使用間變性淋巴瘤激酶(alk)作為標(biāo)志物鑒定治療響應(yīng)性非小細(xì)胞肺癌的方法
【專利說(shuō)明】使用間變性淋巴瘤激酶（ALK)作為標(biāo)志物鑒定治療響應(yīng)性 非小細(xì)胞肺癌的方法
[0001] 對(duì)相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求2012年9月24日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No. 61/704,960的權(quán)益，通過(guò) 提及將其完整收入本文。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本申請(qǐng)涉及用于非小細(xì)胞肺癌預(yù)后的方法，特別是確定非小細(xì)胞肺癌是否預(yù)測(cè)為 響應(yīng)間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase)抑制劑的方法的實(shí)施方案。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 間變性淋巴瘤激酶（ALK)蛋白是受體酪氨酸激酶胰島素受體超家族的一個(gè)成員。 ALK是一種通常僅在神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)的I型膜糖蛋白。在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC)細(xì)胞系和 存檔的臨床標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)了染色體2p內(nèi)的倒位，其導(dǎo)致包含ALK基因和棘皮動(dòng)物微管關(guān)聯(lián)蛋 白樣4 (EML4)基因的部分的融合基因產(chǎn)物的形成（Soda等，Nature 448:561-566,2007)。 現(xiàn)在公認(rèn)ALK為NSCLC中的重要參與者，并且雖然EML4是主要的融合配偶體，但是已經(jīng)鑒 定出其它融合配偶基因。ALK基因重排的發(fā)生率的范圍表現(xiàn)為2-7%，轉(zhuǎn)化成在美國(guó)的約 6, 000例ALK陽(yáng)性患者/年和全世界的約40, 000例患者/年。重要地，ALK基因重排很少 與EGFR、HER2、或KRAS突變同時(shí)發(fā)生，證明了 ALK陽(yáng)性是一種獨(dú)特的疾病亞型。
[0006] 克唑替尼（crizotinib) (XALKORI，Pfizer)是一種抑制ALK的有力受體酪氨酸激 酶抑制劑。在兩項(xiàng)臨床試驗(yàn)中，用克唑替尼治療的ALK陽(yáng)性局部晚期或轉(zhuǎn)移性NSCLC患者分 別展現(xiàn)出 50% (N = 136 ;95% CI:42%，59% )和 61% (N = 119 ;95% CI:52%，70% )的 總體響應(yīng)率。如此，測(cè)定NSCLC患者中的ALK狀態(tài)對(duì)于指導(dǎo)患者護(hù)理是至關(guān)重要的。然而， 仍然需要一種快速且精確鑒定最可能響應(yīng)克唑替尼治療的NSCLC患者的特異的、靈敏的且 標(biāo)準(zhǔn)化的ALK狀態(tài)測(cè)定法。
[0007] 發(fā)明概述
[0008] 本文中公開了用于將受試者鑒定為具有預(yù)測(cè)為響應(yīng)ALK抑制劑（例如克唑替 尼）治療的NSCLC的方法的實(shí)施方案。所述實(shí)施方案包括使用本文中公開的免疫組織化 學(xué)（IHC)和評(píng)分方法將包含NSCLC腫瘤細(xì)胞的樣品鑒定為ALK陽(yáng)性或ALK陰性。若樣品鑒 定為ALK陽(yáng)性，則將受試者鑒定為具有可能響應(yīng)ALK抑制劑治療的NSCLC，且若樣品鑒定為 ALK陰性，則將受試者鑒定為具有可能不響應(yīng)ALK抑制劑治療的NSCLC。在一些例子中，將 樣品用抗ALK抗體標(biāo)記，而且若樣品中存在至少一個(gè)具有強(qiáng)顆粒細(xì)胞質(zhì)染色的腫瘤細(xì)胞， 則將樣品鑒定為ALK陽(yáng)性。
[0009] 所公開的方法的一些實(shí)施方案還包括選擇具有ALK陽(yáng)性NSCLC腫瘤的受試者用 ALK抑制劑治療。所公開的方法的別的實(shí)施方案還包括治療鑒定為具有預(yù)測(cè)為響應(yīng)治療的 NSCLC的受試者，諸如通過(guò)對(duì)具有ALK陽(yáng)性NSCLC腫瘤的受試者單獨(dú)或與其它已知或未來(lái)開 發(fā)的治療組合施用ALK抑制劑（諸如克唑替尼）。
[0010] 公開內(nèi)容的前述和其它特征從參考附圖進(jìn)行的以下詳細(xì)描述看會(huì)變得更為顯而 易見。
[0011] 附圖簡(jiǎn)述
[0012] 圖IA和IB是兩種例示性ALK陽(yáng)性病例的數(shù)字圖像，其顯示了抗ALK(D5F3)染色 (左側(cè)小圖）和匹配的家兔單克隆陰性對(duì)照Ig染色（右側(cè)小圖）上的同質(zhì)ALK IHC表達(dá)。
[0013] 圖2A-C是三種例示性ALK陽(yáng)性病例的數(shù)字圖像，其顯示了抗ALK(D5F3)染色（左 側(cè)小圖）和匹配的家兔單克隆陰性對(duì)照Ig染色（右側(cè)小圖）上的異質(zhì)ALK IHC表達(dá)。抗 ALK染色樣品中存在強(qiáng)細(xì)胞質(zhì)染色，但是強(qiáng)度有所變化。
[0014] 圖3是數(shù)字圖像，其顯示了用抗ALK(D5F3)抗體染色的樣品中的腺上皮細(xì)胞中的 點(diǎn)狀顆粒染色（左側(cè)小圖）。在匹配家兔單克隆陰性對(duì)照Ig載玻片中看到不太明顯的腺上 皮細(xì)胞染色（右側(cè)小圖）。腺上皮染色存在于正常組織成分而非癌細(xì)胞中，并且在載玻片解 讀中排除。
[0015] 圖4A是數(shù)字圖像，其顯示了用抗ALK (D5F3)抗體染色的樣品中明顯的神經(jīng)元組織 成分的染色（左側(cè)小圖）和匹配的家兔單克隆陰性對(duì)照Ig載玻片中染色的缺乏（右側(cè)小 圖）。圖4B是數(shù)字圖像，其顯示了用抗ALK(D5F3)抗體染色的樣品中（左側(cè)小圖）及匹配 的家兔單克隆陰性對(duì)照Ig載玻片中（右側(cè)小圖）的神經(jīng)組織的染色。在載玻片解讀中排 除染色，因?yàn)樗嬖谟谡５慕M織成分或細(xì)胞中。
[0016] 圖5是數(shù)字圖像，其顯示了用抗ALK(D5F3)抗體染色的樣品中的肺泡巨噬細(xì)胞中 存在的顆粒點(diǎn)刻（左側(cè)小圖）和匹配的家兔單克隆陰性對(duì)照Ig載玻片中染色的缺乏（右 側(cè)小圖）。在載玻片解讀中排除此染色，因?yàn)樗嬖谡＜?xì)胞，而非腫瘤細(xì)胞中。
[0017] 圖6A是數(shù)字圖像，其顯示了用抗ALK(D5F3)抗體染色的樣品中（左側(cè)小圖）及匹 配的家兔單克隆陰性對(duì)照Ig載玻片中（右側(cè)小圖）的粘蛋白染色。正常組織和腫瘤細(xì)胞 中沒有染色，因此此樣品解讀為ALK陰性。圖6B是數(shù)字圖像，其顯示了用抗ALK (D5F3)抗 體染色的樣品中（左側(cè)小圖）及匹配的家兔單克隆陰性對(duì)照Ig載玻片中（右側(cè)小圖）的 粘蛋白染色。此樣品解讀為ALK陽(yáng)性，因?yàn)檎＝M織是陰性，但是腫瘤細(xì)胞是染色的。
[0018] 圖7A和B是數(shù)字圖像，其顯示了用抗ALK(D5F3)抗體染色的樣品中一些淋巴細(xì)胞 的染色（左側(cè)小圖）和匹配的家兔單克隆陰性對(duì)照Ig載玻片中不太明顯的（圖7A)或陰 性（圖7B)染色（右側(cè)小圖）。在載玻片解讀中排除此染色，因?yàn)樗嬖谟谡＜?xì)胞中。
[0019] 圖8A和B是兩種例示性ALK陰性病例的數(shù)字圖像，其顯示了在抗ALK (D5F3)染色 (左側(cè)小圖）和匹配的家兔單克隆陰性對(duì)照Ig染色（右側(cè)小圖）上腫瘤細(xì)胞中ALK IHC表 達(dá)缺乏。
[0020] 圖9A和B是例示性ALK陰性病例的數(shù)字圖像，其顯示了抗ALK (D5F3)染色（左側(cè) 小圖）和匹配的家兔單克隆陰性對(duì)照Ig染色（右側(cè)小圖）兩者上的弱顆粒細(xì)胞質(zhì)染色。
[0021] 圖10A-D是例示性ALK陰性病例的數(shù)字圖像，其顯示了抗ALK (D5F3)染色上的細(xì) 胞質(zhì)染色（左側(cè)小圖），其比在匹配的家兔單克隆陰性對(duì)照Ig染色（右側(cè)小圖）上更明顯。 該病例由于缺乏強(qiáng)細(xì)胞質(zhì)染色而被解讀為ALK陰性。
[0022] 圖11是用抗ALK(D5F3)抗體染色的樣品（左側(cè)小圖）和匹配的家兔單克隆陰性 對(duì)照Ig載玻片（右側(cè)小圖）中的膜/細(xì)胞質(zhì)染色的數(shù)字圖像。雖然染色在用抗ALK抗體 比用陰性對(duì)照染色的載玻片上更普遍，但是由于其不是強(qiáng)顆粒細(xì)胞質(zhì)染色，結(jié)果解讀為ALK 陰性。
[0023] 發(fā)明詳述
[0024] I.縮寫
[0025] ALK 間變性淋巴瘤激酶
[0026] DAB 3, 3' -二氨基聯(lián)苯胺四氫氯化物
[0027] FISH 熒光原位雜交
[0028] H&E 蘇木精和曙紅
[0029] HQ 3-羥基喹喔啉-2-羧酸
[0030] HRP 辣根過(guò)氧化物酶
[0031] IHC 免疫組織化學(xué)
[0032] NSCLC 非小細(xì)胞肺癌
[0033] II.術(shù)語(yǔ)
[0034] 提供術(shù)語(yǔ)和方法的以下解釋以更好地描述本公開內(nèi)容并指導(dǎo)本領(lǐng)域普通技術(shù)人 員實(shí)施本公開內(nèi)容。單數(shù)形式"一個(gè)"、"一種"和"所述/該"指一個(gè)/種或超過(guò)一個(gè)/種， 除非上下文另有明確指示。例如，術(shù)語(yǔ)"包含抗體"包括單數(shù)或復(fù)數(shù)種抗體，并且認(rèn)為等同 于短語(yǔ)"包含至少一種抗體"。術(shù)語(yǔ)"或"指陳述的備選成分的單一成分或兩種或更多種成 分的組合，除非上下文另有明確指示。如本文中使用的，"包含"意指"包括"。如此，"包含 A或B"意指"包括A、B、或A和B"，而不排除別的成分。本文中提及的GenBank登錄號(hào)的日 期是至少早在2012年9月24日可得到的序列。
[0035] 除非另有解釋，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本公開內(nèi)容所屬領(lǐng)域的普通 技術(shù)人員的通常理解具有相同的意義。雖然與本文中描述的方法和材料相似或等同的方法 和材料可以在本公開內(nèi)容的實(shí)踐或測(cè)試中使用，但是下文描述了合適的方法和材料。材料、 方法和例子僅是例示性的而并不意圖為限制性的。
[0036] 為了促進(jìn)公開內(nèi)容的各個(gè)實(shí)施方案的審閱，提供了具體術(shù)語(yǔ)的以下解釋：
[0037] 間變性淋巴瘤激酶（ALK):受體酪氨酸激酶的胰島素受體超家族的成員。ALK包 含胞外域、單次跨膜域和胞內(nèi)酪氨酸激酶域。在幾種腫瘤類型，包括間變性大細(xì)胞淋巴瘤、 成神經(jīng)細(xì)胞瘤、和非小細(xì)胞肺癌中找到導(dǎo)致ALK融合基因的染色體重排。ALK/EML4是最常 見的 ALK 基因融合；別的 ALK 融合包括 ALK/RANBP2、ALK/ATIC、ALK/TFG、ALK/NPM1、ALK/ SQSTMl、ALK/KIF5B、ALK/CLTC、ALK/TPM4、和 ALK/MSN。
[0038] ALK序列公開可獲自例如GenBank?序列數(shù)據(jù)庫(kù)（例如登錄號(hào)NP_004295(蛋白 質(zhì)），和NM_004304(核酸））。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以鑒定別的ALK核酸和蛋白質(zhì)序列， 包括ALK變體和/或ALK基因融合。
[0039] ALK抑制劑是一種抑制或降低ALK活性，諸如ALK酪氨酸激酶活性的分子。在一些 例子中，ALK抑制劑可以是小分子、蛋白質(zhì)（諸如抗體）、或核酸（諸如反義分子）。ALK抑 制劑可以抑制或降低配體（諸如多效蛋白）對(duì)ALK的結(jié)合，并且如此降低ALK酪氨酸激酶 活性。ALK抑制劑也可以直接抑制或降低ALK酪氨酸激酶活性，例如ATP競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑（諸 如克唑替尼）。降低或抑制ALK表達(dá)的分子，諸如反義分子也是ALK抑制劑。在一些例子 中，ALK抑制劑抑制或降低經(jīng)遺傳改變的ALK，諸如ALK基因融合（包括但不限于ALK/EML4 基因融合）的活性。ALK抑制劑可以特異性抑制ALK酪氨酸激酶活性或者在抑制ALK酪氨 酸激酶活性外可以抑制其它受體酪氨酸激酶活性（諸如c-Met/HGFR活性）。
[0040] 抗體：免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫學(xué)活性部分，也就是說(shuō)，含有特異 性結(jié)合抗原（諸如ALK)(與其起免疫反應(yīng)）的抗原結(jié)合位點(diǎn)的分子。例示性的抗體包括單 克隆、多克隆、和人源化抗體。
[0041] 天然存在的抗體（諸如IgG、IgM、IgD)包括四條多肽鏈，即通過(guò)二硫鍵互相連 接的兩條重（H)鏈和兩條輕（L)鏈。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)抗體還包括通過(guò)在細(xì)胞中表 達(dá)編碼一條或多條抗體鏈的核酸生成的重組抗體（例如參見美國(guó)專利No. 4, 745, 055 ;美 國(guó)專利 No. 4, 444, 487 ;W0 88/03565 ;EP 256, 654 ;EP 120, 694 ;EP 125, 023 ;Faoulkner 等，Nature 298:286, 1982 ;Morrison, J