專利名稱：哺乳動(dòng)物細(xì)胞系和獲得糖蛋白的方法
Epstein—Barr病毒是引起人類傳染性的單核細(xì)胞增多癥的病原體，這種病是年輕人中最常見的傳染病之一。
90％以上的成人已受Epstein—Barr病毒感染。那些EBV陽性的人們以后可能發(fā)病如鼻炎癌、B細(xì)胞淋巴瘤，T細(xì)胞淋巴瘤，某些何杰金(Hodgkin)淋巴瘤，并且可能發(fā)生其它的惡性疾病。已經(jīng)報(bào)道，在原發(fā)感染或后繼階段發(fā)生慢性形式，稀有病例中，發(fā)生急性致死形式。
既然兒童中的Epstein—Barr病毒感染在臨床上是難以察覺的，而且用表達(dá)Epstein—Barr病毒膜抗原gp250/350(BLLF—1閱讀框，Baer等，1984)的重組疫苗病毒接種可以賦予對(duì)感染和/或疾病的抗性，必然假定，抵抗與Epstein—Barr病毒有關(guān)的疾病的疫苗是有可能的。
由于活疫苗的可能的副作用，開發(fā)純蛋白疫苗是一個(gè)重要目標(biāo)。既然Epstein—Barr病毒膜蛋白gp 250/350(BLLF—1)是高度糖基化的，并且這種翻譯后修飾是正確免疫原性的重要因素(Emini等，1988)，那么，在可生產(chǎn)糖蛋白的真核生物細(xì)胞中以gp 250/350(Epstein—Barr病毒的閱讀框BLLF—1)為基礎(chǔ)開發(fā)疫苗是很有前景的。
本發(fā)明涉及哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，特別是穩(wěn)定表達(dá)作為Epstein—Barr病毒抗原的糖蛋白(gp 250(220))，糖蛋白(gp 350)和/或雜交糖蛋白(gp 250(220)/(gp 350)的倉鼠細(xì)胞系(尤其是在無蛋白培養(yǎng)基中)，由此可避免通過補(bǔ)充培養(yǎng)基而受病毒或細(xì)菌污染的危險(xiǎn)。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)上述糖蛋白的方法。
穩(wěn)定表達(dá)作為EBV抗原的gp 250(220)，gp 350和/或gp250(220)/gp 350的倉鼠細(xì)胞系是公知的；參見，例如，Motz等，在Gene，44(1986)，353—359和Vaccines，87(1987)，374—379，以及Gu Shyan等，在100 Jahre Blutserum—Therapie 1890—1990，Halle(Saale)，(1991)，93—100。然而，尚不知道可用來穩(wěn)定地表達(dá)上述糖蛋白的倉鼠細(xì)胞系。根據(jù)Motz等，在Vaccines 87(1987)，374—379，376中的報(bào)道，病毒外源糖蛋白在CHO細(xì)胞膜中的整合超過某一點(diǎn)時(shí)，會(huì)是毒性的。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，通過下面的遺傳學(xué)方法提出一種倉鼠細(xì)胞系，該細(xì)胞系穩(wěn)定地表達(dá)和分泌上述糖蛋白，通過下述方法得到—用表達(dá)上述糖蛋白而不是膜錨蛋白(Membrananker)的載體轉(zhuǎn)感細(xì)胞系(Motz等，1987)，—其中，載體含有一種細(xì)胞系所沒有的選擇標(biāo)記，—培養(yǎng)細(xì)胞系，利用選擇標(biāo)記選擇出一旦選擇因子(抑制劑)被消除就能穩(wěn)定地表達(dá)和分泌糖蛋白的細(xì)胞。
另外的實(shí)施例提出在無蛋白培養(yǎng)基中生產(chǎn)穩(wěn)定地表達(dá)上述糖蛋白的倉鼠細(xì)胞系的方法的應(yīng)用，它是通過下述步驟得到的(A)從沒有選擇標(biāo)記的倉鼠細(xì)胞系(宿主細(xì)胞系)開始，該選擇標(biāo)記后來被按照(A)(d)染色體整合的載體表達(dá)，或被按照(B)染色體整合的載體表達(dá)(重組細(xì)胞系)，(a)在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，并使它們附著在底物上或相互附著，(b)重復(fù)更換部分被消耗的培養(yǎng)基，同時(shí)逐步降低培養(yǎng)基的血清含量，最后對(duì)其進(jìn)行無血清培養(yǎng)在此—不主動(dòng)地消除細(xì)胞的附著，—可選地，使細(xì)胞球形體形成和分開，分離分開的細(xì)胞球形體，在懸浮液中培養(yǎng)同時(shí)搖動(dòng)，選擇出在小團(tuán)粒中生長(zhǎng)的或單個(gè)生長(zhǎng)的細(xì)胞(c)最后，使選擇出的細(xì)胞經(jīng)過權(quán)利要求1的步驟，或者(B)使如權(quán)利要求1所述的倉鼠細(xì)胞系經(jīng)步驟(A)(a)至(A)(b)。
由于初始細(xì)胞系既不能在無血清培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染也不能在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所以使初始細(xì)胞系或宿主細(xì)胞系在含血清培養(yǎng)基中，例如在MEMα-或α-＋5％FCS中生長(zhǎng)。這種培養(yǎng)基的例子是DIF1000，RPMI 1640，ASF 103和HDB。
為實(shí)現(xiàn)在無蛋白培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)，存在三個(gè)相互關(guān)聯(lián)的問題。
1.例如，在使用培養(yǎng)瓶時(shí)，利用培養(yǎng)基血清消耗過程中的附著。這種方法的結(jié)果是正生長(zhǎng)刺激。另外，消耗的舊培養(yǎng)基和死細(xì)胞以及溶胞作用的產(chǎn)物能被簡(jiǎn)便而溫和地分離(不用離心)。
2.為確保血清消耗過程中培養(yǎng)基良好的自我調(diào)節(jié)能力，只重復(fù)更換部分培養(yǎng)基。
3.使細(xì)胞進(jìn)行緩慢攪拌下的長(zhǎng)期培養(yǎng)，例如在有球形體形成的懸浮培養(yǎng)物的旋轉(zhuǎn)瓶中。對(duì)降低的附著趨勢(shì)的特定選擇使在小團(tuán)粒中生長(zhǎng)的或單個(gè)生長(zhǎng)的細(xì)胞得以分離。首先，分離出大的球形體。然后，在低g值下使上清液分級(jí)離心，分離出的小球形體和單個(gè)細(xì)胞用于進(jìn)一步轉(zhuǎn)接。
當(dāng)采用權(quán)利要求2中所述方法時(shí)，在下面的無蛋白培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)是可能的。下文中，培養(yǎng)基用來指代SMIF(Scharfenberg′s改良Iscove′s培養(yǎng)基，F(xiàn)12培養(yǎng)基)。它是一種特別加富培養(yǎng)基，由約11 Iscove′s改良Dulbecco′s培養(yǎng)基和Ham′s F12營養(yǎng)物(IF)的混合物組成，可以向其中加入例如腐胺(如1.2微摩爾升-1)和L—羥脯氨酸(如153微摩爾升-1)(SMIF1)。另外，對(duì)懸浮液中的生長(zhǎng)，為螯合二價(jià)離子、改善代替無血清培養(yǎng)基(SMIF2)中常采用的蛋白成分運(yùn)鐵蛋白的無機(jī)鐵的有效性，應(yīng)優(yōu)選加入螯合劑，例如，金紅三羧酸(ATA，如3微摩爾升-1)(Bertheussen，1993)，EDTA(如4.3微摩爾升-1)和檸檬酸(如40微摩爾升-1)。
根據(jù)本發(fā)明的特定實(shí)施方案，從中國倉鼠細(xì)胞系(CHO)，如CHO K1＝ATCC CCL61，或從小倉鼠腎臟細(xì)胞系(BHK)，如BHK21C13＝ATCC CCL10開始，可以得到倉鼠細(xì)胞系。
如果根據(jù)本發(fā)明，能產(chǎn)生世代時(shí)間為例如15至40小時(shí)，特別是20至30小時(shí)、穩(wěn)定地表達(dá)上述糖蛋白的倉鼠細(xì)胞系，這種成就必被視為有創(chuàng)造性的，因?yàn)?，至今沒有人不使用選擇性遺傳操作而成功地在無蛋白培養(yǎng)基中培養(yǎng)倉鼠細(xì)胞系。至今，一般認(rèn)為，要表達(dá)所需基因產(chǎn)物，必須借助遺傳工程使哺乳動(dòng)物細(xì)胞系在無蛋白培養(yǎng)基中生長(zhǎng)(NSO Cell line，Hassel等，1992)。
至于選擇標(biāo)記和抑制劑的選擇，熟練人員可根據(jù)已有的相關(guān)技術(shù)。合適的選擇標(biāo)記的一個(gè)例子是二氫葉酸還原酶基團(tuán)(DHFR基因)，合適的抑制劑的一個(gè)例子是氨甲蝶呤(MTX)(Motz等，1987)。
本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方案是倉鼠細(xì)胞系CHO pPMDIIIGP-TR－PFC6＝DSM ACC 2121。
根據(jù)本發(fā)明，經(jīng)下述步驟得到gp 250(220)，gp 350和/或gp250(220)/gp 350，(a)培養(yǎng)本發(fā)明的細(xì)胞系，使表達(dá)所需糖蛋白，(b)從培養(yǎng)基中分離細(xì)胞，特別是借助微量過濾，(c)再借助超濾，特別是交叉流超濾，濃縮和純化清澈的粗上清液，(d)再用陰離子交換柱純化，(e)超濾以及(f)凝膠過濾，得到最后的純糖蛋白(gp)級(jí)分。
根據(jù)本發(fā)明的方法，可以得到天然形式和糖基化形式的糖蛋白。它們因此具有天然的抗原性潛力。由此方法得到的疫苗因而顯示與活性EB病毒的各種蛋白質(zhì)相一致的抗原性特征。得到的疫苗是一種具有高抗原性保護(hù)潛力而沒有致病潛力的安全疫苗。因?yàn)闆]有產(chǎn)生病毒逆轉(zhuǎn)的可能，也沒有滅活病毒的最小危險(xiǎn)和毒性，所以就安全性而言，重組疫苗優(yōu)于滅活疫苗或減活疫苗。
實(shí)施例1CHO pMDIIIGPTR—PFC6的獲得按照Motz等，在Gene，44(1986)，353—359，Motz等，在Gene，58(1987)，149—154和Vaccines，87(1987)374—379中所述方法，用質(zhì)粒pMDIIIGP轉(zhuǎn)染源于缺少二氫葉酸還原酶基因(dhfr—1)的細(xì)胞系CHO K1＝ATCC CCL61的克隆。培養(yǎng)細(xì)胞，用氨甲蝶呤(MTX)選擇出即使不用抑制劑能穩(wěn)定地表達(dá)gp 250/350的克隆。穩(wěn)定表達(dá)gp 250/350的克隆被稱為CHO C6。實(shí)施例2在無蛋白培養(yǎng)基中培養(yǎng)CHO C6在標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)。在1至2個(gè)培養(yǎng)瓶(185cm2，體積約40至50ml；Falcon)中的IF培養(yǎng)基中培養(yǎng)CHOC6，直至細(xì)胞完全鋪滿。在一些情況下已形成多層。隨后，通過每次用新鮮、預(yù)熱過的SMIF1更換含有活和死游離細(xì)胞以及溶胞產(chǎn)物的舊培養(yǎng)基的4/5，以1，0.2，0.04和0.008％的FCS含量，逐步進(jìn)行FCS的稀釋。如果在低FCS含量下培養(yǎng)基中形成游離的球形體，它們?cè)谝瞥雠囵B(yǎng)基之前可以沉降。更換的時(shí)間取決于活力和培養(yǎng)條件，分別決定，最后，培養(yǎng)物上清液營養(yǎng)物含量太低。用于更換的優(yōu)選標(biāo)準(zhǔn)值是葡萄糖含量約為0.7至1g/l。為補(bǔ)充未分解的營養(yǎng)物，至少在一周后更換少量培養(yǎng)基。
當(dāng)培養(yǎng)物消耗到FCS含量為0.008％時(shí)，用新鮮、無蛋白、預(yù)熱過的SMIF1更換全部培養(yǎng)基，進(jìn)一步在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。如果在這些條件下，已經(jīng)有足夠量的球形體形成或分開，就將這些球形體轉(zhuǎn)入一個(gè)小旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶(最小體積40ml)中，約40rpm下在40mlSMIF1(1/4舊條件培養(yǎng)基的＋3/4新鮮培養(yǎng)基)中培養(yǎng)。如果細(xì)胞不分開，只能用酶法將細(xì)胞層從底物中分離，就象通常用來轉(zhuǎn)接附著細(xì)胞所做的那樣。用SMIF1培養(yǎng)基洗滌兩次以使細(xì)胞分開后，從蛋白酶中提取出那些在此條件容易聚集的細(xì)胞，在此之前，細(xì)胞也可轉(zhuǎn)移至小旋轉(zhuǎn)瓶中。
在旋轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)細(xì)胞，直至得到低于40小時(shí)的世代時(shí)間，培養(yǎng)物在小球形體中生長(zhǎng)。在培養(yǎng)基中殘留葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)值為0.5至1g/l時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)接。選擇性地轉(zhuǎn)接小球形體和單個(gè)細(xì)胞。為此目的，在一短時(shí)間內(nèi)不攪拌培養(yǎng)懸浮液，以使大球形體分開。然后，通過離心移出上清液(100g)。菌絲球中的細(xì)胞轉(zhuǎn)入下代。通過加入20—30％(體積)已經(jīng)由過濾或離心從死細(xì)胞或細(xì)胞碎片中清洗出的前代培養(yǎng)基來調(diào)節(jié)培養(yǎng)基。
兩個(gè)適應(yīng)實(shí)驗(yàn)的全過程，每個(gè)都需兩個(gè)月。實(shí)施例3從培養(yǎng)物上清液中處理和純化重組蛋白質(zhì)I.交叉流超濾，再進(jìn)行循環(huán)緩沖為此目的，使用經(jīng)微量過濾的無蛋白SMIF1或SMIF2中的發(fā)酵產(chǎn)物，即得自直至1l規(guī)模的連續(xù)環(huán)流培養(yǎng)物，或從10l氣升式發(fā)酵器中的分批培養(yǎng)物。為過濾，使用具有100kD公稱截留分子量的濾罩(Millipore或Filtron)。交叉流超濾過程中，使用下述標(biāo)準(zhǔn)值(相對(duì)隨機(jī)地選擇)—跨膜壓力不超過約1巴；—管路中存在的要過濾的粗上清液的約1/3從體積流動(dòng)中以濾液形式移出；這相當(dāng)于每一濾罩大約2—3升濾液，吸取能力為如8升/分鐘?！诰彌_交換過程中，使用更低的泵唧本領(lǐng)。
概括地提出下列步驟。前兩個(gè)步驟可以省去，但它們能提高產(chǎn)率。
1.測(cè)定產(chǎn)物總體積，為控制膜，即通過給膜加載和使其極化來調(diào)節(jié)恒定有效的過濾截留分子量，產(chǎn)生約15％(體積)濾液(以正常過濾條件下的體積流動(dòng)計(jì))。
2.上述濾液返回到殘留物(Retentat)。
3.實(shí)際的交叉流超濾進(jìn)行到殘留物降至初始體積的1/50.為止。然而，可以進(jìn)一步濃縮殘留物，尤其是通過使用無蛋白培養(yǎng)基。
4.達(dá)到終體積時(shí)，緩沖—交換并洗滌初級(jí)殘留物。為此，用磷酸緩沖液(20mM；pH7)充滿殘留物至雙倍體積(包括泵和超濾系統(tǒng)的死體積)，每次重新將殘留物濃縮至最小體積，如此進(jìn)行3至4次，為進(jìn)一步處理提供殘留物。這一步驟用于除去低分子外源蛋白質(zhì)，降低后繼純化步驟的離子強(qiáng)度。II.用陰離子交換柱純化使用下述設(shè)備。
柱材料Q—Sepharose High Performance(Pharmacia的一種生物處理材料緩沖體系緩沖液A20mM磷酸緩沖液(pH5.1)緩沖液B含1M NaCl的20mM磷酸緩沖液(pH5.1)規(guī)模例如，裝有FPLC和1ml柱體積的HR5/5柱的小規(guī)模(Pharmacia)；可能放大。
流速恒定的5.1cm/min，相當(dāng)于HR5/5柱中的1ml/min。
用MiliQ處理水將超濾殘留物稀釋至電導(dǎo)為3ms，用HCl調(diào)節(jié)pH至5.1(例如，為分離大量外源蛋白質(zhì)，先調(diào)至pH4.2再調(diào)至5.1)。通過離心除去渾濁。然后，通過FPLC泵給柱加入清澈的上清液，同時(shí)加入5％份緩沖液B來洗脫第一種外源蛋白質(zhì)。最大負(fù)荷約為8mg總蛋白/ml凝膠。之后，通過達(dá)0.4M NaCl的梯度(梯度高于22倍柱體積)洗脫蛋白質(zhì)。
在0.15和0.35M NaCl之間，洗脫掉所需gp 250/350蛋白質(zhì)，聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)后精確地選擇出準(zhǔn)備進(jìn)一步純化的級(jí)分。不加入緩沖液B以及在不同的pH(例如pH7)下也能完成蛋白質(zhì)負(fù)載和分離。對(duì)色譜法中的gp蛋白質(zhì)，進(jìn)樣過程中較低的pH和加入緩沖液B可提高容量。
如果使用磷酸緩沖液，后繼處理步驟之前的循環(huán)緩沖步驟可以省略。然而，其它緩沖體系如檸檬酸緩沖液也是有用的。III.超濾在凝膠過濾柱上通過超濾將步驟II中選擇和收集的蛋白質(zhì)級(jí)分濃縮到約1/10至1/20。蛋白質(zhì)最終濃度在例如1至2mg/ml的范圍內(nèi)。Minicon CS15室(Amico)用于超濾。(在更大的溶劑體積下，可考慮采用相應(yīng)具有更高容量的更大裝置。例如，攪拌細(xì)胞或交叉流超濾元件)。IV.用凝膠過濾法純化柱材料用Superose6(Pharmacia)預(yù)填充的HR10/30柱；用于放大，采用XK 26/100柱中的Sephacryl S—300 High Resolution和Sephacryl S—400 High Resolution。
緩沖體系20mM磷酸緩沖液(pH7)中的同溶劑100或200mMNaCl。
流速例如，2—2.5mm/min。
例如，柱平衡后，用10g蛋白(先被濃縮(CS15)，通過離心從中除去渾濁物)每ml凝膠。以大約2.5mm/min的流速洗脫并分離。收集那些含有g(shù)p 250和/或gp 350、經(jīng)PAGE和銀染色后沒有可見污染的洗脫級(jí)分。
可在約-20℃下、在凝膠過濾法收集的gp級(jí)分中以冷凍形態(tài)穩(wěn)定貯藏純gp 250/350。純化步驟僅有約25—40％粗產(chǎn)品的總產(chǎn)率。對(duì)比實(shí)施例1重復(fù)進(jìn)行實(shí)施例2，不同的是，血清消耗階段不允許細(xì)胞鋪滿，當(dāng)消除細(xì)胞附著之后進(jìn)行FCS的消耗。用這種方法，不能實(shí)現(xiàn)細(xì)胞在無蛋白培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)。
文獻(xiàn)Baer，R.et al.DNA sequence and expression of the B95-8Epstein-Barr virus genome.Nature，310(1984)207-211.Bertheussen，K.Growth of cells in a new defined protein-free medium.Cytotechnology，11(1993)，219-231.Emini，E.A.et al.Antigenic Analysis of the Epstein-Barrvirus major membrane antigen(gp 350/220)expressed in yeastand mammalian cells；implications for the development of asubunit vaccine.Virology，166(1988)387-93.Gu，S.et al.On the first EBV vaccine trial in humans usingrecombinant vaccina virus expressing the major membraneantigen.Proceedings of the Vth International Symposium on″Epstein-Barr virus and associated Diseases″，Annecy，1992(1993).Hassel，T.et al.Stability of recombinant antibodies fromglutamine synthetase amplified CHO and NSO cell lines.InAnimal Cell TechnologyDevelopments，Processes and Products(Spier，R.E.，Griffiths，J.B.，MacDonald，C.，eds.)Butterworths-Heinemann，Oxford，(1992)42-47.Motz M.et al.Truncated versions of the two major Epstein-Barr viral glycoproteins(gp 250/350)are secreted byrecombinant Chinese hamster ovary cells.Gene，58(1987)149-154.
權(quán)利要求
1.在無蛋白培養(yǎng)基中穩(wěn)定地表達(dá)作為Epstein—Barr病素抗原的糖蛋白(gp)250(220)、糖蛋白(gp)350和/或雜交糖蛋白(gp)250(220)/(gp)350的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，它是通過下述步驟得到的(A)從沒有選擇標(biāo)記的倉鼠細(xì)胞系開始，該選擇標(biāo)記后來被按照(A)(c)所述方法進(jìn)行染色體整合的載體表達(dá)，或被按照(B)所述方法進(jìn)行染色體整合的載體表達(dá)，(a)在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，并使它們附著在底物上或相互附著，(b)重復(fù)更換部分被消耗的培養(yǎng)基，同時(shí)緩慢降低培養(yǎng)基的血清含量，最后對(duì)其進(jìn)行無血清培養(yǎng)—不主動(dòng)地消除細(xì)胞的附著，—可選地，使細(xì)胞球形體形成或分開，分離分開的細(xì)胞球形體，在懸浮液中培養(yǎng)同時(shí)搖動(dòng)，選擇出在小團(tuán)粒中生長(zhǎng)的或單個(gè)生長(zhǎng)的細(xì)胞(c)最后，使選擇出的細(xì)胞經(jīng)過如下處理步驟，(ca)用表達(dá)上述糖蛋白(gp)的載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，其中，載體含有一種細(xì)胞系所沒有的選擇標(biāo)記，(cb)培養(yǎng)細(xì)胞系，利用選擇標(biāo)記選擇出一旦不再使用選擇因予(抑制劑)就能穩(wěn)定地表達(dá)糖蛋白的細(xì)胞，或者(B)使哺乳動(dòng)物細(xì)胞系首先經(jīng)過處理步驟(A)(ca)和(A)(cb)，再經(jīng)過處理步驟(A)(a)至(A)(b)。
2.如權(quán)利要求1所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，其特征在于，將一種倉鼠細(xì)胞系，特別是中國倉鼠卵巢細(xì)胞系(CHO)如CHO K1＝ATCC CCL61或小倉鼠腎臟細(xì)胞系(BHK)如BHK 21 C13＝ATCC CCL10作為該哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。
3.如前述任何權(quán)利要求所述的倉鼠細(xì)胞系，其特征在于，將二氫葉酸還原酶基因(DHFR基因)用作選擇標(biāo)記，將氨甲蝶呤(MTX)用作抑制劑。
4.倉鼠細(xì)胞系CHO K1 pMDIHGPTR—PFC6＝DSM ACC2121。
5.生產(chǎn)糖蛋白(gp)250(220)，糖蛋白(gp)350和/或雜交蛋白質(zhì)(gp)250(220)/(gp)350的方法，特征是(a)按權(quán)利要求1至4任何權(quán)項(xiàng)所述方法培養(yǎng)細(xì)胞系，使其表達(dá)所需糖蛋白并將糖蛋白分泌到培養(yǎng)基中，(b)從培養(yǎng)基中分離出糖蛋白。
6.生產(chǎn)糖蛋白(gp)250(220)，糖蛋白(gp)350和/或雜交蛋白質(zhì)(gp)250(220)/(gp)350的方法，特征是(a)按權(quán)利要求1至4任何權(quán)項(xiàng)所述方法培養(yǎng)細(xì)胞系，使其表達(dá)所需糖蛋白并將糖蛋白分泌到培養(yǎng)基中。(b)從培養(yǎng)基中分離出細(xì)胞，特別是利用微量過濾，(c)用交叉流超濾法進(jìn)行濃縮和純化，(d)然后，借助陰離子交換柱純化，(e)超濾和
全文摘要
本發(fā)明涉及哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，特別是能以穩(wěn)定形式表達(dá)作為Epstein-Barr病毒抗原的糖蛋白gp250(220)，350和250(220)/350的倉鼠細(xì)胞系，還涉及從無蛋白培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞中獲得糖蛋白的方法。
文檔編號(hào)C12N5/10GK1124502SQ94192251
公開日1996年6月12日 申請(qǐng)日期1994年4月26日 優(yōu)先權(quán)日1993年4月26日
發(fā)明者H·沃爾夫, K·查爾芬伯格, R·瓦格納 申請(qǐng)人:H·沃爾夫