抗豬生殖與呼吸綜合征病毒的動物的制作方法
【專利說明】
[0001] 本申請為2012年5月16日提交的，發(fā)明名稱為"抗豬生殖與呼吸綜合征病毒的動 物"的PCT申請PCT/US2012/038193的分案申請，所述PCT申請進(jìn)入中國國家階段的日期為 2013 年 11 月 15 日，申請?zhí)枮?201280023487. 4。
[0002] 政府支持
[0003] 本發(fā)明是在由農(nóng)業(yè)部授予的合同號（USDA/ARS) 58-1940-8-868的政府支持下進(jìn) 行。政府具有本發(fā)明的某些權(quán)利。
[0004] 序列表
[0005] 本申請含有2012年5月15日生成的標(biāo)題為"UM0 11053.WOSEQ_ST25"的序列表， 其據(jù)此通過引用整體并入。
技術(shù)領(lǐng)域
[0006] 本發(fā)明通常涉及經(jīng)基因修飾的豬，其中SIGLEC1基因的至少一個(gè)等位基因已經(jīng)失 活和/或⑶163基因的至少一個(gè)等位基因已經(jīng)失活。還提供了產(chǎn)生此類轉(zhuǎn)基因豬的方法。
[0007] 發(fā)明背景
[0008] 豬生殖與呼吸綜合征病毒是豬經(jīng)濟(jì)上最重要的疾病之一。1987年在美國 (Keffaber1989)和1990年在歐洲（Wensvoort等1991)首先檢測到這種疾病。對原型 PRRS病毒（PRRSV)VR-2332和雷皇斯塔德（Lelystad)(分別為美國和歐洲分離株）的分子 分析已經(jīng)表明，趨異進(jìn)化菌株幾乎同時(shí)出現(xiàn)在兩個(gè)大洲，這可能是由于豬管理實(shí)踐上的類 似變化（Murtaugh等1995 ;NelSen等1999)。自從其最初出現(xiàn)以來，這種病毒就在世界范圍 內(nèi)傳播，并且在美國豬群中已經(jīng)檢測到歐洲基因型的PRRSV(Ropp等2004)。PRRS的特征在 于嚴(yán)重且有時(shí)致命的呼吸道疾病和生殖障礙，但是也使受感染豬易感染細(xì)菌性病原體以及 其它病毒病原體（Benfield等1992)，并且是經(jīng)濟(jì)顯著的豬呼吸系統(tǒng)疾病綜合征（PRDC)的 主要組成部分。急性感染期間PRRSV引起的最一致的病理損傷是間質(zhì)性肺炎和輕度淋巴細(xì) 胞性腦炎（Plagemann1996)。在特征為病毒血癥和臨床疾病的PRRSV感染的急性期后，許 多豬完全恢復(fù)，然而在較長一段時(shí)間攜帶低水平病毒感染。這些"載體"豬受PRRSV持續(xù)感 染并且間歇或連續(xù)地傳播病毒，并且可能在直接或間接接觸后感染未實(shí)驗(yàn)的豬。在實(shí)驗(yàn)條 件下，受PRRSV持續(xù)感染也有良好的文檔記錄（Albina等1994 ;Allende等2000;Benfield 等 1998;Christopherhennings等 1995;Sur等 1996;Yoon等 1993)。最顯著的是，已經(jīng)在 感染157天后回收了傳染性病毒（Wills等1997)。雖然也已經(jīng)證實(shí)肺細(xì)胞和睪丸的上皮生 殖細(xì)胞受感染（Sur等1996 ;Sur等1997)，但是組織巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞是急性和持續(xù)感 染期間的主要靶細(xì)胞（Molitor等1997)。
[0009]PRRS的病原是為巢狀病毒母（orderNidovirales)動脈炎病毒科 (Arteriviridaefamily)成員的被膜的正鏈RNA病毒。動脈炎病毒科的其它成員包括小鼠 乳酸脫氫酶增高病毒（LDV)、馬動脈炎病毒（EAV)和猿出血熱病毒（SHFV)。對基因組序列 數(shù)據(jù)的分析顯示PRRSV菌株間的廣泛多樣性，但是也顯示出非常保守的結(jié)構(gòu)域（Andreyev 等1997;Meng2000 ;Meng等1995)。PRRSV的基因組構(gòu)成與其它動脈炎病毒的基因組構(gòu)成 類似，對于ORFla復(fù)制酶蛋白而言基因組RNA起信使RNA作用（Plagemann1996)。ORFla和lb包含約80%的病毒基因組并且編碼RNA依賴性RNA聚合酶以及加工成其它非結(jié)構(gòu)蛋 白的多蛋白（Snijder和Meulenberg1998)。使用雷皇斯塔德病毒，已經(jīng)確定0RF2-7編碼 病毒結(jié)構(gòu)蛋白。ORF5(GP5)和M編碼的蛋白（VanBreedam等2010b)在PRRSV誘導(dǎo)凋亡 中起作用（Suarez等1996 ;Sur等1997)并且被認(rèn)為是密切相關(guān)的乳酸脫氫酶增高病毒中 的病毒吸附蛋白。PRRSV的較小包膜糖蛋白GP2a和GP4與CD163相互作用（Das等2010)。 有數(shù)據(jù)表明，與SIGLECU唾液酸結(jié)合性Ig樣凝集素1)結(jié)合是進(jìn)入細(xì)胞所必需的，并且實(shí) 際上對于病毒感染而言似乎需要與SIGLEC1和⑶163雙重結(jié)合（VanGorp等2008)。
[0010] PRRSV致病原因（特別是在分子水平上）和動物流行病學(xué)的許多特征知之甚少，因 此使得控制工作很困難。為了獲得更好的理解，已經(jīng)研發(fā)了PRRSV的傳染性克?。∟ielsen 等2003)?，F(xiàn)今生產(chǎn)商常常用改良-活減毒菌株或滅活病毒疫苗為豬接種PRRSV疫苗。然 而，由于菌株變異和免疫系統(tǒng)的刺激不足，當(dāng)前的疫苗往往并未提供令人滿意的保護(hù)。因 為已經(jīng)證明，在用PRRSV的同源菌株激發(fā)豬時(shí)先前接觸可提供完全保護(hù)，所以保護(hù)性免疫 反應(yīng)是可能的（Lager等1999)。然而，從未對用異源菌株激發(fā)一致性證明保護(hù)性免疫。除 擔(dān)心可用PRRSV疫苗的功效外，有強(qiáng)有力的證據(jù)表明，如在實(shí)驗(yàn)感染豬后用毒性野外分離 株所證明的那樣（Rowland等1999)，目前使用的改良-活疫苗可繼續(xù)存在于個(gè)別豬和豬群 中并積累突變（Mengeling等1999)。此外，已經(jīng)證實(shí)疫苗病毒是在接種公豬的精液中傳播 (Christopherhennings等1997)。作為接種疫苗的替代方案，一些專家正提倡生殖群中的 "試驗(yàn)和去除"策略（Dee和Molitor1998)。這種策略的成功使用取決于去除受PRRSV急性 或持續(xù)感染的所有豬，接著嚴(yán)格控制以防再引入病毒。與這種策略相關(guān)的困難和大部分費(fèi) 用是，對持續(xù)性PRRSV感染的致病原因知之甚少，因此沒有可靠技術(shù)鑒定受持續(xù)感染的豬。
[0011] 已經(jīng)用單克隆抗體鑒定了PRRSV的假定細(xì)胞受體，純化并測序（Vanderheijden等 2003 ;Wissink等2003)并且命名為SIGLEC1。這種分子與唾液酸粘附素有相似性并且經(jīng) 證實(shí)介導(dǎo)PRRSV進(jìn)入非易感細(xì)胞，但是表達(dá)這種受體的重組細(xì)胞系不能支持PRRSV的生產(chǎn) 性復(fù)制（Vanderheijden等2003)。重要的是，已經(jīng)證實(shí)感染肺泡巨噬細(xì)胞需要PRRSV表面 存在的唾液酸分子。病毒與這種受體結(jié)合后，PRRSV的進(jìn)入通過受體介導(dǎo)的胞吞作用發(fā)生 (Nauwynck等1999)。通過實(shí)驗(yàn)確定唾液酸粘附素對PRRSV進(jìn)入的關(guān)鍵作用，其中證明在感 染克隆豬唾液酸粘附素的PK15細(xì)胞（不容許PRRSV復(fù)制的細(xì)胞系）中，而不是未感染的對 照PK15細(xì)胞中病毒吸收（Vanderheijden等2003)。這同一組的進(jìn)一步研究證明，PRRSV病 毒粒子表面的唾液酸與唾液酸粘附素分子的相互作用對于PRRSV感染肺泡巨噬細(xì)胞是必 需的（Delputte和Nauwynck2004)。相反的策略，即去除PRRSV表面的唾液酸或用唾液酸 特異性凝集素預(yù)培養(yǎng)也導(dǎo)致感染中斷（Delputte等2004 ;Delputte和Nauwynck2004;Van Breedam等2010b)。不依賴于對PRRSV進(jìn)入的具體研究，已經(jīng)使用定點(diǎn)誘變鑒定鼠唾液酸粘 附素結(jié)合唾液酸所需的六個(gè)關(guān)鍵氨基酸殘基（Vinson等1996)，其與豬唾液酸粘附素69% 相同。重要的是，鼠唾液酸粘附素中鑒定的6個(gè)氨基酸在豬分子中也全部保守。
[0012] SIGLEC1是唾液酸結(jié)合性免疫球蛋白樣凝集素家族的跨膜受體。最初將其描述為 小鼠巨噬細(xì)胞的綿羊紅細(xì)胞結(jié)合受體（Crocker和Gordon1986)。其在造血和淋巴組織中 的巨噬細(xì)胞上表達(dá)。SIGLEC由含有唾液酸結(jié)合位點(diǎn)的N端V-集結(jié)構(gòu)域組成，后面是數(shù)量可 變的C2-集結(jié)構(gòu)域，然后是跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)尾區(qū)。與SIGLEC相反，SIGLEC1在胞質(zhì)尾區(qū)內(nèi) 沒有基于酪氨酸的基序（Oetke等2006)。唾液酸結(jié)合位點(diǎn)映射到N端免疫球蛋白樣V-集 結(jié)構(gòu)域（Nath等1995)。R116殘基似乎是對于唾液酸結(jié)合而言重要氨基酸之一（Crocker 等1999 ;Delputte等2007)。因此，完整的N端結(jié)構(gòu)域?qū)τ赑RRSV與SIGLEC1結(jié)合充分必 要（VanBreedam等2010a)。報(bào)道了小鼠中SIGLEC1的敲除并且產(chǎn)生能活且能生殖，并且未 顯示出發(fā)育異常的小鼠（Oetke等2006)。然而，這些小鼠的B和T細(xì)胞群有微小變化并且 免疫球蛋白M水平降低。
[0013] PRRSV的感染過程從與肺泡巨噬細(xì)胞表面的硫酸乙酰肝素首次結(jié)合開始。然后與 唾液酸粘附素（SIGLEC1，也稱為⑶169或SN)發(fā)生穩(wěn)固結(jié)合。然后通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的胞 吞作用使病毒內(nèi)在化。然后另一分子，CD163,促進(jìn)核內(nèi)體中的病毒脫殼（VanBreedam等 2010a)。病毒基因組釋放并感染細(xì)胞。
[0014] ⑶163具有17個(gè)外顯子并且蛋白質(zhì)由具有9個(gè)清道夫受體富半胱氨酸（SRCR)結(jié) 構(gòu)域的胞外區(qū)、跨膜片段和短胞質(zhì)尾區(qū)構(gòu)成。由單個(gè)基因的不同剪接產(chǎn)生幾種不同的變異 體（Ritter等1999a;Ritter等1999b)。大部分這種變異被認(rèn)為是由胞質(zhì)尾區(qū)的長度引起 的。
[0015] ⑶163有許多重要功能，包括用作觸珠蛋白-血紅蛋白清道夫受體。因?yàn)檠t素 基可能極具毒性，所以清除血液中的游離血紅蛋白是⑶163的重要功能（Kristiansen等 2001)。CD163具有促進(jìn)胞吞作用胞質(zhì)尾區(qū)。這種尾區(qū)的突變導(dǎo)致觸珠蛋白-血紅蛋白復(fù)合 物吸收減少（Nielsen等2006)。C163的其它功能包括成紅細(xì)胞粘附（SRCR2)，為TWEAK受 體（SRCR1-4和6-9)、細(xì)菌受體（SRCR5)、非洲豬病毒受體（Sanchez-Torres等2003)和作 為免疫調(diào)節(jié)劑的潛在作用（在（VanGorp等2010a)中有討論）。
[0016] 發(fā)明概述
[0017] -方面，本發(fā)明是一種經(jīng)基因修飾的豬，其中SIGLEC1基因的至少一個(gè)等位基因 已經(jīng)失活和/或⑶163基因的至少一個(gè)等位基因已經(jīng)失活，其中⑶163等位基因的失活產(chǎn) 生不能結(jié)合和/或使豬生殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV)脫殼的CD163蛋白。
[0018] 本發(fā)明的另一方面是一種其中SIGLEC1基因的至少一個(gè)等位基因已經(jīng)失活的經(jīng) 基因修飾的豬，通過包括以下的方法產(chǎn)生：為豬卵母細(xì)胞去核；使所述卵母細(xì)胞與供體豬 成纖維細(xì)胞融合，所述成纖維細(xì)胞的基因組包含至少一個(gè)失活SIGLEC1等位基因；和激活 所述卵母細(xì)胞以產(chǎn)生胚胎。
[0019] 本發(fā)明還涉及一種其中⑶163基因的至少一個(gè)等位基因已經(jīng)失活的經(jīng)基因修飾 的豬，其中CD163等位基因的失活產(chǎn)生不能結(jié)合和/或使豬生殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV) 脫殼的CD163蛋白，所述經(jīng)基因修飾的豬通過包括以下的方法產(chǎn)生：為豬卵母細(xì)胞去核； 使所述卵母細(xì)胞與供體豬成纖維細(xì)胞融合，所述成纖維細(xì)胞的基因組包含至少一個(gè)失活 CD163等位基因；和激活所述卵母細(xì)胞以產(chǎn)生胚胎。
[0020] 另一方面，本發(fā)明是一種其中SIGLEC1基因的兩個(gè)等位基因已經(jīng)失活的經(jīng)基因修 飾的豬，通過包括以下的方法產(chǎn)生：使其中SIGLEC1基因的至少一個(gè)等位基因已經(jīng)失活的 經(jīng)基因修飾的公豬與其中SIGLEC1基因的至少一個(gè)等位基因已經(jīng)失活的經(jīng)基因修飾的母 豬交配以產(chǎn)生F1子代，并且篩選所述F1子代以鑒定其中SIGLEC1基因的兩個(gè)等位基因已 經(jīng)失活的經(jīng)基因修飾的豬。
[0021] 本發(fā)明的另一方面是提供一種其中⑶163基因的兩個(gè)等位基因已經(jīng)失活的經(jīng)基 因修飾的豬，通過包括以下的方法產(chǎn)生：使其中⑶163基因的至少一個(gè)等位基因已經(jīng)失活 的經(jīng)基因修飾的公豬與其中CD163基因的至少一個(gè)等位基因已經(jīng)失活的經(jīng)基因修飾的母 豬交配以產(chǎn)生F1子代，并且篩選所述F1子代以鑒定其中⑶163基因的兩個(gè)等位基因已經(jīng) 失活的經(jīng)基因修飾的豬。
[0022] 本發(fā)明還涉及其中SIGLEC1基因的兩個(gè)等位基因和⑶163基因的兩個(gè)等位基因已 經(jīng)失活的經(jīng)基因修飾的豬，其中⑶163等位基因的失活產(chǎn)生不能結(jié)合和/或使豬生殖與呼 吸綜合征病毒（PRRSV)脫殼的⑶163蛋白，所述經(jīng)基因修飾的豬通過三種方法的任一種產(chǎn) 生。第一種此類方法包括使具有至少一個(gè)失活SIGLEC1等位基因的經(jīng)基因修飾的豬與具有 至少一個(gè)失活⑶163等位基因的經(jīng)基因修飾的豬交配以產(chǎn)生F1子代，并且篩選所述F1子 代以鑒定其中SIGLEC1基因的至少一個(gè)等位基因已經(jīng)失活并且⑶163基因的至少一個(gè)等位 基因已經(jīng)失活的經(jīng)基因修飾的豬。這種方法進(jìn)一步包括使其中SIGLEC1基因的至少一個(gè)等 位基因已經(jīng)失活并且⑶163基因的至少一個(gè)等位基因已經(jīng)失活的經(jīng)基因修飾的豬相互交 配以產(chǎn)生F2子代并且篩選所述F2子代以鑒定其中SIGLEC1基因的兩個(gè)等位基因和⑶163 基因的兩個(gè)等位基因已經(jīng)失活的經(jīng)基因修飾的豬。
[0023] 第二種此類方法包括使其中SIGLEC1基因的兩個(gè)等位基因已經(jīng)失活的經(jīng)基因修 飾的豬與其中⑶163基因的兩個(gè)等位基因已經(jīng)失活的經(jīng)基因修飾的豬交配以產(chǎn)生F1子代， 使F1子代交配以產(chǎn)生F2子代，并且篩選F2子代以鑒定其中SIGLEC1基因的兩個(gè)等位基因 和⑶163基因的兩個(gè)等位基因已經(jīng)失活的經(jīng)基因修飾的豬。
[0024] 第三種此類方法包括使其中SIGLEC1基因的至少一個(gè)等位基因和⑶163基因的至 少一個(gè)等位基因已經(jīng)失活的經(jīng)基因修飾的豬與另一其中SIGLEC1基因的至少一個(gè)等位基 因和⑶163基因的至少一個(gè)等位基因已經(jīng)失活的經(jīng)基因修飾的豬交配以產(chǎn)生F1子代，并且 篩選F1子代以鑒定其中SIGLEC1基因的兩個(gè)等位基因和⑶163基因的兩個(gè)等位基因已經(jīng) 失活的經(jīng)基因修飾的豬。
[0025] 本發(fā)明還涉及上述任一經(jīng)基因修飾的豬的子代，其中：（l)SIGLECl基因的至少一 個(gè)等位基因已經(jīng)失活；（2)⑶163基因的至少一個(gè)等位基因已經(jīng)失活；（3)SIGLEC1基因的至 少一個(gè)等位基因和⑶163基因的至少一個(gè)等位基因已經(jīng)失活；或（4)SIGLEC1基因的兩個(gè)等 位基因和⑶163基因的兩個(gè)等位基因已經(jīng)失活。在其中⑶163基因的一個(gè)或兩個(gè)等位基因 已經(jīng)失活的此類子代中，失活產(chǎn)生不能結(jié)合和/或使豬生殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV)脫 殼的CD163蛋白。
[0026] 本發(fā)明還涉及一種產(chǎn)生其中SIGLEC1基因的至少一個(gè)等位基因已經(jīng)失活的經(jīng)基 因修飾的豬的方法。所述方法包括為豬卵母細(xì)胞去核；使所述卵母細(xì)胞與供體豬成纖維細(xì) 胞融合，所述成纖維細(xì)胞的基因組包含至少一個(gè)失活SIGLEC1等位基因；和激活所述卵母 細(xì)胞以產(chǎn)生胚胎。
[0027] 再一方面，本發(fā)明為一種產(chǎn)生其中⑶163基因的至少一個(gè)等位基因已經(jīng)失活的經(jīng) 基因修飾的豬的方法，其中CD163等位基因的失活產(chǎn)生不能結(jié)合和/或使豬生殖與呼吸綜 合征病毒（PRRSV)脫殼的CD163蛋白。這種方法包括為豬卵母細(xì)胞去核；使所述卵母細(xì)胞 與供體豬成纖維細(xì)胞融合，所述成纖維細(xì)胞的基因組包含至少一個(gè)失活CD163等位基因； 和激活所述卵母細(xì)胞以產(chǎn)生胚胎。
[0028] 本發(fā)明還涉及一種產(chǎn)生其中SIGLEC1基因的兩個(gè)等位基因已經(jīng)失活的經(jīng)基因修 飾的豬的方法。所述方法包括使具有至少一個(gè)失活SIGLEC1等位基因的經(jīng)基因修飾的母豬 與具有至少一個(gè)失活SIGLEC1等位基因的經(jīng)基因修飾的公豬交配以產(chǎn)生F1子代，并且篩選 所述F1子代以鑒定其中SIGLEC1基因的兩個(gè)等位基因已經(jīng)失活的經(jīng)基因修飾的豬。
[0029] 本發(fā)明還涉及一種產(chǎn)生其中⑶163基因的兩個(gè)等位基因已經(jīng)失活的經(jīng)基因修飾 的豬的方法，其中⑶163等位基因的失活產(chǎn)生不能結(jié)合和/或使PRRSV脫殼的⑶163蛋白。 這種方法包括使具有至少一個(gè)失活⑶163等位基因的經(jīng)基因修飾的母豬與具有至少一個(gè) 失活⑶163等位基因的經(jīng)基因修飾的公豬交配以產(chǎn)生F1子代，并且篩選所述F1子代以鑒 定其中⑶163基因的兩個(gè)等位基因已經(jīng)失活的經(jīng)基因修飾的豬。
[0030] 本發(fā)明的另一方面是一種產(chǎn)生其中SIGLEC1基因的兩個(gè)等位基因和⑶163基因的 兩個(gè)等位基因已經(jīng)失活的經(jīng)基因修飾的豬的方法，其中CD163等位基因的失活產(chǎn)生不能結(jié) 合和/或使豬生殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV)脫殼的CD163蛋白。所述方法包括使具有至 少一個(gè)失活SIGLEC1等位基因的經(jīng)基因修飾的豬與具有至少一個(gè)失活⑶163等位基因的經(jīng) 基因修飾的豬交配以產(chǎn)生F1子代，并且篩選所述F1子代以鑒定其中SIGLEC1基因的至少 一個(gè)等位基因已經(jīng)失活并且⑶163基因的至少一個(gè)等位基因