專利名稱：一種檢測糖蛋白的方法
一種檢測糖蛋白的方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說，本發(fā)明描述了一種糖蛋白檢測芯片的制備及檢測方法。
背景技術(shù)：
生物分子中的糖蛋白在很多生命活動和代謝調(diào)節(jié)中起著重要的作用.一些蛋白表面糖基化的變化通常和預(yù)示著一些疾病的發(fā)生，特別是一些與癌癥相關(guān)的糖蛋白。糖蛋白在生命學(xué)科中的重要性也導(dǎo)致了糖蛋白組學(xué)快速發(fā)展。這個學(xué)科主要任務(wù)就是分析一些糖蛋白的相關(guān)糖族。傳統(tǒng)的分析方法包括質(zhì)譜以及色譜。雖然這些方法已經(jīng)很成熟，但是也存在一些問題，比如設(shè)備本身昂貴，分析耗時，需要專業(yè)人員操作。因而也阻礙了這些技術(shù)在糖蛋白檢測中的普及。發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明針對上述技術(shù)問題，提供一種糖蛋白的檢測方法，對相應(yīng)糖蛋白的檢測具有檢測限低、選擇性好、靈敏度高和方便的特點。
技術(shù)方案本發(fā)明的檢測糖蛋白的方法利用氧化鋅量子點標(biāo)記糖蛋白；同時在電解池中的芯片上固定化一層凝集素，在一系列已知濃度的待測糖蛋白溶液中，使標(biāo)記了氧化鋅量子點的糖蛋白和芯片上的凝集素進(jìn)行特異性結(jié)合，把標(biāo)記在糖蛋白上的氧化鋅量子點連接到芯片上，再采用氧化鋅量子點標(biāo)記糖蛋白的溶出伏安法凝集素測定方法，具體步驟描述為1.)將0.5飛毫克氧化鋅量子點分散到5(Γ200微升10(Γ200納克/毫升的糖蛋白溶液中，在室溫下震蕩lOmin，離心，用ρΗ值為6. 8^7. 5的磷酸鹽緩沖溶液清洗三次；再加500 UL 1% 八牛血清蛋白，15 37°(下震蕩10 301^11，離心，用？!1值為6.8 7.5的磷酸鹽緩沖溶液清洗三次；最終分散于50 150 μ L 0. 05 0. 1% ν/ν曲拉通Χ-100 ρΗ值為6. 8 7. 5 的磷酸鹽緩沖溶液，不用時保存于冰箱保溫層；2.)將二氧化硅片或玻璃片分別在丙酮、乙醇和水中分別超聲5min，然后在6(Γ80° C 的ΝΗ40Η/Η202 /H2O 1:1:5 7，ν/ν和HC1/H202/H20 1 1 4 6，ν/ν分別浸泡 5 IOmin ；拿出后用清水洗干凈，晾干；然后放入2 5% ν/ν的3-胺丙基乙氧基硅烷的乙醇溶液中浸泡2飛 h，洗干凈、晾干，再放入l(Tl5mL含有ν/ν戊二酵DH倌為6. 8 7. 5的磷酸鹽緩沖溶液，于4°C靜置纊12 h，隨后用去離子水清洗、晾干，待用；3.)將修飾后的芯片安裝在一個孔徑小于芯片邊長的電解池中，將50PL含有1 2mg/mL凝集素ρΗ值為6.纊7. 5的磷酸鹽緩沖溶液滴在上述處理好的芯片上，并于4°C 靜置纊12 h，隨后用去離子水清洗；然后將上述芯片用含0.5 1% w/v牛血清蛋白和0.05 、.1% ν/ν吐溫-20浸泡0. 5 1 h，隨后用去離子水清洗、待用；4.)取1步中5(T100uL滴在3步制備好的芯片上，放置15飛Omin，用去離子水清洗芯片表面3次；5.)檢測方法，將待測樣品滴在4步中的芯片上，放置15 50min，用去離子水清洗芯片表面3次；6.)向電解池中注入pH值為廣3的鹽酸溶液溶解第5步芯片上的留下的氧化鋅量子點，井用ΡΗΓ3鹽酸溶液洗三次，合并溶解液和洗液，加pH值為6. 8^7. 5的磷酸鹽緩沖溶液至Γ3毫升；7.)用鉬電極為對電極，銀/氯化銀電極為參比電極，汞膜電極為工作電極，-0.8^-1. 5伏富集9(Γ150秒，用方波伏安法測鋅的溶出峰，電位約在-1. 1伏；8.)改變第5步糖蛋白濃度，重復(fù)第7步，測定一系列糖蛋白濃度相對應(yīng)的鋅的溶出伏安峰的峰值電流，建立峰值電流與糖蛋白濃度之間的對應(yīng)關(guān)系。
有益效果與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點1.本發(fā)明氧化鋅量子點對糖蛋白的標(biāo)記過程與溶出過程，操作簡單，條件溫和，量子點與糖蛋白的結(jié)合穩(wěn)定牢固。非常有利于保持糖蛋白的生物活性。
2本發(fā)明運用溶出伏安法測鋅離子濃度，易于鋅在汞電極上的富集，鋅的溶出峰易測且峰值電流強，易于建立準(zhǔn)確的峰值電流與糖蛋白濃度之間的曲線關(guān)系。有利于降低糖蛋白檢測的檢測限，提高檢測靈敏度。使快速準(zhǔn)確檢測低濃度糖蛋白成為可能。


下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書所界定的本發(fā)明范圍。
圖1是糖蛋白檢測芯片組裝示意圖。
圖2是標(biāo)準(zhǔn)樣品的糖蛋白芯片檢測結(jié)果。
具體實施方式
在本發(fā)明中，利用量子點標(biāo)記糖蛋白。同時在芯片上固定化一層凝集素，使標(biāo)記了氧化鋅量子點的糖蛋白和芯片上的凝集素進(jìn)行特異性結(jié)合，把標(biāo)記在糖蛋白上的氧化鋅量子點連接到芯片上。然后用芯片去檢測待測的糖蛋白，因為標(biāo)記的糖蛋白和待測的糖蛋白和凝集素結(jié)合能力的不同，不同濃度的待測糖蛋白會取代芯片上標(biāo)記的糖蛋白，用溶出伏安法測定溶出的芯片上留下的鋅離子的濃度，建立鋅離子濃度與糖蛋白濃度之間的關(guān)系， 從而確定待測糖蛋白濃度。本發(fā)明的技術(shù)解決方案為采用凝集素芯片對量子點標(biāo)記與未標(biāo)記的糖蛋白結(jié)合能力的差異來檢測待測糖蛋白，具體方法過程如附圖1，測定步驟描述為(如圖1)1，將0.5毫克氧化鋅量子點分散到200 μ L 100 ng/mL的癌胚抗原溶液中，在室溫下震蕩lOmin，離心，用pH值為7.0的磷酸鹽緩沖溶液清洗三次。再加500 μ L 1% (w/v)牛血清蛋白，室溫下震蕩lOmin，離心，用pH值為7. O的磷酸鹽緩沖溶液清洗三次。最終分散于50 μ L 0.1% (ν/ν)曲拉通X-IOO磷酸緩沖溶液，不用時保存于冰箱保溫層。
2，將玻璃片(1x1x0. 2mm)分別在丙酮、乙醇和水中分別超聲5min，然后在80 ° C 的 NH40H/H202 /H2O (1:1:7，ν/ν )和 HC1/H202/H20 (1:1:6，ν/ν)分別浸泡 IOmin0 拿出后用清水洗干凈，晾干。然后放入5% (ν/ν) 3-胺丙基乙氧基硅烷的乙醇溶液中浸泡5 h，洗干凈、晾干，再放入含有戊二醛PH值為7.0的磷酸鹽緩沖溶液，于4°C靜置12 h， 隨后用去離子水清洗、晾干，待用。
3，將修飾后的安裝在一個孔徑小于芯片邊長的電解池中，將50 μ L含有1 mg/mL 刀豆凝集素PH值為7. 0的磷酸鹽緩沖溶液滴在上述處理好的芯片上，并于4°C靜置12 h,隨后用去離子水清洗。然后將上述芯片用含1% (w/v)牛血清蛋白和0.05 % (ν/ν)吐溫-20浸泡1 h，隨后用去離子水清洗、待用。
4，取1步中50uL滴在3步制備好的芯片上，放置15min，用去離子水清洗芯片表面3次。
5，檢測方法，將lOng/mL癌胚抗原滴在4步中的芯片上，放置15min，用去離子水清洗芯片表面3次。
6，向電解池中注入1800 μ L pH值為2的鹽酸溶液超聲IOmin以溶解5步芯片上的氧化鋅量子點。隨后上如溶液轉(zhuǎn)移到電解池并依次加入2000 μ L PH值為7. 01的磷酸鹽緩沖溶液，4uL 10 ppm硝酸汞(II)。50 μ L濃度為0. 32Μ氫氧化鈉溶液。然后用電化學(xué)檢測，7，用鉬電極為對電極，銀/氯化銀電極為參比電極，汞膜電極為工作電極，-1.3 V電富集2 min，用方波伏安法測鋅的溶出峰，電位約在-1. 1伏。
8，改變第5步糖蛋白濃度，重復(fù)第7步，測定一系列糖蛋白濃度相對應(yīng)的鋅的溶出伏安峰的峰值電流，建立峰值電流與糖蛋白濃度之間的對應(yīng)關(guān)系。(圖2)。
以上過程測得的鋅的溶出伏安峰值電流與糖蛋白濃度之間的對應(yīng)關(guān)系是本發(fā)明方法的重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為用此發(fā)明方法進(jìn)行實際臨床檢測提供濃度判定的理論依據(jù)，對利用本發(fā)明方法進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的臨床檢測有著極其重要的意義。
上述凝集素與糖蛋白為刀豆凝集素及其癌胚抗原。
上述芯片為二氧化硅片或玻璃片。
權(quán)利要求
1. 一種檢測糖蛋白的方法，其特征在于利用氧化鋅量子點標(biāo)記糖蛋白；同時在電解池中的芯片上固定化一層凝集素，在一系列已知濃度的待測糖蛋白溶液中，使標(biāo)記了氧化鋅量子點的糖蛋白和芯片上的凝集素進(jìn)行特異性結(jié)合，把標(biāo)記在糖蛋白上的氧化鋅量子點連接到芯片上，再采用氧化鋅量子點標(biāo)記糖蛋白的溶出伏安法凝集素測定方法，具體步驟描述為1.)將0.5飛毫克氧化鋅量子點分散到5(Γ200微升10(Γ200納克/毫升的糖蛋白溶液中，在室溫下震蕩lOmin，離心，用ρΗ值為6. 8^7. 5的磷酸鹽緩沖溶液清洗三次；再加500 UL 1% 八牛血清蛋白，15 37°(下震蕩10 301^11，離心，用？!1值為6.8 7.5的磷酸鹽緩沖溶液清洗三次；最終分散于50 150 μ L 0. 05 0. 1% ν/ν曲拉通Χ-100 ρΗ值為6. 8 7. 5 的磷酸鹽緩沖溶液，不用時保存于冰箱保溫層；.2.)將二氧化硅片或玻璃片分別在丙酮、乙醇和水中分別超聲5min，然后在6(Γ80° C 的ΝΗ40Η/Η202 /H2O 1:1:5 7，ν/ν和HC1/H202/H20 1 1 4 6，ν/ν分別浸泡 5 IOmin ；拿出后用清水洗干凈，晾干；然后放入2 5% ν/ν的3-胺丙基乙氧基硅烷的乙醇溶液中浸泡2飛 h，洗干凈、晾干，再放入l(Tl5mL含有ν/ν戊二醛ρΗ值為6. 8 7. 5的磷酸鹽緩沖溶液，于4°C靜置纊12 h，隨后用去離子水清洗、晾干，待用；.3.)將修飾后的芯片安裝在一個孔徑小于芯片邊長的電解池中，將50PL含有1 2mg/mL凝集素ρΗ值為6.纊7. 5的磷酸鹽緩沖溶液滴在上述處理好的芯片上，并于4°C 靜置纊12 h，隨后用去離子水清洗；然后將上述芯片用含0.5 1% w/v牛血清蛋白和0.05 、.1% ν/ν吐溫-20浸泡0.5 1 h,隨后用去離子水清洗、待用；.4.)取1步中5(T100uL滴在3步制備好的芯片上，放置15飛Omin，用去離子水清洗芯片表面3次；.5.)檢測方法，將待測樣品滴在4步中的芯片上，放置15 50min，用去離子水清洗芯片表面3次；.6.)向電解池中注入ρΗ值為廣3的鹽酸溶液溶解第5步芯片上的留下的氧化鋅量子點，井用ΡΗΓ3鹽酸溶液洗三次，合并溶解液和洗液，加ρΗ值為6. 8^7. 5的磷酸鹽緩沖溶液至Γ3毫升；.7.)用鉬電極為對電極，銀/氯化銀電極為參比電極，汞膜電極為工作電極，-0.8^-1. 5伏富集9(Γ150秒，用方波伏安法測鋅的溶出峰，電位約在-1. 1伏；.8.)改變第5步糖蛋白濃度，重復(fù)第7步，測定一系列糖蛋白濃度相對應(yīng)的鋅的溶出伏安峰的峰值電流，建立峰值電流與糖蛋白濃度之間的對應(yīng)關(guān)系。
全文摘要
本發(fā)明是一種檢測糖蛋白的方法，利用氧化鋅量子點標(biāo)記糖蛋白；同時在電解池中的芯片上固定化一層凝集素，在一系列已知濃度的待測糖蛋白溶液中，使標(biāo)記了氧化鋅量子點的糖蛋白和芯片上的凝集素進(jìn)行特異性結(jié)合，把標(biāo)記在糖蛋白上的氧化鋅量子點連接到芯片上，再采用氧化鋅量子點標(biāo)記糖蛋白的溶出伏安法凝集素測定方法，因為標(biāo)記的糖蛋白和待測的糖蛋白和凝集素結(jié)合能力的不同，不同濃度的待測糖蛋白會取代芯片上標(biāo)記的糖蛋白，用溶出伏安法測定溶出的芯片上留下的鋅離子的濃度，建立鋅離子濃度與糖蛋白濃度之間的關(guān)系，從而確定待測糖蛋白濃度。
文檔編號G01N27/48GK102520162SQ201110364700
公開日2012年6月27日 申請日期2011年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月17日
發(fā)明者徐春祥, 楊池, 王明亮, 石增良 申請人:東南大學(xué)