化學(xué)合成的HSV2病毒gC糖蛋白胞外區(qū)基因片段及其表達(dá)、應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明化學(xué)合成的HSV2病毒gC糖蛋白胞外區(qū)基因片段及其表達(dá)、應(yīng)用涉及基因工程技術(shù)、疫苗和診斷試劑領(lǐng)域。本發(fā)明是通過計(jì)算機(jī)分析，篩選出HSV2病毒gC糖蛋白內(nèi)的強(qiáng)抗原表位，第28個(gè)氨基酸至第447個(gè)氨基酸，共420個(gè)氨基酸，選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，化學(xué)合成抗原表位的全新基因序列，利用基因工程技術(shù)，表達(dá)該基因片段、制備HSV2病毒gC糖蛋白的強(qiáng)抗原表位片段。表達(dá)的HSV2病毒gC糖蛋白的強(qiáng)抗原表位片段，可用于HSV2疫苗研制、HSV2病毒抗體的檢測(cè)及用于免疫制備抗HSV2病毒單抗和多抗等。
【專利說(shuō)明】化學(xué)合成的HSV2病毒gC糖蛋白胞外區(qū)基因片段及其表達(dá)、應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及的是化學(xué)合成的HSV2病毒gC糖蛋白胞外區(qū)的全新基因片段，利用基因工程技術(shù)，制備重組HSV2病毒gC糖蛋白。通過計(jì)算機(jī)分析，篩選出含強(qiáng)抗原表位的HSV2病毒的gC糖蛋白胞外區(qū)片段，選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，化學(xué)合成全新的基因序列，利用基因工程技術(shù)表達(dá)，表達(dá)的蛋白可用于疫苗及HSV2病毒抗體或抗原的檢測(cè)等，本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)、疫苗和診斷試劑領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]單純皰疫病毒(Herpers simplex virus, HSV)屬于皰疫病毒科α亞科,是人類感染的常見病毒之一，根據(jù)血清型可分為I和II型兩種。其中，I型主要通過口面部感染，也存在性傳播，II型主要通過性傳播，并且和女性宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)。近期越來(lái)越多的研究表明，HSV I對(duì)阿茲海默癥的發(fā)生有關(guān)聯(lián)，HIV的感染和HSV II也有聯(lián)系。HSV在全球普遍流行，HSV I型在成人血清中陽(yáng)性率高達(dá)85%以上，HSV II型全球血清陽(yáng)性率約為20%，并且發(fā)病人數(shù)以每年25%速度增加。
[0003]HSV可在感染組織或附近部位繁殖形成原發(fā)病灶，并在三叉神經(jīng)核脊神經(jīng)建立終身的潛伏感染，當(dāng)機(jī)體受到外界刺激或免疫力下降是，HSV病毒下行至表皮大量增殖，形成復(fù)發(fā)感染。HSV反復(fù)發(fā)作與HSV免疫逃逸相關(guān)，HSV通過躲避人體免疫系統(tǒng)的攻擊實(shí)現(xiàn)潛伏感染和復(fù)發(fā)感染，因此HSV —旦感染，很難被清除，患者受到長(zhǎng)期疾病折磨。
[0004]病毒糖蛋白(glycoproteins, gp)是病毒毒粒表面的抗原決定簇，目前已發(fā)現(xiàn)并正式命名的包膜糖蛋白共有12個(gè)(gB、gC、gD、gE、gG、gH、g1、gK、gL和gM等)。gB和gD糖蛋白參與病毒與宿主細(xì)胞的吸附和融合，已被選作候選疫苗，對(duì)其研究較多。近年研究發(fā)現(xiàn)，gC2是免疫逃逸相關(guān)的包膜糖蛋白。HSV病毒包膜蛋白gC與補(bǔ)體C3b結(jié)合，并阻斷補(bǔ)體C5和P因子與C3b結(jié)合，從而阻斷多個(gè)補(bǔ)體介導(dǎo)的免疫途徑，使HSV病毒成功躲避機(jī)體的免疫系統(tǒng)攻擊。因此他是造成病毒潛伏感染的蛋白分子之一。選取gC糖蛋白用于免疫機(jī)體，阻斷病毒的潛伏感染，有希望成為理想的候選疫苗。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明是化學(xué)合成的HSV2病毒gC糖蛋白胞外區(qū)的全新基因片段，利用基因工程技術(shù)，制備重組HSV2病毒gC糖蛋白胞外區(qū)片段。通過計(jì)算機(jī)分析，篩選出含強(qiáng)抗原表位的HSV2病毒gC糖蛋白胞外區(qū)片段，第28個(gè)氨基酸一第447個(gè)氨基酸，共420個(gè)氨基酸，選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，化學(xué)合成全新的基因序列，利用基因工程技術(shù)表達(dá)該基因。表達(dá)的蛋白可用于疫苗、HSV2病毒抗體或抗原的檢測(cè)及用于免疫制備抗HSV2病毒單抗和多抗等。
[0006]本發(fā)明通過計(jì)算機(jī)分析，篩選出含強(qiáng)抗原表位的HSV2病毒的gC糖蛋白胞外區(qū)片段，選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，化學(xué)合成全新的基因序列，利用基因工程技術(shù)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物具有較好的抗原性和特異性，表達(dá)的蛋白可用于疫苗及HSV2病毒抗體或抗原的檢測(cè)等。
[0007]化學(xué)合成的HSV2病毒gC糖蛋白胞外區(qū)基因片段及其表達(dá)、應(yīng)用是釆取以下步驟實(shí)現(xiàn)的:
1.HSV2病毒gC糖蛋白胞外區(qū)抗原表位的篩選及其基因片段的化學(xué)合成:
利用ANTHEWIN等軟件，通過計(jì)算機(jī)分析HSV2病毒gC糖蛋白的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)gC糖蛋白的N端(第28氨基酸一第447氨基酸)含有較強(qiáng)的抗原決定簇。選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，化學(xué)合成全新的基因序列，并且在5’端增加了及^RI酶切位點(diǎn)(下劃線部分)、起始密碼子(ATG)、信號(hào)肽(GGCTGGAGCTGTATTATCCTGTTCCTGGTCGCCACTGCCACTGGAGITCAITCTAGT)，在3’ 端增加了His標(biāo)記(CAC CAC CAC CAC CAC CAC)、終止密碼子(TGA)取Himd III酶切位點(diǎn)(下劃線部分)，使該基因片段易于克隆至質(zhì)粒PMCE5內(nèi)的及^RI和Himd III酶切位點(diǎn)內(nèi)。
[0008]篩選的HSV2病毒gC糖蛋白內(nèi)的抗原表位氨基酸序列(第28個(gè)aa —第447個(gè)aa):
Ser Pro Gly Arg Thr He Thr Val Gly Pro Arg Gly Asn Ala Ser Asn Ala Ala ProSer Ala Ser Pro Arg Asn Ala Ser Ala Pro Arg Thr Thr Pro Thr Pro Pro Gln Pro ArgLys Ala Thr Lys Ser Lys Ala Ser Thr Ala Lys Pro Ala Pro Pro Pro Lys Thr Gly ProPro Lys Thr Ser Ser Glu Pro Val Arg Cys Asn Arg His Asp Pro Leu Ala Arg Tyr GlySer Arg Val Gln He Arg Cys Arg Phe Pro Asn Ser Thr Arg Thr Glu Phe Arg Leu GlnHe Trp Arg Tyr Ala Thr Ala Thr Asp Ala Glu He Gly Thr Ala Pro Ser Leu Glu GluVal Met Val Asn Val Ser Ala Pro Pro Gly Gly Gln Leu Val Tyr Asp Ser Ala ProAsn Arg Thr Asp Pro His Val He Trp Ala Glu Gly Ala Gly Pro Gly Ala Ser Pro ArgLeu Tyr Ser Val Val Gly Pro Leu Gly Arg Gln Arg Leu He He Glu Glu Leu Thr LeuGlu Thr Gln Gly Met Tyr Tyr Trp Val Trp Gly Arg Thr Asp Arg Pro Ser Ala Tyr GlyThr Trp Val Arg Val Arg Val Phe Arg Pro Pro Ser Leu Thr He His Pro His Ala ValLeu Glu Gly Gln Pro Phe Lys Ala Thr Cys Thr Ala Ala Thr Tyr Tyr Pro Gly Asn ArgAla Glu Phe Val Trp Phe Glu Asp Gly Arg Arg Val Phe Asp Pro Ala Gln He His ThrGln Thr Gln Glu Asn Pro Asp Gly Phe Ser Thr Val Ser Thr Val Thr Ser Ala Ala ValGly Gly Gln Gly Pro Pro Arg Thr Phe Thr Cys Gln Leu Thr Trp His Arg Asp Ser ValSer Phe Ser Arg Arg Asn Ala Ser Gly Thr Ala Ser Val Leu Pro Arg Pro Thr He ThrMet Glu Phe Thr Gly Asp His Ala Val Cys Thr Ala Gly Cys Val Pro Glu Gly Val ThrPhe Ala Trp Phe Leu Gly Asp Asp Ser Ser Pro Ala Glu Lys Val Ala Val Ala Ser GlnThr Ser Cys Gly Arg Pro Gly Thr Ala Thr He Arg Ser Thr Leu Pro Val Ser Tyr GluGln Thr Glu Tyr He Cys Arg Leu Ala Gly Tyr Pro Asp Gly He Pro Val Leu Glu HisHis Gly Ser His Gln Pro Pro Pro Arg Asp Pro Thr Glu Arg Gln Val He Arg Ala ValGlu Gly
化學(xué)合成的含HSV2 病毒gC糖蛋白胞外區(qū)抗原表位基因的DNA序列(1360 bp):
GAATTC GCC GCC ACC ATG GGC TGG AGC TGT ATT ATC CTG TTC CTG GTC GCC ACT GCCACT GGA GTT CAT TCT AGT CCT GGT CGC ACT ATC ACC GTG GGG CCA AGA GGC MC GCA AGCMT GCA GCT CCA TCA GCC TCC CCT AGG MC GCA TCT GCT CCA CGA ACC ACA CCA ACC CCACCT CAG CCA CGA MG GCT ACA MG TCA MA GCC TCC ACT GCT AM CCT GCA CCA CCC CCTMG ACT GGT CCA CCC MA ACC TCC AGC GAG CCT GTG CGA TGC AAC CGT CAC GAC CCA CTGGCC AGA TAC GGC AGT CGC GTG CAG ATC CGA TGT CGT TTC CCT AAT TCA ACT CGA ACC GAGTTT CGT CTG CAG ATC TGG AGA TAT GCA ACA GCC ACT GAT GCC GM ATT GGC ACC GCT CCAAGC CTG GAG GAA GTG ATG GTC MC GTG TCT GCA CCT CCA GGC GGA CAG CTG GTG TAC GACAGC GCC CCA MT CGA ACA GAT CCC CAT GTC ATC TGG GCA GAG GGA GCT GGA CCT GGA GCTTCT CCA CGG CTG TAT AGT GTG GTC GGT CCA CTG GGC AGG CAG CGG CTG ATC ATT GAG GMCTG ACC CTG GAA ACA CAG GGC ATG TAC TAT TGG GTG TGG GGC AGG ACT GAC CGG CCT AGTGCC TAC GGA ACC TGG GTC AGA GTG CGC GTC TTC AGG CCC CCT AGC CTG ACT ATC CAC CCACAT GCT GTG CTG GAG GGA CAG CCT TTT MG GCA ACC TGC ACA GCA GCC ACC TAC TAT CCTGGA MC CGG GCT GAG TTC GTG TGG TTT GAA GAC GGG AGG CGG GTC TTC GAT CCT GCC CAGATT CAC ACT CAG ACC CAG GAA MT CCA GAT GGT TTT AGC ACC GTG TCT ACA GTC ACT TCTGCT GCA GTG GGC GGT CAG GGA CCA CCA CGA ACC TTC ACA TGT CAG CTG ACC TGG CAC CGTGAC AGC GTG TCT TTT AGT AGA CGC MT GCA TCC GGA ACA GCC AGC GTC CTG CCT AGA CCAACT ATC ACC ATG GAG TTC ACC GGG GAT CAT GCC GTG TGC ACA GCA GGA TGC GTG CCA GMGGG GTC ACA TTC GCC TGG TTT CTG GGC GAC GAT TCT AGT CCC GCT GAG AM GTG GCT GTCGCA AGT CAG ACT TCA TGC GGA AGA CCA GGG ACA GCT ACT ATT CGC TCA ACA CTG CCC GTGTCC TAC GAG CAG ACT GAA TAT ATC TGT CGC CTG GCC GGT TAT CCC GAC GGC ATT CCT GTGCTG GAG CAC CAT GGA TCC CAT CAG CCT CCA CCC AGA GAT CCA ACT GAG AGG CAG GTC ATTAGA GCC GTC GAG GGA CAC CAC CAC CAC CAC CAC TGA TAAGCTT
2.表達(dá)HSV2病毒gC糖蛋白胞外區(qū)片段重組質(zhì)粒的構(gòu)建:
提取質(zhì)粒pMCE5，用I和Hind 111雙酶切，電泳后回收酶切的質(zhì)粒大片段，溶于去離子水內(nèi)。同樣用I和III雙酶切化學(xué)合成的HSV2病毒gC糖蛋白基因片段，電泳回收后，溶于去離子水內(nèi)。
[0009]取等摩爾濃度的上述兩種酶切后DNA片段，在同一離心管內(nèi)用T4 DNA連接酶連接，使HSV2病毒gC糖蛋白基因片段插入到載體pMCE5內(nèi)的I和III位點(diǎn)之間，與載體上的起始密碼子翻譯框架一致，表達(dá)一個(gè)融合蛋白。
[0010]3.重組質(zhì)粒的篩選與鑒定:
將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，涂布含100 μ g / ml氨芐青霉素的LB平板，置37°C過夜。次日隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化菌落、I個(gè)含質(zhì)粒PMCE5轉(zhuǎn)化菌作陰性對(duì)照，I個(gè)含pUC57-gC2轉(zhuǎn)化菌作陽(yáng)性對(duì)照，菌液PCR擴(kuò)增HSV2病毒gC糖蛋白胞外區(qū)基因片段，含HSV2病毒gC糖蛋白胞外區(qū)基因片段的陽(yáng)性重組質(zhì)粒，應(yīng)擴(kuò)增出長(zhǎng)約1360bp的基因片段。在提取陽(yáng)性單菌落質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定并將含有外源基因的質(zhì)粒進(jìn)行DNA序列分析，序列分析證實(shí)重組質(zhì)粒含有合成的HSV2病毒gC糖蛋白基因片段，序列完全正確:
GCC GCC ACC ATG GGC TGG AGC TGT ATT ATC CTG TTC CTG GTC GCC ACT GCC ACT GGAGTT CAT TCT AGT CCT GGT CGC ACT ATC ACC GTG GGG CCA AGA GGC AAC GCA AGC AAT GCAGCT CCA TCA GCC TCC CCT AGG AAC GCA TCT GCT CCA CGA ACC ACA CCA ACC CCA CCT CAGCCA CGA MG GCT ACA MG TCA MA GCC TCC ACT GCT MA CCT GCA CCA CCC CCT MG ACTGGT CCA CCC MA ACC TCC AGC GAG CCT GTG CGA TGC AAC CGT CAC GAC CCA CTG GCC AGATAC GGC AGT CGC GTG CAG ATC CGA TGT CGT TTC CCT AAT TCA ACT CGA ACC GAG TTT CGTCTG CAG ATC TGG AGA TAT GCA ACA GCC ACT GAT GCC GM ATT GGC ACC GCT CCA AGC CTGGAG GAA GTG ATG GTC MC GTG TCT GCA CCT CCA GGC GGA CAG CTG GTG TAC GAC AGC GCCCCA MT CGA ACA GAT CCC CAT GTC ATC TGG GCA GAG GGA GCT GGA CCT GGA GCT TCT CCACGG CTG TAT AGT GTG GTC GGT CCA CTG GGC AGG CAG CGG CTG ATC ATT GAG GM CTG ACCCTG GAA ACA CAG GGC ATG TAC TAT TGG GTG TGG GGC AGG ACT GAC CGG CCT AGT GCC TACGGA ACC TGG GTC AGA GTG CGC GTC TTC AGG CCC CCT AGC CTG ACT ATC CAC CCA CAT GCTGTG CTG GAG GGA CAG CCT TTT MG GCA ACC TGC ACA GCA GCC ACC TAC TAT CCT GGA AACCGG GCT GAG TTC GTG TGG TTT GAA GAC GGG AGG CGG GTC TTC GAT CCT GCC CAG ATT CACACT CAG ACC CAG GAA MT CCA GAT GGT TTT AGC ACC GTG TCT ACA GTC ACT TCT GCT GCAGTG GGC GGT CAG GGA CCA CCA CGA ACC TTC ACA TGT CAG CTG ACC TGG CAC CGT GAC AGCGTG TCT TTT AGT AGA CGC MT GCA TCC GGA ACA GCC AGC GTC CTG CCT AGA CCA ACT ATCACC ATG GAG TTC ACC GGG GAT CAT GCC GTG TGC ACA GCA GGA TGC GTG CCA GM GGG GTCACA TTC GCC TGG TTT CTG GGC GAC GAT TCT AGT CCC GCT GAG AM GTG GCT GTC GCA AGTCAG ACT TCA TGC GGA AGA CCA GGG ACA GCT ACT ATT CGC TCA ACA CTG CCC GTG TCC TACGAG CAG ACT GAA TAT ATC TGT CGC CTG GCC GGT TAT CCC GAC GGC ATT CCT GTG CTG GAGCAC CAT GGA TCC CAT CAG CCT CCA CCC AGA GAT CCA ACT GAG AGG CAG GTC ATT AGA GCCGTC GAG GGA CAC CAC CAC CAC CAC CAC TGA T
構(gòu)建的重組質(zhì)粒表達(dá)HSV2的病毒gC糖蛋白胞外區(qū)片段(420個(gè)氨基酸)，在其N端融合了載體上的19個(gè)氨基酸，在其C端融合了載體上 的6個(gè)氨基酸，全長(zhǎng)445個(gè)氨基酸，其氨基酸序列如下:
N端:Met Gly Trp Ser Cys Ile He Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly ValHis Ser
C 端:His His His His His His
4.重組質(zhì)粒在CHO細(xì)胞中的表達(dá)鑒定:
CHO細(xì)胞在不含血清的細(xì)胞表達(dá)培養(yǎng)基在錐形瓶中震蕩培養(yǎng)，37°C，5% C02。轉(zhuǎn)染前一天，以適當(dāng)?shù)臐舛葘HO細(xì)胞接種于不含血清的細(xì)胞表達(dá)培養(yǎng)基中，震蕩懸浮培養(yǎng)，370C，5%CO20用DNA和PEI混合物轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后第五天收集細(xì)胞上清，檢測(cè)蛋白表達(dá)水平，第六天收集所有上清用于純化重組蛋白。
[0011]5.重組蛋白的純化、鑒定和濃度檢測(cè):
收集細(xì)胞上清100ml，離心后將上清以lml/min的速度加入His Trap? FF crudecolumn 中。10 倍體積平衡液(I XPBS，0.5mol/L NaCl, 20mmol/L imidazole, ρΗ7.4)洗脫雜蛋白，再加入 Iml 洗脫液(I XPBS, 0.5mol/L NaCl, 500mmol/L imidazole, pH7.4)洗脫目的蛋白，靜置20分鐘后洗脫，收集洗脫液，用透析液(lXPBS，0.5mol/L NaCl，pH7.4)透析過夜，即為純化的目的蛋白，SDS-PAGE、Western Blot檢測(cè)，并測(cè)定蛋白濃度。
[0012]6.免疫小鼠及gC2抗血清的制備:
10只雄性昆明小鼠隨機(jī)分為2組，每組5只。實(shí)驗(yàn)組以純化的重組gC2糖蛋白與弗氏佐劑等體積混合，充分乳化，分別于第0，2，4周，腹腔注射免疫小鼠，2 ug/只/次，0.1ml/只，對(duì)照組以PBS等體積混合弗氏佐劑，充分乳化，0.1ml/只。每次免疫后2周眼眶采血。血液37°C放置I小時(shí)后4°C過夜，4000rpm離心10分鐘，取上清即得重組蛋白gC2抗血清。
[0013]7.重組蛋白gC2的免疫原性檢測(cè):
用IXCBS將純化的重組gC2糖蛋白稀釋為I ug/ml，包被酶聯(lián)板，每孔100ul，4°C過夜。次日5%FBS封閉酶聯(lián)板，每孔130ul，室溫2小時(shí)。將制備的抗血清用樣本稀釋液按1:500,1； 2500，1:12500逐級(jí)稀釋后，分別加至封閉后的酶聯(lián)板孔內(nèi)，每孔IOOul，37°C反應(yīng)I小時(shí)，用PBST洗5遍后，加1:5000稀釋的羊抗小鼠IgG-HRP，每孔lOOul，37°C反應(yīng)30分鐘，PBST洗5遍，加底物TMB溶液每孔100 ul，37°C避光顯色10分鐘，加50ul IN鹽酸終止反應(yīng)，用酶聯(lián)儀測(cè)定A45tl值。
[0014]8.酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(ELISP0T):
選取IFN- Y和IL-4兩個(gè)分別代表Thl和Th2細(xì)胞因子作為檢測(cè)對(duì)象。每組檢測(cè)5只小鼠，每只小鼠設(shè)置三個(gè)復(fù)孔。第三次免疫兩周后處死小鼠，取小鼠脾臟，制備懸浮的小鼠脾淋巴細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)，將細(xì)胞密度調(diào)整至5X IO6個(gè)cell/ml。按試劑盒操作說(shuō)明:在96孔濾膜板中加入15 μ I 3 5%乙醇30s，PBS洗滌3次；加入100 μ I/孔已稀釋的捕獲抗體，4°C包被過夜；棄液，包被稀釋液洗滌2次，加入200 μ I/孔R(shí)PMI1640完全培養(yǎng)基，37°C封閉Ih ;棄液，加入100 μ I/孔已提取的淋巴細(xì)胞，并加入相應(yīng)抗原蛋白作刺激物，使抗原蛋白終濃度達(dá)Ayg/ml，靜置于CO2培養(yǎng)箱48h ;棄液，PBST洗滌3次，加入100 μ I/孔生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體，4°C過夜；棄液，PBST洗滌4次，加入100 μ I/孔親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶，室溫45min ;棄液，PBST洗滌3次，PBS洗滌2次，加入100 μ I/孔新配置的AEC(3-amino-9-ethylcarbazole)底物液,室溫顯色10_60min ;棄液,去離子水洗洚3次,終止顯色，避光晾干；斑點(diǎn)計(jì)數(shù)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
[0015]所述的化學(xué)合成的HSV2病毒gC糖蛋白胞外區(qū)的基因片段序列，利用細(xì)菌、酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞及轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物進(jìn)行重組表達(dá)、制備。
[0016]以上述所述的方法制備的HSV2病毒gC糖蛋白胞外區(qū)片段，用于HSV2病毒亞單位疫苗的研制及抗體檢測(cè)。
[0017]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有的優(yōu)點(diǎn)
本發(fā)明表達(dá)的HSV2病毒的gC糖蛋白片段，有較多優(yōu)點(diǎn):
1.目前應(yīng)用的HSV2病毒抗體的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，其使用的抗原是全病毒抗原，生產(chǎn)較危險(xiǎn)、成本高、與其它病毒有交叉反應(yīng)等缺點(diǎn)。表達(dá)的HSV2病毒的gC糖蛋白胞外區(qū)片段用作抗原可克服上述缺點(diǎn)。
[0018]①
2.目前缺乏HSV2病毒疫苗。滅活疫苗的研究取得了較大進(jìn)展，但是生產(chǎn)成本高、危險(xiǎn)大。HSV2病毒的gC糖蛋白在感染的細(xì)胞中含量最多，是皰疹病毒家族中高度保守的蛋白，各毒株間差異較小，同時(shí)gC蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體和細(xì)胞免疫反應(yīng)，并且和病毒逃逸機(jī)制相關(guān)，因此HSV2gC糖蛋白是構(gòu)建HSV疫苗理想的目的基因。我們選擇了其強(qiáng)抗原表位，利用基因工程技術(shù)表達(dá)制備，為研制基因工程疫苗奠定基礎(chǔ)?；蚬こ桃呙绨踩?、成本低。
[0019]3.根據(jù)篩選出的HSV2病毒的gC糖蛋白胞外區(qū)片段氨基酸序列，選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，化學(xué)合成全新的基因序列，該基因適宜在真核和原核細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)。[0020]4.本發(fā)明構(gòu)建的表達(dá)HSV2病毒的gC糖蛋白的CHO細(xì)胞株，可大量純化制備該蛋白，易于純化，且具有相當(dāng)強(qiáng)的免疫原性。目前未見表達(dá)該段蛋白的報(bào)道。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0021]以下將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明:
圖1是菌液PCR檢測(cè)8個(gè)重組子的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。M:2000 DL DNA (TaKaRa)51-8 -M取單菌落菌液PCR產(chǎn)物；9:空pMCE5/DH5 α菌液PCR產(chǎn)物；10: gC2基因PCR產(chǎn)物。
[0022]圖2是雙酶切鑒定結(jié)果。M:5000 DL DNA (TaKaRa); I:重組質(zhì)粒經(jīng)&oRI和
雙酶切產(chǎn)物；2:重組質(zhì)粒經(jīng)AcoRI單酶切產(chǎn)物。
[0023]圖3是表達(dá)HSV2病毒的gC糖蛋白重組菌的SDS-PAGE分析結(jié)果。M: ProteinMarker ； I:還原條件下電泳；2:非還原條件電泳
圖4是表達(dá)HSV2病毒的gC糖蛋白純化前后的Western-Blots分析結(jié)果。M..ProteinMarker ； I:還原條件下電泳；2:非還原條件電泳；P: Multiple-tag作為陽(yáng)參。
[0024]圖5是ELISA檢測(cè)重組蛋白gC2免疫原性 圖6是小鼠淋巴細(xì)胞分泌IFN- Y和IL-4頻率【具體實(shí)施方式】
[0025]本發(fā)明實(shí)施方式的詳細(xì)說(shuō)明:
HSV2病毒的gC糖蛋白抗原表位的分析、基因合成及表達(dá)
通過計(jì)算機(jī)分析HSV2病毒的gC糖蛋白的全部氨基酸序列，篩選出HSV2病毒的gC糖蛋白內(nèi)的強(qiáng)抗原表位，選用真核偏愛的密碼子，化學(xué)合成HSV2病毒的gC糖蛋白強(qiáng)抗原表位的全新基因片段。將基因片段克隆至質(zhì)粒PMCE5內(nèi)的I位點(diǎn)，與載體上的起始密碼子的翻譯框架一致，可表達(dá)一個(gè)融合蛋白。將構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒pMCE5-gC2并轉(zhuǎn)染至CHO細(xì)胞進(jìn)行真核表達(dá)，獲得了高表達(dá)gC糖蛋白的細(xì)胞株。
[0026]材料與方法
1.菌種與質(zhì)粒:宿主菌DH5a及表達(dá)載體pMCE5為本實(shí)驗(yàn)室保存。
[0027]2.分子生物學(xué)試劑:限制性內(nèi)切酶feoR1、歷/7?/ΙΙΙ、及T4 DNA連接酶為TaKaRa公司產(chǎn)品。質(zhì)粒純化試劑盒及從瓊脂糖凝膠內(nèi)回收DNA片段的試劑盒為TaKaRa公司產(chǎn)品.其它試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?br> [0028]3.基因片段的合成:由大連TaKaRa公司幫助合成。
[0029]4.基因克隆方法:DNA的酶切、連接、電泳；質(zhì)粒的提取、轉(zhuǎn)化。其它試劑盒按說(shuō)明書進(jìn)行操作。
[0030]5.DNA序列分析:用TAKARA公司質(zhì)粒純化試劑盒純化質(zhì)粒，用DNA全自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)序。
[0031]結(jié)果
1.HSV2病毒的gC糖蛋白抗原表位篩選及基因片段的合成:
利用ANTHEWIN等軟件，通過計(jì)算機(jī)分析HSV2病毒的gC糖蛋白的全部氨基酸序列(UniProtKB:Q89730)，篩選出HSV2病毒的gC糖蛋白內(nèi)的強(qiáng)抗原表位，即從第28個(gè)氨基酸到第447個(gè)氨基酸，其氨基酸序列如下:Ser Pro Gly Arg Thr lie Thr Val Gly Pro Arg Gly Asn Ala Ser Asn Ala Ala ProSer Ala Ser Pro Arg Asn Ala Ser Ala Pro Arg Thr Thr Pro Thr Pro Pro Gln Pro ArgLys Ala Thr Lys Ser Lys Ala Ser Thr Ala Lys Pro Ala Pro Pro Pro Lys Thr Gly ProPro Lys Thr Ser Ser Glu Pro Val Arg Cys Asn Arg His Asp Pro Leu Ala Arg Tyr GlySer Arg Val Gln lie Arg Cys Arg Phe Pro Asn Ser Thr Arg Thr Glu Phe Arg Leu Glnlie Trp Arg Tyr Ala Thr Ala Thr Asp Ala Glu lie Gly Thr Ala Pro Ser Leu Glu GluVal Met Val Asn Val Ser Ala Pro Pro Gly Gly Gln Leu Val Tyr Asp Ser Ala ProAsn Arg Thr Asp Pro His Val He Trp Ala Glu Gly Ala Gly Pro Gly Ala Ser Pro ArgLeu Tyr Ser Val Val Gly Pro Leu Gly Arg Gln Arg Leu lie lie Glu Glu Leu Thr LeuGlu Thr Gln Gly Met Tyr Tyr Trp Val Trp Gly Arg Thr Asp Arg Pro Ser Ala Tyr GlyThr Trp Val Arg Val Arg Val Phe Arg Pro Pro Ser Leu Thr lie His Pro His Ala ValLeu Glu Gly Gln Pro Phe Lys Ala Thr Cys Thr Ala Ala Thr Tyr Tyr Pro Gly Asn ArgAla Glu Phe Val Trp Phe Glu Asp Gly Arg Arg Val Phe Asp Pro Ala Gln lie His ThrGln Thr Gln Glu Asn Pro Asp Gly Phe Ser Thr Val Ser Thr Val Thr Ser Ala Ala ValGly Gly Gln Gly Pro Pro Arg Thr Phe Thr Cys Gln Leu Thr Trp His Arg Asp Ser ValSer Phe Ser Arg Arg Asn Ala Ser Gly Thr Ala Ser Val Leu Pro Arg Pro Thr lie ThrMet Glu Phe Thr Gly Asp His Ala Val Cys Thr Ala Gly Cys Val Pro Glu Gly Val ThrPhe Ala Trp Phe Leu Gly Asp Asp Ser Ser Pro Ala Glu Lys Val Ala Val Ala Ser GlnThr Ser Cys Gly Arg Pro Gly Thr Ala Thr lie Arg Ser Thr Leu Pro Val Ser Tyr GluGln Thr Glu Tyr He Cys Arg Leu Ala Gly Tyr Pro Asp Gly lie Pro Val Leu Glu HisHis Gly Ser His Gln Pro Pro Pro Arg Asp Pro Thr Glu Arg Gln Val lie Arg Ala ValGlu Gly
根據(jù)篩選的HSV2病毒gC糖蛋白內(nèi)的抗原表位氨基酸序列，選擇真核的密碼子，化學(xué)合成全新的基因序列，并且在5’端增加TfeoRI酶切位點(diǎn)(下劃線部分)、起始密碼`子(ATG)、信號(hào)肽(GGCTGGAGCTGTATTATCCTGTTCCTGGTCGCCACTGCCACTGGAG TCATTCTAGT)，在 3’ 端增加了 His標(biāo)記(CAC CAC CAC CAC CAC CAC)、終止密碼子(TGA)和歷III酶切位點(diǎn)(下劃線部分)，使該基因片段易于克隆至質(zhì)粒PMCE5內(nèi)的&0RI和Hind III酶切位點(diǎn)內(nèi)?；瘜W(xué)合成的含HSV2病毒gC糖蛋白抗原表位基因的DNA序列(1360 bp)如下:
GAATTC GCC GCC ACC ATG GGC TGG AGC TGT ATT ATC CTG TTC CTG GTC GCC ACT GCCACT GGA GTT CAT TCT AGT CCT GGT CGC ACT ATC ACC GTG GGG CCA AGA GGC AAC GCA AGCMT GCA GCT CCA TCA GCC TCC CCT AGG AAC GCA TCT GCT CCA CGA ACC ACA CCA ACC CCACCT CAG CCA CGA MG GCT ACA AAG TCA AM GCC TCC ACT GCT AM CCT GCA CCA CCC CCTMG ACT GGT CCA CCC MA ACC TCC AGC GAG CCT GTG CGA TGC AAC CGT CAC GAC CCA CTGGCC AGA TAC GGC AGT CGC GTG CAG ATC CGA TGT CGT TTC CCT AAT TCA ACT CGA ACC GAGTTT CGT CTG CAG ATC TGG AGA TAT GCA ACA GCC ACT GAT GCC GM ATT GGC ACC GCT CCAAGC CTG GAG GM GTG ATG GTC AAC GTG TCT GCA CCT CCA GGC GGA CAG CTG GTG TAC GACAGC GCC CCA AAT CGA ACA GAT CCC CAT GTC ATC TGG GCA GAG GGA GCT GGA CCT GGA GCTTCT CCA CGG CTG TAT AGT GTG GTC GGT CCA CTG GGC AGG CAG CGG CTG ATC ATT GAG GAACTG ACC CTG GM ACA CAG GGC ATG TAC TAT TGG GTG TGG GGC AGG ACT GAC CGG CCT AGTGCC TAC GGA ACC TGG GTC AGA GTG CGC GTC TTC AGG CCC CCT AGC CTG ACT ATC CAC CCACAT GCT GTG CTG GAG GGA CAG CCT TTT MG GCA ACC TGC ACA GCA GCC ACC TAC TAT CCTGGA MC CGG GCT GAG TTC GTG TGG TTT GAA GAC GGG AGG CGG GTC TTC GAT CCT GCC CAGATT CAC ACT CAG ACC CAG GAA MT CCA GAT GGT TTT AGC ACC GTG TCT ACA GTC ACT TCTGCT GCA GTG GGC GGT CAG GGA CCA CCA CGA ACC TTC ACA TGT CAG CTG ACC TGG CAC CGTGAC AGC GTG TCT TTT AGT AGA CGC MT GCA TCC GGA ACA GCC AGC GTC CTG CCT AGA CCAACT ATC ACC ATG GAG TTC ACC GGG GAT CAT GCC GTG TGC ACA GCA GGA TGC GTG CCA GMGGG GTC ACA TTC GCC TGG TTT CTG GGC GAC GAT TCT AGT CCC GCT GAG AM GTG GCT GTCGCA AGT CAG ACT TCA TGC GGA AGA CCA GGG ACA GCT ACT ATT CGC TCA ACA CTG CCC GTGTCC TAC GAG CAG ACT GAA TAT ATC TGT CGC CTG GCC GGT TAT CCC GAC GGC ATT CCT GTGCTG GAG CAC CAT GGA TCC CAT CAG CCT CCA CCC AGA GAT CCA ACT GAG AGG CAG GTC ATTAGA GCC GTC GAG GGA CAC CAC CAC CAC CAC CAC TGA TAAGCTT
2.表達(dá)HSV2病毒gC糖蛋白胞外區(qū)片段重組質(zhì)粒的構(gòu)建:
提取質(zhì)粒pMCE5，用Ac0RI取Hind III雙酶切，電泳后回收酶切的質(zhì)粒大片段，溶于去離子水內(nèi)。同樣用&0RI和III雙酶切化學(xué)合成的HSV2病毒gC糖蛋白胞外區(qū)基因片段，電泳回收后，溶于去離子水內(nèi)。
[0032]取等摩爾濃度的上述兩種酶切后DNA片段，在同一離心管內(nèi)用T4 DNA連接酶連接，使HSV2病毒gB糖蛋白胞外區(qū)基因片段插入到載體pMCE5內(nèi)的&oRI和III位點(diǎn)之間，與載體上的起始密碼子翻譯框架一致，表達(dá)一個(gè)融合蛋白。
[0033] 3.重組質(zhì)粒的篩選與鑒定:
將上步連接的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5CI，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布含氨芐青霉素(IOOPg / ml)的固體LB培養(yǎng)基上,置37°C培養(yǎng)過夜。次日隨機(jī)挑選1-8號(hào)轉(zhuǎn)化子菌落、一個(gè)含質(zhì)粒pMCE5轉(zhuǎn)化菌作陰性對(duì)照和一個(gè)含質(zhì)粒pUC57-gC2轉(zhuǎn)化菌作陽(yáng)性對(duì)照，分別接種到3ml含氨芐青霉素I(K)Pg / ml液體LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)5h，取菌液1ml，離心收菌。分別用50 μ I去離子水懸浮菌體，沸水煮5min,離心(4°C，12000rpm )5min,取上清2 μ I用作PCR模板，PCR擴(kuò)增插入載體內(nèi)的HSV2病毒gC糖蛋白胞外區(qū)基因片段，PCR反應(yīng)濃度為:質(zhì)粒模板2 μ 1、HSV2病毒gC糖蛋白胞外區(qū)基因片段的正鏈PI (CCGGAATTCGCCGCCACCATGGG )和負(fù)鏈引物 P2 (AAATGCGGCCGCTGACCATGATTACGCCA AGCT)各 I μ l、10Xpyrobest buffer
5.0μ 1、2.5 mmol/L dNTP 4.0μ I, Pyrobest DNA Taq 酶 0.5 μ I (2.5 U)、去離子水36.5 μ 1，總體積50 μ I。擴(kuò)增條件為:94°C 30秒、55°C 30秒、72°C 4分鐘，35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸7分鐘。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μ 1，用1.0%的Agarose凝膠檢測(cè)，結(jié)果，I號(hào)轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增出1360bp的目的基因片段(見圖1)，而含質(zhì)粒PMCE5的對(duì)照菌沒有擴(kuò)增出該基因片段。初步證實(shí)，這I號(hào)轉(zhuǎn)化子含有HSV2病毒gC糖蛋白基因片段。
[0034]提取I號(hào)重組子的質(zhì)粒，雙酶切鑒定(見圖2)并測(cè)定質(zhì)粒內(nèi)的HSV2病毒gC糖蛋白基因序列，DNA序列分析證實(shí)，重組質(zhì)粒含有合成的HSV2病毒gC糖蛋白基因片段，序列完全正確:
GCC GCC ACC ATG GGC TGG AGC TGT ATT ATC CTG TTC CTG GTC GCC ACT GCC ACT GGAGTT CAT TCT AGT CCT GGT CGC ACT ATC ACC GTG GGG CCA AGA GGC MC GCA AGC MT GCAGCT CCA TCA GCC TCC CCT AGG AAC GCA TCT GCT CCA CGA ACC ACA CCA ACC CCA CCT CAGCCA CGA MG GCT ACA MG TCA MA GCC TCC ACT GCT AM CCT GCA CCA CCC CCT AAG ACTGGT CCA CCC MA ACC TCC AGC GAG CCT GTG CGA TGC AAC CGT CAC GAC CCA CTG GCC AGATAC GGC AGT CGC GTG CAG ATC CGA TGT CGT TTC CCT AAT TCA ACT CGA ACC GAG TTT CGTCTG CAG ATC TGG AGA TAT GCA ACA GCC ACT GAT GCC GM ATT GGC ACC GCT CCA AGC CTGGAG GAA GTG ATG GTC MC GTG TCT GCA CCT CCA GGC GGA CAG CTG GTG TAC GAC AGC GCCCCA MT CGA ACA GAT CCC CAT GTC ATC TGG GCA GAG GGA GCT GGA CCT GGA GCT TCT CCACGG CTG TAT AGT GTG GTC GGT CCA CTG GGC AGG CAG CGG CTG ATC ATT GAG GM CTG ACCCTG GAA ACA CAG GGC ATG TAC TAT TGG GTG TGG GGC AGG ACT GAC CGG CCT AGT GCC TACGGA ACC TGG GTC AGA GTG CGC GTC TTC AGG CCC CCT AGC CTG ACT ATC CAC CCA CAT GCTGTG CTG GAG GGA CAG CCT TTT MG GCA ACC TGC ACA GCA GCC ACC TAC TAT CCT GGA AACCGG GCT GAG TTC GTG TGG TTT GAA GAC GGG AGG CGG GTC TTC GAT CCT GCC CAG ATT CACACT CAG ACC CAG GAA MT CCA GAT GGT TTT AGC ACC GTG TCT ACA GTC ACT TCT GCT GCAGTG GGC GGT CAG G GA CCA CCA CGA ACC TTC ACA TGT CAG CTG ACC TGG CAC CGT GAC AGCGTG TCT TTT AGT AGA CGC MT GCA TCC GGA ACA GCC AGC GTC CTG CCT AGA CCA ACT ATCACC ATG GAG TTC ACC GGG GAT CAT GCC GTG TGC ACA GCA GGA TGC GTG CCA GM GGG GTCACA TTC GCC TGG TTT CTG GGC GAC GAT TCT AGT CCC GCT GAG AM GTG GCT GTC GCA AGTCAG ACT TCA TGC GGA AGA CCA GGG ACA GCT ACT ATT CGC TCA ACA CTG CCC GTG TCC TACGAG CAG ACT GAA TAT ATC TGT CGC CTG GCC GGT TAT CCC GAC GGC ATT CCT GTG CTG GAGCAC CAT GGA TCC CAT CAG CCT CCA CCC AGA GAT CCA ACT GAG AGG CAG GTC ATT AGA GCCGTC GAG GGA CAC CAC CAC CAC CAC CAC TGA T
構(gòu)建的重組質(zhì)粒表達(dá)HSV2的病毒gC糖蛋白片段(420個(gè)氨基酸)，在其N端融合了載體上的19個(gè)氨基酸，在C端融合了載體上的6個(gè)氨基酸，全長(zhǎng)445個(gè)氨基酸，其氨基酸序列如下:
N端:Met Gly Trp Ser Cys Ile He Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly ValHis Ser
C 端:His His His His His His
4.重組質(zhì)粒在CHO細(xì)胞中的表達(dá)鑒定:
CHO細(xì)胞在不含血清的細(xì)胞表達(dá)培養(yǎng)基在錐形瓶中震蕩培養(yǎng)，37°C，5% C02。轉(zhuǎn)染前一天，以適當(dāng)?shù)臐舛葘HO細(xì)胞接種于不含血清的細(xì)胞表達(dá)培養(yǎng)基中，震蕩懸浮培養(yǎng)，370C，5%CO20用DNA和PEI混合物轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后第五天收集細(xì)胞上清，檢測(cè)蛋白表達(dá)水平，第六天收集所有上清用于純化重組蛋白。
[0035]表達(dá)HSV2病毒gC糖蛋白的純化
根據(jù)表達(dá)HSV2病毒gC糖蛋白的氨基酸序列，分析其理化特性，確定適當(dāng)?shù)募兓椒?。CHO細(xì)胞表達(dá)的HSV2 gC糖蛋白融合有載體上的His蛋白，因此我們決定采用親和層析法，用His Trap? FF crude column進(jìn)行純化。純化獲得了表達(dá)的gC糖蛋白，具體步驟如下:材料和方法
1.主要試劑:His Trap? FF crude column為GE Heathcare公司產(chǎn)品，其它試劑為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純?cè)噭?br> [0036]2.重組蛋白的純化:收集細(xì)胞上清100ml，離心后將上清以lml/min的速度加A His Trap? FF crude column 中。10 倍體積平衡液(I XPBS,0.5mol/L NaCl, 20mmol/L imidazole, pH7.4)洗脫雜蛋白，再加入 Iml 洗脫液(I XPBS, 0.5mol/L NaCl, SOOmmol /L imidazole, pH7.4)洗脫目的蛋白，靜置20分鐘后洗脫，收集洗脫液，用透析液(I XPBS，
0.5mol/L NaCl，pH7.4)透析過夜，即為純化的目的蛋白，SDS-PAGE、Western Blot檢測(cè)，并測(cè)定蛋白濃度。
[0037]結(jié)果
將從 His Trap? FF crude column 上洗脫的蛋白進(jìn)行 SDS-PAGE、Western Blot 分析，結(jié)果顯示(分別見圖3、4)，表達(dá)產(chǎn)物約90kDa，蛋白濃度為40μ g/ml。
[0038]重組gC糖蛋白的免疫原性分析
以純化獲得的gC2重組蛋白為抗原，混合弗氏佐劑免疫小鼠，制備抗血清，間接ELISA法檢測(cè)效價(jià)，評(píng)測(cè)獲得的gC2重組蛋白的免疫原性。
[0039]材料和方法
1.雄性昆明小鼠，6-8周齡，購(gòu)自中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
[0040]2.完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑為Sigma公司產(chǎn)品。小鼠抗His單抗、羊抗小鼠IgG-HRP為金斯特公司產(chǎn)品，其它試劑為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純?cè)噭?br> [0041]3.動(dòng)物免疫及抗血清制備:10只雄性昆明小鼠隨機(jī)分為2組，每組5只。實(shí)驗(yàn)組以純化的重組gC2糖蛋白 與弗氏佐劑等體積混合，充分乳化，分別于第0，2，4周，腹腔注射免疫小鼠，2 ug/只/次，0.1ml/只，對(duì)照組以PBS等體積混合弗氏佐劑，充分乳化，0.1ml/只。每次免疫后2周眼眶采血。血液37°C放置I小時(shí)后4°C過夜，4000rpm離心10分鐘，取上清即得重組蛋白gC2抗血清。間接ELISA檢測(cè)抗血清滴度。
[0042]4.ELISA試驗(yàn):用I XCBS將純化的重組gC2糖蛋白稀釋為I ug/ml，包被酶聯(lián)板，每孔lOOul，4°C過夜。次日5%FBS封閉酶聯(lián)板，每孔130ul，室溫2小時(shí)。將制備的抗血清用樣本稀釋液按1:500，1:2500，1:12500逐級(jí)稀釋后，分別加至封閉后的酶聯(lián)板孔內(nèi)，每孔100ul，37°C反應(yīng)I小時(shí)，用PBST洗5遍后，加1:5000稀釋的羊抗小鼠IgG-HRP，每孔100ul，37°C反應(yīng)30分鐘，PBST洗5遍，加底物TMB溶液每孔100 ul，37°C避光顯色10分鐘，加50ul IN鹽酸終止反應(yīng)，用酶聯(lián)儀測(cè)定A45tl值。
[0043]結(jié)果
每次免疫后2周小鼠眼底靜脈叢取血，制備抗血清，間接ELISA法檢測(cè)血清血清中抗體滴度。結(jié)果顯示，小鼠抗gC2血清平均滴度在免疫前、第一次免疫后、第二次免疫后、第三次免疫后的抗血清滴度分別為0.00±0.00,5.77±0.38,7.03±0.77,8.57±0.38(如圖5)，且PBS對(duì)照組抗gC2血清滴度始終為0.00。小鼠在第一次免疫后即產(chǎn)生較高水平的抗體，通過第二次、第三次免疫后，小鼠體內(nèi)抗體水平仍緩慢升高，產(chǎn)生高滴度水平。使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及Q檢驗(yàn)，P < 0.05,免疫前及三次免疫后小鼠抗血清滴度的提高均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表達(dá)的重組蛋白gC2能刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生較好的體液免疫效果。
[0044]重組gC2蛋白的細(xì)胞免疫效果分析
獲取以gC2重組蛋白為抗原進(jìn)行三次免疫后的小鼠脾臟,制備小鼠脾淋巴細(xì)胞,利用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(ELISP0T)，檢測(cè)淋巴細(xì)胞分泌IL-4和IFN-Y的細(xì)胞頻率，評(píng)測(cè)純化獲得的gC2重組糖蛋白的細(xì)胞免疫效果。
[0045]材料和方法1.Mouse IL-4 ELISPOT Ready-SET-Go 和 Mouse IFN-y ELISPOT Ready-SET-Go 為eBioscience公司產(chǎn)品。
[0046]2.小鼠淋巴細(xì)胞分離液為達(dá)科為公司產(chǎn)品，其它試劑為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純?cè)噭?br> [0047]3.Elispot實(shí)驗(yàn)方法:選取IFN- Y和IL-4兩個(gè)分別代表Thl和Th2細(xì)胞因子作為檢測(cè)對(duì)象。每組5只小鼠，每只小鼠設(shè)置三個(gè)復(fù)孔。第三次免疫兩周后處死小鼠，取小鼠脾臟，制備懸浮的小鼠脾淋巴細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)，將細(xì)胞密度調(diào)整至5 X IO6個(gè)cell/ml。按試劑盒操作說(shuō)明:在96孔濾膜板中加入15 μ I 35%乙醇30s，PBS洗滌3次；加入100 μ I/孔已稀釋的捕獲抗體，4°C包被過夜；棄液，包被稀釋液洗滌2次，加入200 μ I/孔R(shí)PMI1640完全培養(yǎng)基，37°C封閉Ih ;棄液，加入100 μ I/孔已提取的淋巴細(xì)胞，并加入相應(yīng)抗原蛋白作刺激物，使抗原蛋白終濃度達(dá)4 μ g/ml，靜置于CO2培養(yǎng)箱48h ;棄液，PBST洗滌3次，加入100 μ I/孔生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體，4°C過夜；棄液，PBST洗滌4次，加入100 μ I/孔親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶，室溫45min ;棄液，PBST洗滌3次，PBS洗滌2次，加入100 μ I/孔新配置的AEC (3-amino-9-ethylcarbazole)底物液,室溫顯色10_60min ;棄液,去離子水洗滌3次，終止顯色，避光晾干；斑點(diǎn)計(jì)數(shù)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
[0048]結(jié)果
各組免疫小鼠脾細(xì)胞在體外特異性抗原刺激后，其激活的分泌IL-4和IFN-Y的淋巴細(xì)胞數(shù)各不相同，結(jié)果見表1和圖6。免疫gC2蛋白組分泌IL-4和IFN-Y平均值分別為19.2±2.48/106個(gè)細(xì)胞和13.46±2.832/106個(gè)細(xì)胞，PBS對(duì)照組分泌值均接近于0/106個(gè)細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理顯示gC2組與PBS對(duì)照組有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P < 0.05)。說(shuō)明gC2蛋白刺激小鼠產(chǎn)生了特異的細(xì)胞免疫。
[0049]
【權(quán)利要求】
1.一種化學(xué)合成的HSV2病毒gC糖蛋白的胞外區(qū)基因片段，該基因片段編碼含強(qiáng)抗原表位的HSV2病毒的gC糖蛋白胞外區(qū)基因片段，即第28個(gè)氨基酸至第447個(gè)氨基酸，共420個(gè)氨基酸，在5’端增加了 AcoRI酶切位點(diǎn)(下劃線部分)、起始密碼子(ATG)、信號(hào)肽(GGCTGGAGCTGTATTATCCTGTTCCTGGTCGCCACTGCCACTGG AGTTCATTCTAGT)，在 3’ 端增加了 His 標(biāo)記(CAC CAC CAC CAC CAC CAC)、終止密碼子(TGA)和歷III酶切位點(diǎn)(下劃線部分)，化學(xué)合成的基因序列全長(zhǎng)1360 bp，序列如下:
GAATTC GCC GCC ACC ATG GGC TGG AGC TGT ATT ATC CTG TTC CTG GTC GCC ACT GCCACT GGA GTT CAT TCT AGT CCT GGT CGC ACT ATC ACC GTG GGG CCA AGA GGC MC GCA AGCAAT GCA GCT CCA TCA GCC TCC CCT AGG MC GCA TCT GCT CCA CGA ACC ACA CCA ACC CCACCT CAG CCA CGA AAG GCT ACA AAG TCA MA GCC TCC ACT GCT MA CCT GCA CCA CCC CCTAAG ACT GGT CCA CCC AM ACC TCC AGC GAG CCT GTG CGA TGC MC CGT CAC GAC CCA CTGGCC AGA TAC GGC AGT CGC GTG CAG ATC CGA TGT CGT TTC CCT MT TCA ACT CGA ACC GAGTTT CGT CTG CAG ATC TGG AGA TAT GCA ACA GCC ACT GAT GCC GAA ATT GGC ACC GCT CCAAGC CTG GAG GM GTG ATG GTC AAC GTG TCT GCA CCT CCA GGC GGA CAG CTG GTG TAC GACAGC GCC CCA AAT CGA ACA GAT CCC CAT GTC ATC TGG GCA GAG GGA GCT GGA CCT GGA GCTTCT CCA CGG CTG TAT AGT GTG GTC GGT CCA CTG GGC AGG CAG CGG CTG ATC ATT GAG GAACTG ACC CTG GM ACA CAG GGC ATG TAC TAT TGG GTG TGG GGC AGG ACT GAC CGG CCT AGTGCC TAC GGA ACC TGG GTC AGA GTG CGC GTC TTC AGG CCC CCT AGC CTG ACT ATC CAC CCACAT GCT GTG CTG GAG GGA CAG CCT TTT MG GCA ACC TGC ACA GCA GCC ACC TAC TAT CCTGGA AAC CGG GCT GAG TTC GTG TGG TTT GAA GAC GGG AGG CGG GTC TTC GAT CCT GCC CAGATT CAC ACT CAG ACC CAG GM AAT CCA GAT GGT TTT AGC ACC GTG TCT ACA GTC ACT TCTGCT GCA GTG GGC GGT CAG GGA CCA CCA CGA ACC TTC ACA TGT CAG CTG ACC TGG CAC CGTGAC AGC GTG TCT TTT AGT AGA CGC AAT GCA TCC GGA ACA GCC AGC GTC CTG CCT AGA CCAACT ATC ACC ATG GAG TTC ACC GGG GAT CAT GCC GTG TGC ACA GCA GGA TGC GTG CCA GAAGGG GTC ACA TTC GCC TGG TTT CTG GGC GAC GAT TCT AGT CCC GCT GAG MA GTG GCT GTCGCA AGT CAG ACT TCA TGC GGA AGA CCA GGG ACA GCT ACT ATT CGC TCA ACA CTG CCC GTGTCC TAC GAG CAG ACT GM TAT ATC TGT CGC CTG GCC GGT TAT CCC GAC GGC ATT CCT GTGCTG GAG CAC CAT GGA TCC CAT `CAG CCT CCA CCC AGA GAT CCA ACT GAG AGG CAG GTC ATTAGA GCC GTC GAG GGA CAC CAC CAC CAC CAC CAC TGA TMGCTT。
2.權(quán)利要求1所述的化學(xué)合成的HSV2病毒gC糖蛋白的胞外區(qū)基因片段，采用基因工程技術(shù)表達(dá)該基因序列編碼的HSV2病毒的gC糖蛋白胞外區(qū)基因片段，純化表達(dá)的蛋白片段，具體方法如下: 表達(dá)HSV2病毒的gC糖蛋白胞外區(qū)基因片段重組質(zhì)粒的構(gòu)建: 用I琳Himd III雙酶切質(zhì)粒pMCE5和化學(xué)合成的HSV2病毒的gC糖蛋白胞外區(qū)基因片段，電泳回收后，用T4 DNA連接酶連接，使HSV2病毒的gC糖蛋白胞外區(qū)基因片段插入到載體PMCE5內(nèi)的I熱Himd III位點(diǎn)之間，與載體上的起始密碼子翻譯框架一致，表達(dá)一個(gè)融合蛋白，全長(zhǎng)445個(gè)氨基酸，該融合蛋白N端融合了載體上的19個(gè)氨基酸，C端包含HSV2病毒的gC糖蛋白內(nèi)的第28個(gè)氨基酸至第447個(gè)氨基酸及His標(biāo)簽(6個(gè)氨基酸)，全長(zhǎng)445氨基酸序列如下:
3.權(quán)利要求1所述的化學(xué)合成的HSV2病毒gC糖蛋白胞外區(qū)的基因片段序列，利用細(xì)菌、酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞及轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物進(jìn)行重組表達(dá)、制備。
4.權(quán)利要求2或權(quán)利要求3所述的方法制備的HSV2病毒gC糖蛋白胞外區(qū)片段，用于HSV2病毒亞單位疫苗的研制及抗體檢測(cè)。`
【文檔編號(hào)】A61P31/22GK103740735SQ201310751323
【公開日】2014年4月23日 申請(qǐng)日期:2013年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月31日
【發(fā)明者】李越希, 周潔, 徐悅玥, 許桂麗, 尚彥紅, 張素芬, 馬穎, 袁敬宇, 潘英, 李素芹, 李丙軍, 陳樂如, 蔡冉 申請(qǐng)人:李越希