。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的單克隆抗體，能分辨游離的SCCA2與SCCA2總量。
10.根據(jù)權(quán)利要求10的單克隆抗體，其中抗體由雜交瘤產(chǎn)生。
11.單克隆抗體，抗體片斷，重組抗體，scFv或肽片斷具有與根據(jù)權(quán)利要求10和11的抗體基本相同的結(jié)合特性。
12.基于根據(jù)權(quán)利要求10-12的抗體或其它結(jié)合結(jié)構(gòu)的免疫測定法用于單獨測定游離的SCCA2。
13.用根據(jù)權(quán)利要求13的免疫測定法，診斷癌癥或發(fā)現(xiàn)癌癥疾病復(fù)發(fā)的方法。
14.計算游離的SCCA2與SCCA總量之間的比率，診斷癌癥或癌癥疾病復(fù)發(fā)的方法。
15.計算游離的SCCA2與SCCA1總量，復(fù)合物結(jié)合的SCCA1和/或游離的SCCA1之間的比率，診斷鱗狀癌或癌癥疾病復(fù)發(fā)的方法。
16.利用根據(jù)權(quán)利要求6-8和14-16中的任何一種免疫測定法和計算，診斷鱗狀細胞癌的方法。
17.利用根據(jù)權(quán)利要求6-8和14-16中的任何一種免疫測定法和計算，診斷鱗狀細胞子宮頸癌的方法。
18.利用根據(jù)權(quán)利要求6-8和14-16中的任何一種免疫測定法或計算，診斷鱗狀細胞肺癌的方法。
19.利用根據(jù)權(quán)利要求6-8和14-16中的任何一種免疫測定法或計算，診斷鱗狀細胞子宮癌的方法。
20.利用根據(jù)權(quán)利要求6-8和14-16中的任何一種免疫測定法或計算，診斷鱗狀細胞食道癌的方法。
21.利用根據(jù)權(quán)利要求6-8和14-16中的任何一種免疫測定法或計算，診斷鱗狀細胞頭部和頸部癌的方法。
22.利用根據(jù)權(quán)利要求6-8和14-16中的任何一種免疫測定法或計算，診斷鱗狀細胞陰門癌的方法。
23.用于診斷癌癥或發(fā)現(xiàn)癌癥疾病復(fù)發(fā)的試劑盒，其中，試劑盒包括能分辨游離的SCCA與SCCA總量的單克隆抗體。
24.用于診斷癌癥或發(fā)現(xiàn)癌癥疾病復(fù)發(fā)的試劑盒，其中，試劑盒包括能分辨游離的SCCA1與SCCA1總量的單克隆抗體。
25.用于診斷癌癥或發(fā)現(xiàn)癌癥疾病復(fù)發(fā)的試劑盒，其中，試劑盒包括能分辨游離的SCCA2與SCCA2總量的單克隆抗體。
26.用于診斷癌癥或發(fā)現(xiàn)癌癥疾病復(fù)發(fā)的試劑盒，其中，試劑盒包括雜交瘤，雜交瘤識別能分辨游離的SCCA與SCCA總量的單克隆抗體。
27.用于診斷癌癥或發(fā)現(xiàn)癌癥疾病復(fù)發(fā)的試劑盒，其中，試劑盒包括雜交瘤，雜交瘤識別能分辨游離的SCCA1與SCCA1總量的單克隆抗體。
28.用于診斷癌癥或發(fā)現(xiàn)癌癥疾病復(fù)發(fā)的試劑盒，其中，試劑盒包括雜交瘤，雜交瘤識別能分辨游離的SCCA2與SCCA2總量的單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及單克隆抗體，它能分辨游離的或復(fù)合物結(jié)合形式的鱗狀細胞癌抗原，SCCA，優(yōu)選抗原SCCA1和SCCA2；以及識別此類抗體的雜交瘤；用于診斷SCC的方法；及用于發(fā)現(xiàn)SCCAs的診斷試劑盒。
文檔編號C07K16/18GK1684981SQ03823516
公開日2005年10月19日 申請日期2003年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月10日
發(fā)明者伊萬·羅杰, 尼爾松·奧利 申請人:康鈉格診斷公司