癌的檢測(cè)方法及識(shí)別胰臟特異性的核糖核酸酶1的抗體的制作方法
【專利摘要】制備在胰臟特異性的RNase 1的能夠進(jìn)行N型糖鏈修飾的部位沒(méi)有結(jié)合糖鏈的情況下與該部位結(jié)合、在結(jié)合有N型糖鏈的情況下與該部位的結(jié)合被阻礙的單克隆抗體；另外，制備能夠與該抗體同時(shí)地與相同胰臟特異性的RNase 1結(jié)合的單克隆抗體，使用它們，求出A與B的比，由此檢測(cè)胰腺癌。A＝胰臟特異性的RNase 1的能夠進(jìn)行N型糖鏈修飾的部位的、結(jié)合有N型糖鏈的部位或沒(méi)有結(jié)合N型糖鏈的部位的量。B＝胰臟特異性的RNase 1的能夠進(jìn)行N型糖鏈修飾的部位的量。
【專利說(shuō)明】癌的檢測(cè)方法及識(shí)別胰臟特異性的核糖核酸酶1的抗體

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及癌的檢測(cè)方法及識(shí)別胰臟特異性的核糖核酸酶1的抗體。更詳細(xì)而言 涉及，通過(guò)測(cè)定糖蛋白的能夠進(jìn)行N型糖鏈修飾的部位是否結(jié)合糖鏈而進(jìn)行癌的檢測(cè)的方 法。

【背景技術(shù)】
[0002] 作為診斷初期階段的癌的檢測(cè)方法，優(yōu)選將非侵入的來(lái)源于生物的試樣例如血 液、尿等比較容易采集的體液作為被檢體。作為現(xiàn)在的胰腺癌的診斷時(shí)所使用的血清標(biāo)記 物，有：CA19-9、DUPAN-2等。然而，存在如下缺點(diǎn)：這些標(biāo)記物的臟器特異性低、從遺傳的理 由出發(fā)有該標(biāo)記物不反應(yīng)的情況等、不能成為決定性的確定診斷。
[0003] 作為核糖核酸酶家族之一的胰臟特異性的核糖核酸酶1 (以下，將核糖核酸酶1稱 為"RNase 1"）為胰臟特異性地表達(dá)、并且被分泌至細(xì)胞外的體液中的糖蛋白。該蛋白質(zhì)是 被翻譯成包含156個(gè)氨基酸的肽（序列號(hào)1)，在分泌信號(hào)的去除、接受糖鏈修飾之后，成為 具有128個(gè)氨基酸的肽序列（序列號(hào)2)的成熟糖蛋白，從而被分泌至細(xì)胞外。能夠進(jìn)行N 型糖鏈修飾的部位、即有可能接受N型糖鏈修飾的氨基酸殘基為序列號(hào)2中的第34位、第 76位、第88位的天冬酰胺殘基。
[0004] 一直以來(lái)都在研究胰臟特異性的RNase 1，雖然報(bào)告了癌的表達(dá)、活性的變化等， 但沒(méi)有實(shí)際臨床應(yīng)用的例子。1980年Doran等人報(bào)告了胰腺癌患者血清中的核糖核酸酶活 性增加（非專利文獻(xiàn)1)，只有活性的記載，對(duì)于核糖核酸酶的分子種類沒(méi)有限定。關(guān)于胰臟 特異性的RNase 1的糖鏈修飾，1994年報(bào)告了由健康人得到的核糖核酸酶，對(duì)于3處能夠進(jìn) 行糖鏈修飾的部位的各自的糖鏈附加的程度有所報(bào)告，但是對(duì)于與胰腺癌的關(guān)聯(lián)性沒(méi)有報(bào) 告（非專利文獻(xiàn)2)。2000年，F(xiàn)ernandez-Salas等人報(bào)告了由源自胰腺癌的培養(yǎng)細(xì)胞分泌 的胰臟特異性的RNase 1的分子量大于由正常的胰臟得到的RNase 1的分子量，作為其理 由之一，指出了糖鏈修飾量的增加（非專利文獻(xiàn)3)。進(jìn)而，同一研究組在2003年和2007年， 發(fā)表了關(guān)于胰臟特異性的RNase 1的糖鏈修飾的報(bào)告，其中指出了由胰腺癌（Pancreatic cancer)患者的血清得到的胰臟特異性的RNase 1的N型糖鏈結(jié)構(gòu)有變化，特別是明確了被 核心巖藻糖化的2條支鏈復(fù)合型糖鏈增加，胰臟特異性的RNase 1的分子量增加起因于附 加的糖鏈結(jié)構(gòu)自身的分子量增加（非專利文獻(xiàn)4、5)。然而，至今并沒(méi)有將糖蛋白的能夠進(jìn) 行N型糖鏈修飾的部位的有無(wú)結(jié)合糖鏈與癌關(guān)聯(lián)的報(bào)告。
[0005] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0006] 非專利文獻(xiàn)
[0007] 非專利文獻(xiàn) I J. Clin. Pathol. 33,1212-13 (1980)
[0008] 非專利文獻(xiàn) 2 :Biol. Chem. Hoppe Seyler 375, 357-63 (1994)
[0009] 非專利文獻(xiàn) 3 :Eur J Biochem. 267,1484-1494(2000)
[0010] 非專利文獻(xiàn) 4 :Glycobiology 13,227-244(2003)
[0011] 非專利文獻(xiàn) 5 :Glycobiology 17,388-400(2007)


【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 發(fā)明要解決的問(wèn)是頁(yè)
[0013] 本發(fā)明著眼于糖蛋白的能夠進(jìn)行N型糖鏈修飾的部位，目的在于提供癌的檢測(cè)方 法和識(shí)別胰臟特異性的RNase 1的抗體。
[0014] 用于解決問(wèn)題的方案
[0015] 本發(fā)明人等為了解決上述問(wèn)題而進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：癌患者與健康人相 t匕，在胰臟特異性的RNase 1的能夠進(jìn)行N型糖鏈修飾的部位結(jié)合有糖鏈的情況增加，至此 完成了本發(fā)明。另外，本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)了與胰臟特異性的RNase 1特異地結(jié)合的抗體，即將 胰臟特異性的RNase 1的能夠進(jìn)行N型糖鏈修飾的部位作為抗原識(shí)別位點(diǎn)的一部分，在N 型糖鏈修飾的部位結(jié)合有糖鏈的情況下與胰臟特異性的RNase 1的結(jié)合被阻礙的抗體，至 此完成了本發(fā)明。
[0016] SP，本發(fā)明如下。
[0017] (1) 一種癌的檢測(cè)方法，其特征在于，測(cè)定糖蛋白的能夠進(jìn)行N型糖鏈修飾的部位 的、結(jié)合有N型糖鏈的部位或沒(méi)有結(jié)合N型糖鏈的部位的量。
[0018] (2)根據(jù)⑴所述的方法，其中，癌為胰腺癌。
[0019] (3)根據(jù)⑴或⑵所述的方法，其中，糖蛋白為胰臟特異性的RNase 1。
[0020] (4)根據(jù)⑵或⑶所述的方法，其中，胰腺癌患者與健康人相比，結(jié)合有N型糖鏈 的部位的量增加。
[0021] (5) -種癌的檢測(cè)方法，其特征在于，求出下述A、B中的A與B的比。
[0022] A =糖蛋白的能夠進(jìn)行N型糖鏈修飾的部位的、結(jié)合有N型糖鏈的部位或沒(méi)有結(jié)合 N型糖鏈的部位的量
[0023] B =糖蛋白的能夠進(jìn)行N型糖鏈修飾的部位的量
[0024] (6)根據(jù)（5)所述的方法，其中，癌為胰腺癌。
[0025] (7)根據(jù)（5)或（6)所述的方法，其中，糖蛋白為胰臟特異性的RNase 1。
[0026] (8)根據(jù)上述（6)或（7)所述的方法，其為A=沒(méi)有結(jié)合N型糖鏈的部位的量，胰 腺癌患者與健康人相比A/B的值減小的方法。
[0027] (9)根據(jù)上述（6)或（7)所述的方法，其為A=結(jié)合有N型糖鏈的部位的量，胰腺 癌患者與健康人相比A/B的值增大的方法。
[0028] (10)根據(jù)上述（7)?（9)中的任一項(xiàng)所述的方法，其為求出胰臟特異性的RNase 1的量、換算該值作為B的值的方法。
[0029] (11)根據(jù)⑴?（10)中的任一項(xiàng)所述的方法，其中，能夠進(jìn)行N型糖鏈修飾的部 位為選自序列號(hào)2所示的序列的第34位、第76位和第88位的1個(gè)以上的天冬酰胺殘基。
[0030] (12)根據(jù)（11)所述的方法，其中，能夠進(jìn)行N型糖鏈修飾的部位為序列號(hào)2所示 的序列的第88位的天冬酰胺殘基。
[0031] (13)根據(jù)（11)所述的方法，其中，能夠進(jìn)行N型糖鏈修飾的部位為序列號(hào)2所示 的序列的第76位的天冬酰胺殘基。
[0032] (14)根據(jù)（11)所述的方法，其中，能夠進(jìn)行N型糖鏈修飾的部位為序列號(hào)2所示 的序列的第34位的天冬酰胺殘基。
[0033] (15) -種單克隆抗體或其片段，其將胰臟特異性的RNase 1的能夠進(jìn)行N型糖鏈 修飾的部位作為抗原識(shí)別位點(diǎn)的一部分。
[0034] (16)根據(jù)（15)所述的單克隆抗體或其片段，其中，在胰臟特異性的RNasel的能夠 進(jìn)行N型糖鏈修飾的部位沒(méi)有結(jié)合糖鏈的情況下，單克隆抗體或其片段與該部位結(jié)合；在 胰臟特異性的RNase 1的能夠進(jìn)行N型糖鏈修飾的部位結(jié)合有N型糖鏈的情況下，單克隆 抗體或其片段與該部位的結(jié)合被阻礙。
[0035] (17)根據(jù)（15)或（16)所述的單克隆抗體或其片段，其中，抗原識(shí)別位點(diǎn)為包含序 列號(hào)2所示的序列的第88位的天冬酰胺殘基的區(qū)域。
[0036] (18) -種單克隆抗體或其片段，其特征在于，能夠與上述（15)?（17)中的任一項(xiàng) 所述的單克隆抗體或其片段同時(shí)地結(jié)合于胰臟特異性的RNase 1。
[0037] (19)根據(jù)上述⑴?（14)中的任一項(xiàng)所述的方法，其中，使（a)上述的（15)? (17)中的任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或其片段與試樣接觸，測(cè)定與（a)的單克隆抗體或其片 段形成了復(fù)合體的胰臟特異性的RNase 1。
[0038] (20)根據(jù)上述（19)所述的方法，其中，進(jìn)一步使（b)上述（18)所述的單克隆抗體 或其片段與試樣接觸，測(cè)定與（a)和（b)的兩種單克隆抗體或抗體片段形成了復(fù)合體的胰 臟特異性的RNase 1。
[0039] (21)根據(jù)上述（20)所述的方法，其包括：使試樣與（a)或（b)的一者接觸的第一 接觸工序；和使第一接觸工序中得到的物質(zhì)與（a)或（b)的另一者接觸的第二接觸工序。
[0040] (22) -種藥品，其特征在于，含有上述（15)?（17)中的任一項(xiàng)所述的單克隆抗體 或其片段。
[0041] (23)根據(jù)（1)?（14)中的任一項(xiàng)所述的方法，其中，通過(guò)質(zhì)譜分析法求出糖蛋白 的能夠進(jìn)行N型糖鏈修飾的部位的、結(jié)合有N型糖鏈的部位或沒(méi)有結(jié)合N型糖鏈的部位的 量。
[0042] (24)根據(jù)上述（23)所述的方法，其為通過(guò)質(zhì)譜分析法測(cè)定糖蛋白的肽片段和/或 糖肽片段的質(zhì)量的方法。
[0043] 以下，更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明。本發(fā)明為通過(guò)測(cè)定糖蛋白的能夠進(jìn)行N型糖鏈修飾 的部位的、結(jié)合有N型糖鏈的部位或沒(méi)有結(jié)合N型糖鏈的部位的量從而檢測(cè)癌的發(fā)明。此 時(shí)，測(cè)定糖蛋白的能夠進(jìn)行N型糖鏈修飾的部位的、結(jié)合有N型糖鏈的"部位"的量或沒(méi)有 結(jié)合N型糖鏈的"部位"的量，而并非測(cè)定與能夠進(jìn)行N型糖鏈修飾的部位結(jié)合的"糖鏈"的 量。作為癌，沒(méi)有特別的限定，特別是能夠檢測(cè)胰腺癌。
[0044] 對(duì)于作為測(cè)定對(duì)象的糖蛋白，沒(méi)有特別的限定，優(yōu)選為胰臟特異性的RNase 1。另 夕卜，其優(yōu)選為來(lái)源于人的生物試樣。通過(guò)將糖蛋白作為測(cè)定對(duì)象，能夠特異地檢測(cè)人的胰腺 癌。此時(shí)，胰腺癌患者與健康人相比，在能夠進(jìn)行N型糖鏈修飾的部位結(jié)合有N型糖鏈的情 況多，能夠進(jìn)行N型糖鏈修飾的部位中，結(jié)合有N型糖鏈的部位增加，因此能夠?qū)⑵渥鳛橹?標(biāo)而檢測(cè)胰腺癌。
[0045] 另外，本發(fā)明為一種癌的檢測(cè)方法，其特征在于，求出下述A、B中的A與B的比。
[0046] A =糖蛋白的能夠進(jìn)行N型糖鏈修飾的部位的、結(jié)合有N型糖鏈的部位或沒(méi)有結(jié)合 N型糖鏈的部位的量
[0047] B =糖蛋白的能夠進(jìn)行N型糖鏈修飾的部位的量
[0048] 作為癌，沒(méi)有特別的限定，特別是能夠檢測(cè)胰腺癌。對(duì)于作為測(cè)定對(duì)象的糖蛋白， 沒(méi)有特別的限定，優(yōu)選為胰臟特異性的RNase 1。
[0049] 另外，優(yōu)選為A =沒(méi)有結(jié)合N型糖鏈的部位的量，胰腺癌患者與健康人相比A/B值 減小的方法。另外，優(yōu)選為A =結(jié)合有N型糖鏈部位的量，胰腺癌患者與健康人相比A/B值 增大的方法。
[0050] B =胰臟特異性的RNase 1的能夠進(jìn)行N型糖鏈修飾的部位的量的情況下，對(duì)于 其求出方法沒(méi)有特別的限定，例如，可以求出胰臟特異性的RNase 1的量，換算該值而作為 B的值。具體而言，胰臟特異性的RNase 1，如前所述，具有3個(gè)能夠進(jìn)行N型糖鏈修飾的部 位（序列號(hào)2的第34位，第76位，第88位的天冬酰胺殘基），所以測(cè)定作為測(cè)定對(duì)象的其 任一個(gè)或2個(gè)部位或者所有的部位的量時(shí)，與其相應(yīng)地，B =胰臟特異性的RNase 1的能夠 進(jìn)行N型糖鏈修飾的部位的量也可以分別換算成胰臟特異性的RNase 1的量的1倍、2倍或 3倍。需要說(shuō)明的是，胰臟特異性的RNase 1的量例如可以通過(guò)使用免疫學(xué)的測(cè)定法、質(zhì)譜 分析的方法而求出。
[0051] 需要說(shuō)明的是，胰臟特異性的RNase 1如前所述具有3個(gè)能夠進(jìn)行N型糖鏈修飾 的部位（序列號(hào)2的第34位，第76位，第88位的天冬酰胺殘基）。其任一個(gè)或兩個(gè)部位或 者所有的部位中，可以通過(guò)測(cè)定結(jié)合有N型糖鏈的部位的量或沒(méi)有結(jié)合N型糖鏈的部位的 量，或者可以通過(guò)求出該量與胰臟特異性的RNase 1的能夠進(jìn)行N型糖鏈修飾的部位的量 的比而檢測(cè)癌。特別是，作為能夠進(jìn)行N型糖鏈修飾的部位，如果對(duì)于序列號(hào)2的第88位 的天冬酰胺殘基測(cè)定上述的量，則可見(jiàn)癌患者與健康人的這些值存在顯著的差異，所以作 為癌的檢測(cè)方法而優(yōu)選。同樣地，也優(yōu)選針對(duì)序列號(hào)2的第76位或第34位的天冬酰胺殘 基測(cè)定上述的量。
[0052] 另外，本發(fā)明為一種單克隆抗體或其片段，其將胰臟特異性的RNase 1的能夠進(jìn) 行N型糖鏈修飾的部位作為抗原識(shí)別位點(diǎn)的一部分。對(duì)于這樣的單克隆抗體，例如，可以 將胰臟特異性的RNase 1或包含其能夠進(jìn)行N型糖鏈修飾的部位的附近的肽序列作為免 疫原，按照常規(guī)方法進(jìn)行制作。另外，抗體的抗原特異性可以使用標(biāo)準(zhǔn)分析例如，ELISA或 FACS分析確定該抗體與抗原決定基的結(jié)合。另外，作為單克隆抗體的片段，可列舉出：用各 種各樣的酶將全部抗體消化而得到的Fab或F(ab'） 2片段等。這樣的單克隆抗體或其片段 中，本發(fā)明中，特別優(yōu)選在胰臟特異性的RNase 1的能夠進(jìn)行N型糖鏈修飾的部位沒(méi)有結(jié)合 糖鏈的情況下與該部位結(jié)合，在結(jié)合有N型糖鏈的情況下與該部位的結(jié)合被阻礙。
[0053] 進(jìn)而，這樣的單克隆抗體或其片段中，本發(fā)明中，抗原識(shí)別位點(diǎn)優(yōu)選為包含序列號(hào) 2所示的序列的第88位的天冬酰胺殘基的區(qū)域。特別優(yōu)選為將胰臟特異性的RNase 1的能 夠進(jìn)行糖鏈修飾的部位中位于羧基最末端側(cè)的部位的氨基酸序列（序列號(hào)3)包含于識(shí)別 位點(diǎn)的一部分的單克隆抗體或其片段。作為這樣的單克隆抗體，可列舉出：本發(fā)明中制作的 抗人胰臟特異性的RNase 1單克隆抗體RrhRN0723。該單克隆抗體RrhRN0723的胰臟特異 性的RNase 1的能夠進(jìn)行N型糖鏈修飾的部位中，序列號(hào)2的第88位的天冬酰胺殘基結(jié)合 有N型糖鏈的情況下，與胰臟特異性的RNase 1的結(jié)合被阻礙。
[0054] 另外，本發(fā)明為一種單克隆抗體或其片段，其特征在于，能夠與將胰臟特異性的 RNase 1的能夠進(jìn)行N型糖鏈修飾的部位作為抗原識(shí)別位點(diǎn)的一部分的單克隆抗體或其片 段同時(shí)地結(jié)合于胰臟特異性的RNase 1。這樣的單克隆抗體例如篩選如下的單克隆抗體即 可：將胰臟特異性的RNase 1作為免疫原、按照常規(guī)方法制作的、能夠與識(shí)別上述的胰臟特 異性的RNase 1的能夠進(jìn)行N型糖鏈修飾的部位的單克隆抗體或其片段同時(shí)地結(jié)合于胰臟 特異性的RNase。另外，單克隆抗體的片段，可列舉出例如，用各種各樣的酶將全部抗體消化 而得到的Fab或F(ab'） 2片段等。作為這樣的單克隆抗體，可列舉出：本發(fā)明中制作的抗人 胰臟特異性的RNase 1單克隆抗體MrhRN0614。該單克隆抗體MrhRN0614能夠與前述的單 克隆抗體RrhRN0723同時(shí)地結(jié)合于胰臟特異性的RNase 1。
[0055] 本發(fā)明中，這樣的單克隆抗體或其片段可以用堿性磷酸酶、過(guò)氧化物酶、生物素、 異硫氰酸熒光素等標(biāo)記。
[0056] 另外，本發(fā)明為一種癌的檢測(cè)方法，使（a)將胰臟特異性的RNase 1的能夠進(jìn)行N 型糖鏈修飾的部位作為抗原識(shí)別位點(diǎn)的一部分的單克隆抗體或其片段與試樣接觸，測(cè)定與 (a)的單克隆抗體或其片段形成復(fù)合體的胰臟特異性的RNase 1。作為這樣的方法，可列舉 出例如：競(jìng)爭(zhēng)法、抗體芯片法（antibody array method)。
[0057] 另外，本發(fā)明為一種癌的檢測(cè)方法，在上述（a)的單克隆抗體或其片段的基礎(chǔ)上， 使作為（b)的能夠與（a)同時(shí)地結(jié)合于胰臟特異性的RNase 1的單克隆抗體或其片段與 試樣接觸，測(cè)定與（a)和（b)的2種單克隆抗體或抗體片段形成復(fù)合體的、胰臟特異性的 RNase 1的能夠進(jìn)行糖鏈修飾的、結(jié)合有N型糖鏈的部位或沒(méi)有結(jié)合的部位的量。此時(shí)，（a) 和（b)的單克隆抗體或其片段可以同時(shí)地與試樣接觸，但優(yōu)選依次使之接觸。依次使之接 觸的情況下，包括：使試樣與（a)或（b)的一者接觸的第一接觸工序；和，接著使第一接觸 工序中得到的物質(zhì)與（a)或（b)的另一者接觸的第二接觸工序。此時(shí)，優(yōu)選在第一接觸工序 中使試樣與（b)接觸，接著在第二接觸工序中使其與（a)接觸。作為（a)、(b)，可以使用前 述的本發(fā)明的單克隆抗體或其片段；特別是，作為（a)進(jìn)而優(yōu)選使用單克隆抗體RrhRN0723 或其片段，作為（b)進(jìn)而優(yōu)選使用單克隆抗體MrhRN0614或其片段。作為這樣的方法，例如， 除了 ELISA法、EIA法之外，還可以通過(guò)液相色譜法、高效液相色譜法、免疫層析法等，分離 并測(cè)定形成的免疫復(fù)合體。
[0058] 這樣，將胰臟特異性的RNase 1的能夠進(jìn)行N型糖鏈修飾的部位作為抗原識(shí)別位 點(diǎn)的一部分的單克隆抗體或其片段可以作為診斷藥物等藥品使用。
[0059] 本發(fā)明中，作為求出糖蛋白的能夠進(jìn)行N型糖鏈修飾的、結(jié)合有N型糖鏈的部位或 沒(méi)有結(jié)合N型糖鏈的部位的量的方法，沒(méi)有特別的限定，可以為使用了如上述的免疫分析 的方法，也可以通過(guò)質(zhì)譜分析法而求出。通過(guò)質(zhì)譜分析法求出的情況下，例如用酶等分解 糖蛋白，用質(zhì)譜分析器等測(cè)定得到的肽片段和/或糖肽片段的質(zhì)量，由此能夠求出糖蛋白 的能夠進(jìn)行N型糖鏈修飾的、結(jié)合有N型糖鏈的部位或沒(méi)有結(jié)合N型糖鏈的部位的量。使 用質(zhì)譜分析器的方法中，作為由糖蛋白得到肽片段的方法，可列舉出例如：如J. Pr〇teome Res. 3, 556-566 (2004)所報(bào)告那樣，利用糖苷酶的一系列去除糖鏈的處理和利用內(nèi)切型肽 酶的蛋白質(zhì)的肽骨架的片段化。如果列舉利用糖苷酶的一系列去除糖鏈的處理的一例，則 有如下方法：使用選自作為外切型糖苷酶的唾液酸酶、半乳糖苷酶、氨基己糖苷酶、甘露糖 苷酶、巖藻糖苷酶中的一種以上的酶、以及對(duì)于N型糖鏈的主干結(jié)構(gòu)部分的殼二糖結(jié)構(gòu)起 作用的內(nèi)切型糖苷酶例如內(nèi)切糖苷酶H等，使N-乙?；咸烟前返膯翁墙Y(jié)構(gòu)殘留于能夠進(jìn) 行N型糖鏈修飾的部位的天冬酰胺殘基上。該方法中，由于N-乙?；咸烟前返膯翁墙Y(jié)構(gòu) 殘留于蛋白質(zhì)的肽骨架上，所以通過(guò)任意的內(nèi)切型肽酶處理而得到的片段中，由氨基酸序 列通過(guò)計(jì)算求出的推定分子量檢測(cè)與N-乙酰基葡萄糖胺的分子量相應(yīng)地質(zhì)量增加了的糖 肽片段，由此能夠判斷特定的能夠進(jìn)行N型糖鏈修飾的部位中的糖鏈的附加狀態(tài)。通過(guò)以 上所列舉的方法分析胰臟特異性的RNase 1，由此能夠通過(guò)質(zhì)譜分析法確認(rèn)糖鏈附加狀態(tài) 的有無(wú)。
[0060] 發(fā)明的效果
[0061] 通過(guò)本發(fā)明，能夠進(jìn)行癌的檢測(cè)、特別是胰腺癌的檢測(cè)。另外，通過(guò)本發(fā)明，能夠提 供將胰臟特異性的RNase 1的能夠進(jìn)行N型糖鏈修飾的部位作為抗原識(shí)別位點(diǎn)的一部分的 單克隆抗體、及能夠與該單克隆抗體同時(shí)地結(jié)合于胰臟特異性的RNase 1的單克隆抗體。 使用這2種抗體，能夠進(jìn)行前述的癌的檢測(cè)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0062] 圖1為表示實(shí)施例2中測(cè)定抗人胰臟特異性的RNase 1抗體對(duì)于導(dǎo)入糖鏈修飾缺 失突變的抗原的結(jié)合性的結(jié)果的圖。
[0063] 圖2為表不實(shí)施例2中測(cè)定抗人胰臟特異性的RNase 1抗體對(duì)于導(dǎo)入氨基酸置換 突變的抗原的結(jié)合性的結(jié)果的圖。
[0064] 圖3為表不實(shí)施例2中對(duì)于導(dǎo)入糖鏈修飾缺失突變的抗原mOOl的糖鏈結(jié)合狀態(tài) 進(jìn)行分析的結(jié)果的圖。
[0065] 圖4為表示實(shí)施例2中對(duì)于各組分中的α -甲基甘露糖苷的濃度、與抗人胰臟特 異性的RNase 1抗體的結(jié)合性進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果的圖。
[0066] 圖5為表示實(shí)施例3中測(cè)定被檢體中的糖鏈修飾胰臟特異性的RNase 1的結(jié)果的 圖。
[0067] 圖6為表示實(shí)施例3中胰腺癌與非胰腺癌的測(cè)定值的分布和2組間的顯著性差異 的圖。
[0068] 圖7為表不實(shí)施例3中胰腺癌與非胰腺癌的ROC統(tǒng)計(jì)分析的結(jié)果的圖。
[0069] 圖8為表示實(shí)施例4中，用免疫印跡法（Western blot)研究抗人胰臟特異性的 RNase 1肽抗體的抗原識(shí)別性能的結(jié)果的圖。
[0070] 圖9為表示實(shí)施例4中，通過(guò)使用了抗人胰臟特異性的RNase 1肽抗體的免疫印 跡法，考察定健康人血清和胰腺癌患者血清中的胰臟特異性的RNasel的Asn88中有無(wú)糖鏈 結(jié)合的結(jié)果的圖。
[0071] 圖10為表示實(shí)施例5中，抗人胰臟特異性的RNase 1抗體RrhRNllll對(duì)于導(dǎo)入糖 鏈修飾缺失突變的抗原的結(jié)合性的結(jié)果的圖。
[0072] 圖11為表示實(shí)施例5中，由健康人和胰腺癌的RNase 1的測(cè)定值求出F3/t值和 G3/t值的結(jié)果的圖。
[0073] 圖12為表示實(shí)施例6中，通過(guò)使用了 RrhRN0723抗體的抗原固相競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定競(jìng)爭(zhēng) 抗原的稀釋系列的結(jié)果的圖。

【具體實(shí)施方式】
[0074] 實(shí)施例1
[0075] 實(shí)施例1抗體的制備
[0076] 免疫原的調(diào)制
[0077] 為了取得包含人胰臟特異性的RNase 1全長(zhǎng)的多肽，在昆蟲細(xì)胞中能夠表達(dá)的 質(zhì)粒載體中插入編碼成熟型人胰臟特異性的RNase 1(序列號(hào)2)的基因序列，從而制 備表達(dá)質(zhì)粒。詳細(xì)地說(shuō)，在昆蟲細(xì)胞重組蛋白質(zhì)表達(dá)用質(zhì)粒即pIZ/V5His vector(Life Technologies Japan Ltd.)的多克隆位點(diǎn)從5'上游側(cè)起依序插入編碼人免疫球蛋白κ 鏈（kappa chain)的基因序列、編碼His標(biāo)記的基因序列、編碼FLAG標(biāo)記的基因序列、編 碼人胰臟特異性的RNase 1的基因序列（序列號(hào)1)中去除了相當(dāng)于作為信號(hào)肽的氨基 酸第1位至第28為止的84個(gè)核酸殘基的基因的區(qū)域（序列號(hào)2)。對(duì)于所制備的表達(dá) 質(zhì)粒pIZ-KFH-hRNase 1確認(rèn)到重組體人胰臟特異性的RNase 1被分泌至培養(yǎng)基中，所 述重組體人胰臟特異性的RNase 1是通過(guò)對(duì)昆蟲細(xì)胞株Sf9使用Cellfectin II (Life Technologies Japan Ltd.)實(shí)施基因?qū)攵贜末端側(cè)附加有人免疫球蛋白κ鏈而成的。 從培養(yǎng)上清中將被分泌至培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)通過(guò)使用了抗人免疫球蛋白κ輕鏈抗體的親 和純化進(jìn)行濃縮純化，制成為免疫原。
[0078] 對(duì)免疫動(dòng)物的免疫
[0079] 使用上述的免疫原對(duì)小鼠和大鼠實(shí)施免疫。詳細(xì)而言,為對(duì)小鼠進(jìn)行免疫的情況 下，將IOOyg的免疫原與弗氏完全佐劑（Complete Freund's adjuvant) -起，對(duì)6周齡 Balb/c雌小鼠腹腔進(jìn)行給予,作為初次免疫。之后,在7天后、14天后、21天后、28天后、35 天后將免疫原100 μ g與弗氏不完全佐劑（incomplete Freund's adjuvant) -起進(jìn)行腹腔 給予，作為追加免疫。進(jìn)而，在42天后,將免疫原100 μ g與生理鹽水一起進(jìn)行腹腔給予,作 為最終免疫。對(duì)大鼠進(jìn)行免疫的情況下，將100 μ g的免疫原與弗氏完全佐劑一起，對(duì)6周 齡WHY雌大鼠兩后肢足墊進(jìn)行給予,作為初次免疫。之后,在28天后將免疫原IOOyg與生 理鹽水一起對(duì)后肢足墊進(jìn)行給予，作為最終免疫。
[0080] 抗體產(chǎn)生雜交瘤的制備
[0081] 最終免疫3天后，由小鼠摘除脾臟，回收脾臟細(xì)胞。由大鼠摘除髂淋巴結(jié)（iliac lymph nodes)和鼠腹股溝淋巴結(jié)（inguinal lymph nodes),得到淋巴結(jié)細(xì)胞。使小鼠脾臟 細(xì)胞和大鼠淋巴結(jié)細(xì)胞分別與小鼠骨髓瘤細(xì)胞株通過(guò)電細(xì)胞融合法融合之后，用添加了次 黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷的GIT培養(yǎng)基（和光純藥工業(yè)株式會(huì)社）接種至細(xì)胞培 養(yǎng)用96孔板，由此選擇融合細(xì)胞。
[0082] 小鼠抗人胰臟特異性的RNase 1抗體產(chǎn)生融合細(xì)胞株的選定
[0083] 小鼠抗人胰臟特異性的RNase 1抗體產(chǎn)生融合細(xì)胞株如下選擇：以融合細(xì)胞在培 養(yǎng)基中分泌的抗體對(duì)于重組體人胰臟特異性的RNase 1的反應(yīng)性作為指標(biāo)，利用ELISA法 進(jìn)行篩選，從而選擇。篩選中所使用的ELISA如下。向96孔微量滴定板（Greiner bio-one 制）的各孔中加入包含25ng的山羊抗人免疫球蛋白κ鏈抗體（Sigma-Aldrich Japan K.K.制）的磷酸緩沖液（50mM磷酸鈉、150mM NaCl、pH7. 4)5(^1，在4°〇下固定16小時(shí)。 將這些孔用300μ 1的洗滌液（20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH7. 4)洗滌3次之后，加入包 含3%85六的封閉溶液（3%85六，20禮1^8-!1(：1，15〇1111恥(：14!17.4)20(^1，在室溫下放 置2小時(shí)進(jìn)行封閉（抗人免疫球蛋白κ鏈抗體固相化板）。將各孔用300 μ 1的洗滌液洗 滌 3 次之后，加入用稀釋液（l%BSA、20mM Tris-HCl，150mM NaCl、0. 05%Tween-20、pH7. 4) 以0. 5 μ g/ml的方式稀釋的重組體人胰臟特異性的RNase 1，在室溫下放置I小時(shí)。將各 孔用包含30(^1的表面活性劑的洗滌液（20禮1^8-!1(：1，1501111恥(：1、0.05%了￥6611-20、 pH7. 4)洗滌3次之后，加入50 μ 1的融合細(xì)胞培養(yǎng)上清，在室溫下放置1小時(shí)。接著，將各 孔用300 μ 1的包含表面活性劑的洗滌液洗滌3次之后，加入包含0. 01 μ g的用辣根過(guò)氧化 物酶（HRP)標(biāo)記過(guò)的抗小鼠 IgG抗體（Rockland公司制）的稀釋液50 μ 1，在室溫下放置1 小時(shí)。最后，將各孔用300 μ 1的包含表面活性劑的洗滌液洗滌3次之后，添加50 μ 1的四 甲基聯(lián)苯胺（TMB)溶液（KPL公司制），使之顯色15分鐘之后，添加 IM的磷酸溶液而停止反 應(yīng)，測(cè)定450nm的吸光度。根據(jù)篩選的結(jié)果，得到產(chǎn)生對(duì)胰臟特異性的RNase 1表現(xiàn)出強(qiáng)的 親和性的抗體的融合細(xì)胞。得到的融合細(xì)胞通過(guò)有限稀釋法被單克隆化，得到單克隆抗體 MrhRN0614〇
[0084] 大鼠抗人胰臟特異性的RNase 1抗體產(chǎn)生融合細(xì)胞株的選定
[0085] 對(duì)于大鼠抗人胰臟特異性的RNase 1抗體產(chǎn)生融合細(xì)胞株，以融合細(xì)胞在培養(yǎng)基 中分泌的抗體對(duì)于來(lái)源于人胰腺癌細(xì)胞（Capanl)的胰臟特異性的RNase 1的反應(yīng)性作為 指標(biāo)，通過(guò)ELISA法進(jìn)行篩選，從而選擇。篩選中所使用的ELISA如下。向96孔微量滴定 板（Greiner bio-one制）的各孔中加入包含25ng的小鼠抗人胰臟特異性的RNase 1抗 體（MrhRN0614)的磷酸緩沖液（50mM磷酸鈉、150mMNaCl、pH7. 4)50μ 1，在4°C下固定16小 時(shí)。將這些孔用300μ 1的洗滌液（20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH7. 4)洗滌3次之后，力口 入包含 3%BSA 的封閉溶液（3%BSA，20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH7.4)200yl，在室溫 下放置2小時(shí)進(jìn)行封閉（抗人胰臟特異性的RNase 1抗體固相化板）。將各孔用300 μ 1的 洗滌液（20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH7. 4)洗滌 3 次之后，加入用稀釋液（1% BSA、20mM Tris-HCl，150mM NaCl、0. 05 % Tween-20、ρΗ7· 4)稀釋至 2 倍的人胰腺癌細(xì)胞（Capanl) 的培養(yǎng)上清，在室溫下放置1小時(shí)。將各孔用300 μ 1的包含表面活性劑的洗滌液（20mM Tris-HCl，150mM NaCl、0. 05% Tween-20、ρΗ7· 4)洗滌 3 次之后，加入 50μ 1 的融合細(xì)胞培 養(yǎng)上清，在室溫下放置1小時(shí)。接著，將各孔用300 μ 1的包含表面活性劑的洗滌液洗滌3次 之后，加入包含0.01 μ g的被HRP標(biāo)記過(guò)的抗大鼠 IgG抗體（American Qualex Antibodies 公司制）的稀釋液50 μ 1，在室溫下放置1小時(shí)。最后，將各孔用300 μ 1的包含表面活性劑 的洗滌液洗滌3次之后，添加50 μ 1的TMB溶液使之顯色15分鐘之后，添加 IM的磷酸溶液 而停止反應(yīng)，測(cè)定450nm處的吸光度。根據(jù)篩選的結(jié)果，得到產(chǎn)生對(duì)胰臟特異性的RNase 1 表現(xiàn)出強(qiáng)的親和性的抗體的融合細(xì)胞。得到的融合細(xì)胞通過(guò)有限稀釋法被單克隆化，得到 單克隆抗體RrhRN0723。
[0086] 實(shí)施例2抗體的特異性測(cè)定
[0087] 利用哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)的重組體人胰臟特異性的RNase 1的調(diào)制
[0088] 為了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中取得包含人胰臟特異性的RNase 1全長(zhǎng)的多肽，在 pcDNA3.1_mycHis載體（Life Technologies Japan Ltd.)中插入編碼人胰臟特異性的 RNase 1的基因序列（序列號(hào)2)，制備表達(dá)載體。更詳細(xì)而言，將用于免疫原的調(diào)制而制 備的昆蟲細(xì)胞表達(dá)用質(zhì)粒（pIZ-KFH-hRNase 1)的編碼重組體蛋白質(zhì)的基因序列部分通過(guò) 分子生物學(xué)的手法插入至pcDNA3. InycHis載體（Life Technologies Japan Ltd.)中， 從而制備pcDNA-KFH-hRNase 1。對(duì)于所制備的哺乳動(dòng)物細(xì)胞用表達(dá)質(zhì)粒確認(rèn)到有重組體 人胰臟特異性的RNasel被分泌至培養(yǎng)基中；所述重組體人胰臟特異性的RNase 1是通過(guò) 對(duì)來(lái)源于中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢的培養(yǎng)細(xì)胞株（以下、CH0-K1株）使用Lipofectamine 2000 (Life Technologies Japan Ltd.)實(shí)施基因?qū)攵贜末端側(cè)附加有人免疫球蛋白κ鏈而成的。 從培養(yǎng)上清中將被分泌至培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)通過(guò)使用了抗人免疫球蛋白κ輕鏈抗體的親 和純化進(jìn)行濃縮純化，得到重組體人胰臟特異性的RNasel。被純化的重組體人胰臟特異性 的RNase 1供于用于明確抗體的特異性的實(shí)驗(yàn)中。
[0089] 糖鏈修飾缺失突變抗原的調(diào)制
[0090] 將前項(xiàng)制備的表達(dá)載體（pcDNA-KFH-hRNase 1)作為模板，用PCR突變導(dǎo)入法重復(fù) 導(dǎo)入氨基酸置換突變，制備表達(dá)導(dǎo)入了糖鏈修飾缺失突變的抗原的質(zhì)粒。PCR突變導(dǎo)入法 中，使用 PrimeSTAR Mutagenesis Basal Kit(TAKARA BIO INC.)，按照附加的說(shuō)明書進(jìn)行實(shí) 施。詳細(xì)而言，通過(guò)將能夠進(jìn)行N型糖鏈修飾的部位的共有序列（Asn-Xaa-Ser/Thr、Xaa是 指脯氨酸以外的氨基酸殘基）的第3位的氨基酸殘基置換成絲氨酸殘基或蘇氨酸殘基以外 的氨基酸，從而制備表達(dá)糖鏈修飾缺失突變重組體人胰臟特異性的RNase 1的質(zhì)粒（表1)。 對(duì)于所制備的導(dǎo)入了糖鏈修飾缺失突變的表達(dá)質(zhì)粒，確認(rèn)到有糖鏈修飾缺失突變重組體人 胰臟特異性的RNase 1被分泌至培養(yǎng)基中，所述糖鏈修飾缺失突變重組體人胰臟特異性的 RNase 1 是通過(guò)對(duì) CH0-K1 株使用 Lipofectamine2000 (Life Technologies Japan Ltd.)實(shí) 施基因?qū)攵贜末端側(cè)附加有人免疫球蛋白κ鏈而成的。被分泌至培養(yǎng)基中的糖鏈修 飾缺失突變重組體人胰臟特異性的RNase 1供于用于明確抗體的特異性的實(shí)驗(yàn)中。
[0091] [表 1]
[0092]

【權(quán)利要求】
1. 一種癌的檢測(cè)方法，其特征在于，測(cè)定糖蛋白的能夠進(jìn)行N型糖鏈修飾的部位的、結(jié) 合有N型糖鏈的部位或沒(méi)有結(jié)合N型糖鏈的部位的量。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，癌為胰腺癌。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，糖蛋白為胰臟特異性的核糖核酸酶1。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其中，胰腺癌患者與健康人相比，結(jié)合有N型糖鏈 的部位的量增加。
5. -種癌的檢測(cè)方法，其特征在于，求出下述A、B中的A與B的比： A =糖蛋白的能夠進(jìn)行N型糖鏈修飾的部位的、結(jié)合有N型糖鏈的部位或沒(méi)有結(jié)合N型 糖鏈的部位的量， B =糖蛋白的能夠進(jìn)行N型糖鏈修飾的部位的量。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，癌為胰腺癌。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其中，糖蛋白為胰臟特異性的核糖核酸酶1。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其為A =沒(méi)有結(jié)合N型糖鏈的部位的量，胰腺癌患 者與健康人相比A/B的值減小的方法。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其為A =結(jié)合有N型糖鏈的部位的量，胰腺癌患者 與健康人相比A/B的值增大的方法。
10. 根據(jù)權(quán)利要求7?9中的任一項(xiàng)所述的方法，其為求出胰臟特異性的核糖核酸酶1 的量、換算該值作為B的值的方法。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1?10中的任一項(xiàng)所述的方法，其中，能夠進(jìn)行N型糖鏈修飾的部位 為選自序列號(hào)2所示的序列的第34位、第76位和第88位的1個(gè)以上的天冬酰胺殘基。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，能夠進(jìn)行N型糖鏈修飾的部位為序列號(hào)2所示 的序列的第88位的天冬酰胺殘基。
13. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，能夠進(jìn)行N型糖鏈修飾的部位為序列號(hào)2所示 的序列的第76位的天冬酰胺殘基。
14. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，能夠進(jìn)行N型糖鏈修飾的部位為序列號(hào)2所示 的序列的第34位的天冬酰胺殘基。
15. -種單克隆抗體或其片段，其將胰臟特異性的核糖核酸酶1的能夠進(jìn)行N型糖鏈修 飾的部位作為抗原識(shí)別位點(diǎn)的一部分。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的單克隆抗體或其片段，其中，在胰臟特異性的核糖核酸酶1 的能夠進(jìn)行N型糖鏈修飾的部位沒(méi)有結(jié)合糖鏈的情況下，單克隆抗體或其片段與該部位結(jié) 合，在胰臟特異性的核糖核酸酶1的能夠進(jìn)行N型糖鏈修飾的部位結(jié)合有N型糖鏈的情況 下，單克隆抗體或其片段與該部位的結(jié)合被阻礙。
17. 根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的單克隆抗體或其片段，其中，抗原識(shí)別位點(diǎn)為包含序 列號(hào)2所示的序列的第88位的天冬酰胺殘基的區(qū)域。
18. -種單克隆抗體或其片段，其特征在于，能夠與權(quán)利要求15?17中的任一項(xiàng)所述 的單克隆抗體或其片段同時(shí)地結(jié)合于胰臟特異性的核糖核酸酶1。
19. 根據(jù)權(quán)利要求1?14中的任一項(xiàng)所述的方法，其中，使（a)權(quán)利要求15?17中的 任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或其片段與試樣接觸，測(cè)定與（a)的單克隆抗體或其片段形成了 復(fù)合體的胰臟特異性的核糖核酸酶1。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中，進(jìn)一步使（b)權(quán)利要求18所述的單克隆抗體 或其片段與試樣接觸，測(cè)定與（a)和（b)的兩種單克隆抗體或抗體片段形成了復(fù)合體的胰 臟特異性的核糖核酸酶1。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其包括：使試樣與（a)或（b)的一者接觸的第一接 觸工序；和使第一接觸工序中得到的物質(zhì)與（a)或（b)的另一者接觸的第二接觸工序。
22. -種藥品，其特征在于，含有權(quán)利要求15?17中的任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或其 片段。
23. 根據(jù)權(quán)利要求1?14中的任一項(xiàng)所述的方法，其中，通過(guò)質(zhì)譜分析法求出糖蛋白的 能夠進(jìn)行N型糖鏈修飾的部位的、結(jié)合有N型糖鏈的部位或沒(méi)有結(jié)合N型糖鏈的部位的量。
24. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其為通過(guò)質(zhì)譜分析法測(cè)定糖蛋白的肽片段和/或糖 肽片段的質(zhì)量的方法。
【文檔編號(hào)】A61K39/395GK104364374SQ201380030868
【公開(kāi)日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2013年6月10日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月11日
【發(fā)明者】仲田大輔 申請(qǐng)人:東曹株式會(huì)社