出血熱相關(guān)病原體鑒別基因芯片的制備和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及十六種出血熱相關(guān)病原體核酸檢測基因芯片的制備和用途，屬基因芯 片檢測技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 病毒性出血熱（ViralHemorrhagicFever，VHF)是一組由不同類型病毒引起， 以發(fā)熱、出血為主要臨床癥狀的一組自然疫源性疾病。出血熱病毒主要分布在絲狀病毒科 (Filoviridae)、沙粒病毒科（Arenaviridae)、布尼亞病毒科（Bunyaviridae)和黃病毒科 (Flaviviridae)?？梢l(fā)出血熱的病毒種類繁多，其中在全球范圍內(nèi)影響較大的包括：絲狀 病毒科埃博拉病毒、馬爾堡病毒、沙粒病毒科拉沙病毒、鳩寧病毒、馬秋波病毒、布尼亞病毒 科裂谷熱病毒、克里米亞-剛果出血熱病毒、漢坦病毒、發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒、黃 病毒科登革病毒、黃熱病毒、披膜病毒科基孔肯雅病毒等。該類疾病發(fā)病初期的臨床表現(xiàn)并 不特異，類似流感、瘧疾，?？砂l(fā)展到皮下、體腔和內(nèi)臟出血，隨之而來的是休克、昏迷和神 經(jīng)功能障礙等，病死率高，危害嚴(yán)重。
[0003] 出血熱病毒宿主和媒介類型廣泛，傳播方式多種多樣，隨著經(jīng)濟(jì)全球化的進(jìn)展，各 地區(qū)商貿(mào)往來和人員交流更加快捷頻繁，宿主和媒介分布的地理界線被打破，從而導(dǎo)致疫 情流行范圍的擴(kuò)大和突然暴發(fā)，也增加了發(fā)生輸入性疫情的可能。2014年西非暴發(fā)的埃博 拉出血熱是由埃博拉病毒引起的急性出血性傳染病，自2014年3月報(bào)告出現(xiàn)首批病例到 12月24日共有19497人疑似或確認(rèn)感染，導(dǎo)致7588人死亡，是1976年首次發(fā)現(xiàn)埃博拉病 毒以來發(fā)生的最大且最復(fù)雜的埃博拉疫情，本次疫情出現(xiàn)的病例和死亡數(shù)字超過了所有其 它疫情的總和。WHO已將埃博拉病毒列為對(duì)人類危害最嚴(yán)重的病毒之一，其平均病死率約 為50 %，在以往疫情中出現(xiàn)的病死率從25 %到90 %不等，目前發(fā)現(xiàn)有五個(gè)亞型，其中扎伊 爾型和蘇丹型病死率最高，分別可達(dá)88. 8%和53. 2%。2014年中國廣東暴發(fā)登革熱，至12 月1日廣東累計(jì)報(bào)告登革熱病例45053例。據(jù)估計(jì)，全球每年實(shí)際感染登革病毒的病例高 達(dá)3. 9億，其中超過2萬人因嚴(yán)重感染而死亡。不僅既往發(fā)現(xiàn)的病毒疫情不時(shí)暴發(fā)，引起新 發(fā)傳染病的新病毒也不斷被發(fā)現(xiàn)。2010年我國發(fā)現(xiàn)具有重要公共衛(wèi)生意義的新型布尼亞 病毒--發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒（SevereFeverwithThrombocytopeniaSyndrome Virus，SFTSV)，該病毒感染人體引起的發(fā)熱伴血小板減少綜合征，是一種以發(fā)熱伴白細(xì)胞、 血小板減少和多臟器功能損傷為主要臨床表現(xiàn)的新發(fā)傳染病，死亡率高達(dá)30%。目前已在 山東、湖北、浙江、江蘇等多個(gè)省市發(fā)現(xiàn)SFTSV感染病例，2011-2013年，美國密蘇里州、日 本、韓國也相繼報(bào)道發(fā)現(xiàn)有經(jīng)蜱蟲叮咬傳播的類似SFTSV病毒感染病例，SFTSV感染已逐漸 成為全球性的重要公共衛(wèi)生問題。
[0004] 由于病毒性出血熱病死率高，傳播途徑廣，極易造成社會(huì)恐慌，美國疾病預(yù)防控制 中心將出血熱病毒列為一類生物武器，因此病毒性出血熱的防控和治療手段顯得尤為重 要。但目前已商業(yè)化的出血熱疫苗只有腎綜合征出血熱疫苗和黃熱病疫苗，另外尚有阿根 廷出血熱疫苗和裂谷熱疫苗處于臨床試驗(yàn)階段；在藥物治療方面，尚無針對(duì)病毒性出血熱 的特效藥物。"診"、"防"、"治"三個(gè)環(huán)節(jié)構(gòu)成了完整的疾病預(yù)防控制鏈，其中"診"不僅是其 中不可缺少的關(guān)鍵一環(huán)，而且也是有效防治的如提。在病毒性出血熱的尚發(fā)和臨床治療手 段的缺乏情況下，準(zhǔn)確有效的診斷病原體顯得尤為重要。
[0005] 由于多數(shù)感染者早期缺乏特異的臨床表現(xiàn)，且不同的病毒性出血熱之間或者病毒 性出血熱與其他疾?。ɡ绡懠?、流感等）之間都存在相似的臨床癥狀，必須依賴實(shí)驗(yàn)室 診斷方法加以確認(rèn)。目前常用的出血熱病原體實(shí)驗(yàn)室檢測方法主要包括病毒分離、聚合酶 鏈反應(yīng)法（PCR)、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)、間接免疫熒光法（IFA)、電鏡技術(shù)（EM)和免疫 組化技術(shù)。上述方法都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，有的方法操作復(fù)雜，耗時(shí)費(fèi)力；有的方法特異性和 /或敏感性較低；有的方法樣本用量過多；且上述方法均存在檢測通量不足，檢測范圍有限 的問題。
[0006] 基因芯片（Genechip)又稱為DNA芯片（DNAchip)、DNA微陣列（DNA microarray)，是生物芯片的一種，也是生物芯片技術(shù)中發(fā)展最成熟、最先進(jìn)入應(yīng)用和實(shí)現(xiàn) 商品化的技術(shù)?；蛐酒夹g(shù)是指直接將DNA探針或者在固相支持物（如玻片、硅片、尼龍 膜等）上原位合成寡核苷酸固定于支持物表面，然后與待分析的標(biāo)記樣品雜交，標(biāo)記的樣 品通過于基因芯片上已知堿基序列的DNA片段互補(bǔ)雜交，從而得到樣品的遺傳信息，確定 樣品的核酸序列，或?qū)虮磉_(dá)量及其特性進(jìn)行分析。基因芯片技術(shù)因其具有快速、準(zhǔn)確、 高通量、高效率、低成本等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于表達(dá)譜分析、單核苷酸多態(tài)性分析、疾病診斷、 病原微生物檢測等方面。
[0007] 本研究結(jié)合出血熱診斷的實(shí)際需要，選取了十三種出血熱相關(guān)病毒，并加入可引 起相似癥狀的瘧原蟲及流感病毒，旨在研制出血熱相關(guān)病原體鑒別基因芯片。基于化學(xué)發(fā) 光檢測方法，同時(shí)檢測十六種出血熱相關(guān)病原體，包括扎伊爾型埃博拉病毒、蘇丹型埃博拉 病毒、馬爾堡病毒、拉沙病毒、鳩寧病毒、馬秋波病毒、裂谷熱病毒、克里米亞 -剛果出血熱 病毒、瘧原蟲、漢坦病毒、發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒、登革病毒、黃熱病毒、基孔肯雅病 毒、A型流感病毒、B型流感病毒。該芯片法特異性高，敏感性強(qiáng)，適合于多種致發(fā)熱病癥病 原體的快速鑒定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于提供一種基因芯片，該芯片可同時(shí)檢測十六種出血熱相關(guān)病原 體，包括扎伊爾型埃博拉病毒、蘇丹型埃博拉病毒、馬爾堡病毒、拉沙病毒、鳩寧病毒、馬秋 波病毒、裂谷熱病毒、克里米亞 -剛果出血熱病毒、癥原蟲、漢坦病毒、發(fā)熱伴血小板減少綜 合征病毒、登革病毒、黃熱病毒、基孔肯雅病毒、A型流感病毒、B型流感病毒，具有快速、準(zhǔn) 確、高通量、高靈敏度的特點(diǎn)，可為出血熱病原的診斷、衛(wèi)生監(jiān)督及傳染病防控提供一種新 的技術(shù)手段。
[0009] 本發(fā)明所述的基因芯片其制備方法包括如下步驟：
[0010] 1?制備特異性引物
[0011] 經(jīng)過比對(duì)各病原體基因組，選擇特異、保守片段作為檢測靶基因，在保證各病原體 靶基因特異性擴(kuò)增的前提下兼顧其靈敏度，故將病原體特異性引物進(jìn)行多重分管組合，經(jīng) 優(yōu)化最終確定了 3管多重TR-PCR體系。優(yōu)選的29條特異性引物及其對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增靶病原種 類和分管組合情況如表1所示，各下游引物5'端標(biāo)記生物素。
[0012] 表1出血熱相關(guān)病原體引物及其對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增靶病原種類和分管組合情況
[0013]
[0015] 2?制備特異性探針
[0016] 本著型間保守、屬間特異的原則，根據(jù)16種相關(guān)病原體靶基因序列間的比對(duì)，在 上下游引物范圍內(nèi)的序列相對(duì)特異區(qū)進(jìn)行特異性探針的設(shè)計(jì)。每種靶病原對(duì)應(yīng)一條特異性 寡核苷酸探針，優(yōu)選的特異性探針序列如表2所示，每條探針的3'端加入12個(gè)堿基T并在 3'末端以氨基修飾。
[0017] 表2特異性探針序列及對(duì)應(yīng)的靶病原
[0018]
[0019] 3.制備基因芯片
[0020] 一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，步驟2中各個(gè)寡核苷酸探針在點(diǎn)樣時(shí)，用芯片點(diǎn)樣液 (6XSSC，5 %甘油，0. 1 %SDS)稀釋至終濃度50yM。用市售的基因芯片點(diǎn)樣儀以接觸式 點(diǎn)樣方式將探針點(diǎn)到空白的醛基化修飾玻片上（陣列如表3所示），各探針的點(diǎn)樣量均為 3nl，其中質(zhì)控探針為20T序列，5'端生物素標(biāo)記、3'端氨基修飾，用來監(jiān)測醛基片片基質(zhì) 量。點(diǎn)制過程保持一定濕度，寡核苷酸芯片制備完畢后，芯片應(yīng)至少在室溫干燥放置24小 時(shí)，使探針與載體充分交聯(lián)。
[0021] 表3寡核苷酸探針陣列

[0023] 4.建立RT-PCR體系
[0024] 本發(fā)明基因芯片中RT-PCR體系的特征為不對(duì)稱多重RT-PCR反應(yīng)體系。合適的 RT-PCR體系可以進(jìn)一步提高芯片的檢測靈敏度。對(duì)標(biāo)記引物和非標(biāo)記引物的絕對(duì)濃度和相 對(duì)比例、酶的用量等因素進(jìn)行了優(yōu)化。優(yōu)選的RT-PCR體系及擴(kuò)增條件，如表4所示：
[0025] 表4-1不對(duì)稱多重RT-PCR體系配方
[0029] 5?建立芯片雜交體系
[0030] 合適的雜交體系對(duì)芯片的特異性及靈敏度改善也有很大的促進(jìn)作用。通過優(yōu)化得 到了同時(shí)可以保證特異性和靈敏度的預(yù)洗液及雜交液成分、雜交條件和雜交后洗滌條件。 基因芯片雜交前分別置于預(yù)洗液（0.2%SDS)與去離子水中清洗20s，RT-PCR產(chǎn)物在95°C 變性5min后立即置于冰水浴中。將RT-PCR產(chǎn)物與雜交液等體積混合，優(yōu)選的雜交液各組 分為8XSSC，10%甲酰胺，1.2%SDS，10XDenhardt's。優(yōu)選的雜交條件為45°C水浴雜交 1小時(shí)。優(yōu)選的洗滌條件為分別在洗液A(1XSSC，0. 2%SDS)，洗液B(0. 2XSSC)和洗液 C(0?IXSSC)中各洗滌 20s。
[0031] 6?建立信號(hào)檢測方法
[0032]將標(biāo)記液（Str印tavidin-HRP)用稀釋液（1XPBS+0. 1%BSA)以 1 : 1000 稀釋， 于每個(gè)雜交區(qū)加入15y1，芯片置于37°C孵育30min。取出后用PBST洗液（1XPBS+0. 05% Tween-20)清洗20s，晾干。將化學(xué)發(fā)光HRP底物A液和B液（Millipore公司）等體積混 勻，每個(gè)雜交區(qū)加入20y1并迅速展開鋪勻，立即置于化學(xué)發(fā)光成像儀中掃描。記錄結(jié)果， 根據(jù)信號(hào)強(qiáng)度對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定。
[0033] 以上制備的出血熱相關(guān)病原體鑒別基因芯片包括寡核苷酸芯片、RT-PCR體系、雜 交液、洗液A、洗液B、洗液C、Str印tavidin-HRP、稀釋液、PBST洗液、化學(xué)發(fā)光HRP底物A液 和B液。
[0034] 本發(fā)明建立了一種基于化學(xué)發(fā)光技術(shù)平臺(tái)的基因芯片，可以對(duì)16種出血熱相關(guān) 病原體進(jìn)行區(qū)分，包括扎伊爾型埃博拉病毒、蘇丹型埃博拉病毒、馬爾堡病毒、拉沙病毒、鳩 寧病毒、馬秋波病毒、裂谷熱病毒、克里米亞 -剛果出血熱病毒、癥原蟲、漢坦病毒、發(fā)熱伴 血小板減少綜合征病毒、登革病毒、黃熱病毒、基孔肯雅病毒、A型流感病毒、B型流感病毒。 該基因芯片和相應(yīng)的制備方法，具有較強(qiáng)的實(shí)用性，通過一次實(shí)驗(yàn)操作實(shí)現(xiàn)多個(gè)病種的檢 測，在縮短檢測周期的同時(shí)提高檢測效率。與常規(guī)培養(yǎng)方法比較，具有快速、準(zhǔn)確、靈敏的優(yōu) 勢，與免疫學(xué)方法和其他核酸檢測方法相比，具有高通量、高特異性的優(yōu)點(diǎn)，可為出血熱病 原的診斷、衛(wèi)生監(jiān)督及傳染病防控提供一種新的技術(shù)手段。
【附圖說明】
[0035] 圖1:基因芯片外觀示意圖，每張芯片上有10個(gè)相同的分布有探針點(diǎn)陣的雜交反 應(yīng)區(qū)。
[0036] 圖2 :出血熱相關(guān)病原體鑒別基因芯片探針點(diǎn)陣布局圖，其中Ia至8a為質(zhì)控點(diǎn)； Ib至Id為扎伊爾型埃博拉病毒探針；2b至