一種還原響應(yīng)性的載藥納米顆粒及其制備方法和用圖
【專利說明】-種還原響應(yīng)性的載藥納米顆粒及其制備方法和用途 -、技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種載藥納米顆粒，具體地說是一種還原響應(yīng)性的載藥納米顆粒及其 制備方法和用途。 二、【背景技術(shù)】
[0002] 目前，治療腫瘤的主要方法是化學(xué)藥物治療（化療）。但是，化療效果并不令人 滿意。特別是隨著化療的進(jìn)行，腫瘤細(xì)胞對化療藥物逐漸產(chǎn)生的耐藥性（包括多藥耐藥， multi化ugresistance，MDR)，導(dǎo)致臨床化療失敗。目前的研究表明多數(shù)MDR腫瘤細(xì)胞其細(xì) 胞膜存在過度表達(dá)的P-糖蛋白（P-甜），可W將抗癌藥物排出胞外。因此，如何規(guī)避P-甜的 作用是克服此類腫瘤細(xì)胞耐藥性所亟待解決的重要問題。
[0003] 基于高分子材料的納米顆粒被廣泛用作化療藥物的輸送載體，并且運(yùn)些納米載體 通常通過胞吞的途徑進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，可W避免P-糖蛋白的累出，從而有效提高胞內(nèi)總的藥 物濃度，一定程度上可實(shí)現(xiàn)克服耐藥的難題。然而，藥物傳統(tǒng)的納米載體中的釋放一般是通 過被動(dòng)擴(kuò)散來實(shí)現(xiàn)，釋放出的藥物可能會(huì)進(jìn)一步被累出細(xì)胞外。為了避免攝取后藥物的累 出、克服腫瘤耐藥，需要藥物到達(dá)耐藥細(xì)胞后迅速釋放，從而提高胞內(nèi)活性藥物濃度。因而， 刺激響應(yīng)釋放體系在克服腫瘤耐藥方面受到廣泛的關(guān)注，其中包括還原響應(yīng)、pH響應(yīng)、酶響 應(yīng)和溫度響應(yīng)等。 H、
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明旨在提供一種還原響應(yīng)性的載藥納米顆粒及其制備方法和用途，該載藥納 米顆粒是由側(cè)基含二硫鍵的疏水性聚憐酸醋W及親水性聚乙二醇構(gòu)成的兩親性嵌段聚合 物。
[0005] 本發(fā)明載藥納米載體材料的結(jié)構(gòu)式為：
[0006]
[0007] 其中X= 45,y= 15,Z= 20,或者X= 45,y= 12,Z=6。
[0008] 本發(fā)明載藥納米顆粒為兩親性嵌段聚合物，其中親水嵌段是PEG,疏水嵌段 是由側(cè)鏈含二硫鍵的憐酸醋單體2-(2-二硫十二烷基）乙氧基-2-氧-1,3, 2-二氧 憐雜戊燒值SS邸巧W及側(cè)基是乙基的憐酸醋單體2-乙氧基-2-氧-1,3, 2-二氧憐 雜環(huán)戊燒巧E巧無規(guī)共聚而成，我們在此合成了疏水段單體聚合度不同的兩種聚合物 mPEG-b-P值SS邸P-EEP)，其中所述陽G的聚合度為X= 45,其對應(yīng)的數(shù)均分子量為2000 ; 化sEEP鏈段的聚合度y= 15或12,EEP鏈段的聚合度z= 20或6,對應(yīng)的數(shù)均分子量為 8800 ~5520。
[0009] 本發(fā)明載藥納米顆粒的制備包括如下步驟：
[0010] 1、憐酸醋單體的制備
[0011] 首先通過=氯化憐與乙二醇反應(yīng)合成2-氯-2-氧-1,3,2-二氧憐雜環(huán)戊燒（2-ch lo;r〇-2-〇x〇-l, 3, 2-dioxaphospholane,COP)，然后COP與乙醇反應(yīng)合成邸P，COP與 2-徑乙 基十二烷基過硫酸反應(yīng)合成化sEEP。具體的合成方法如下：
[0012] COP的合成：將S氯化憐（3.Omol)溶解于無水二氯甲燒巧00血）中，通過恒壓滴 液漏斗緩慢滴入乙二醇（3.Omol)，待全部滴完后，繼續(xù)反應(yīng)0. 5小時(shí)，減壓蒸除溶劑，連續(xù) 減壓蒸饋兩次將2-氯-1，3,2-二氧憐雜環(huán)戊燒（50°C，200Pa)蒸出；隨后將2-氯-1,3， 2-二氧憐雜環(huán)戊燒溶解在苯中，通入化反應(yīng)48小時(shí)，減壓下蒸除溶劑苯，再于減壓下連續(xù) 蒸饋兩次將2-氯-2-氧-1，3,2-二氧憐雜環(huán)戊燒（88-89°C，20Pa)蒸出，在成氣氛下于4°C 冰箱中保存?zhèn)溆谩?br>[0013] 環(huán)狀憐酸醋單體邸P的制備：用注射器向反應(yīng)器中依次加入0. 3mol乙醇、0. 3mol 的S乙胺和500mL的四氨巧喃燈HF)，將體系冷卻到-5°C，攬拌下滴加COP的四氨巧喃溶 液化154molCOP溶于lOOmL四氨巧喃），約1小時(shí)滴完，滴完后于-5°C反應(yīng)24小時(shí)；反 應(yīng)結(jié)束后將白色的=乙胺鹽酸鹽沉淀物過濾，真空下除去溶劑，于減壓條件下蒸饋（12(rC， 20Pa)兩次純化，得到環(huán)狀憐酸醋單體邸P。
[0014] 環(huán)狀憐酸醋單體化SEEP的制備：用注射器向反應(yīng)器中依次加入0. 3mol2-徑乙基 十二烷基過硫酸、0. 3molS乙胺和500mL四氨巧喃燈HF)，將體系冷卻到-5°C，攬拌下滴加 COP的四氨巧喃溶液化154molCOP溶于lOOmL四氨巧喃），約1小時(shí)滴完，滴完后于-5°C 反應(yīng)24小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后將白色的=乙胺鹽酸鹽沉淀物過濾，真空下除去溶劑，得到環(huán)狀 憐酸醋單體DssEEP。
[0015] 2、嵌段聚合物的合成
[0016] 反應(yīng)在手套箱中進(jìn)行。將mPEGdOOg，0. 05mol，Mn= 2000g/mol)、環(huán)狀憐酸醋單體 DssEEP和EEP溶于THF(10L)中（mPEG:Dss邸P:EEP投料摩爾比為 1:15:20 或 1:12:6)，攬 拌混合均勻后加入催化劑1，5, 7-S氮雜雙環(huán)[4. 4. 0]葵-5-締燈抓，0.Imol)，在25°C下 反應(yīng)3min，加入苯甲酸（0.2mol)終止反應(yīng)；將所得產(chǎn)物在乙酸和甲醇（10/l，v/v)的混合 溶劑中沉淀兩次，抽干，得到聚乙二醇-聚憐酸醋嵌段共聚物。
[0017] 兩親性嵌段共聚物用于藥物傳遞載體已被廣泛研究。當(dāng)兩親性嵌段共聚物溶于其 中一個(gè)嵌段的良溶劑而另外一個(gè)嵌段的不良溶劑時(shí)，共聚物自發(fā)組裝成聚集體，嵌段之間 的共價(jià)鍵阻止了嵌段間的相分離。通過納米沉淀法（Nanoprecipitationmethod)制備聚 乙二醇-聚憐酸醋共聚物的納米顆粒，具體方法如下：
[00化]稱取lOmg聚乙二醇-聚憐酸醋嵌段共聚物溶于DMS0,攬拌溶解，之后加入10血的 超純水，攬拌化；將上述混合液轉(zhuǎn)移到透析袋（MW14000)中，放在水中透析過夜除去DMS0。
[0019] 本發(fā)明載藥納米顆粒的直徑為100±9nm。其中PEG親水段構(gòu)成聚合物納米顆粒 的親水殼層，側(cè)基含二硫鍵的聚憐酸醋構(gòu)成疏水內(nèi)核。運(yùn)種嵌段聚合物在水中能自組裝形 成膠束，通過物理包埋作用將藥物分子（如阿霉素）載入載體納米粒子的疏水內(nèi)核，大幅提 高藥物溶解度，延長循環(huán)時(shí)間，血管滲透性增強(qiáng)效應(yīng)（即EPR效應(yīng)增強(qiáng)）被動(dòng)祀向至腫瘤組 織。并且，該載藥納米顆粒通過內(nèi)吞被腫瘤細(xì)胞攝取后，在胞內(nèi)還原環(huán)境下，二硫鍵斷裂，藥 物快速釋放，避免P-糖蛋白的累出，克服腫瘤耐藥，是一種具有應(yīng)用前景的納米藥物載體。 運(yùn)種納米藥物載體可包載多種疏水性抗腫瘤藥物，例如阿霉素、紫杉醇、吉非替尼、喜樹堿 等疏水性藥物。 四、
【附圖說明】
[0020] 圖1為共聚物陽G-b-P值ssEEP-EEP)的合成路線。
[0021]圖2為共聚物mPEG45-b-P值SS邸P巧-EEPzo)、mPEG45-b-P值SS邸Pi2-EEPe)的iH NMR。 陽0巧圖3為大分子陽G引發(fā)劑及共聚物m陽G45-b-P值ssEEPis-EEPzo)、 mPEG4日-b-P值SS邸Pi2-EEPe)的GPC譜。
[0023] 圖4為巧探針檢測納米顆粒在還原劑DTT處理不同時(shí)間時(shí)的激發(fā)光譜。
[0024] 圖5為兩種載藥納米顆粒在水溶液中的粒徑及粒徑分布圖。
[0025] 圖6為兩種材料的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。
[00%]圖7為兩種載藥顆粒體外釋放曲線。
[0027] 圖8為納米藥物被耐藥腫瘤細(xì)胞的攝取。
[0028] 圖9為載藥顆粒的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。
[0029] 圖10為腫瘤抑制曲線。 五、
【具體實(shí)施方式】
[0030] 本發(fā)明提供了嵌段共聚物聚乙二醇-聚憐酸醋的合成及其自組裝形成的載藥納 米顆粒。該共聚物包括聚乙二醇（A嵌段）和聚憐酸醋度嵌段），所述A嵌段為聚乙二醇 (PEG)，B嵌段是由側(cè)基為乙基的憐酸醋單體ffiP和側(cè)基含二硫鍵的憐酸醋單體化sEEP兩 種單體無規(guī)共聚而合成的P值ssEEP-EEP)。所W上述嵌段共聚物聚乙二醇-聚憐酸醋表示 為陽G-b-P值ssEEP-EEP)
[0031] 上述嵌段共聚物可按照下述方法合成：W大分子引發(fā)劑聚乙二醇（陽G)的端徑基 在TBD的催化下引發(fā)單體邸P、化sEEP開環(huán)聚合。通過控制憐酸醋環(huán)狀單體與聚乙二醇的 投料比可W制備不同嵌段長度的兩嵌段共聚物。聚乙二醇-聚憐酸醋共聚物可降解，具有 良好的生物相容性，并且可還原響應(yīng)性釋放藥物。
[0032] 本發(fā)明中的A嵌段是聚乙二醇，為親水性聚醋，其相對分子量為2000。
[003