專利名稱：豬肺炎支原體間接elisa抗體檢測(cè)試劑盒及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動(dòng)物病毒學(xué)與動(dòng)物傳染病學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及一 種豬肺炎支原體間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒及其在豬群中豬肺炎支原體抗體檢測(cè)的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
豬支原體肺炎俗稱豬喘氣病或豬地方流行性肺炎，廣泛分布于世界各地，以慢性、 接觸性、高度傳染性、高發(fā)病率以及低死亡率等為特點(diǎn)，主要表現(xiàn)為咳嗽和呼吸困難，解剖 可見肺組織呈肉變或者大理石樣病變。
豬肺炎支原體是豬呼吸道疾病綜合征的重要病原之一，可繼發(fā)感染PRRSV、PCV2 等，從而導(dǎo)致了多種疫苗的接種失敗。豬肺炎支原體可經(jīng)空氣傳播，此外還易與其他細(xì)菌性 疾病如豬肺疫、傳染性胸膜肺炎等并發(fā)，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失，是當(dāng)前最常發(fā)生、最 廣流行、最難凈化的重要疫病之一。這主要是因?yàn)樨i肺炎支原體能夠穿透黏膜層與纖毛粘 在一起，破壞纖毛的完整性，并分泌一些有害因子，而改變纖毛的游走性，致使纖毛大量脫 落，這為其它細(xì)菌和病毒的入侵創(chuàng)造了條件，也就致使損失加劇。
豬肺炎支原體能在豬肺中長期滯留，治療效果不佳，雖然該病引起的死亡率不高， 但是流行的廣泛性所造成的經(jīng)濟(jì)損失仍然是巨大的。據(jù)報(bào)道，豬肺炎支原體表面具有纖毛 黏附因子，其感染豬的呼吸道后，能與黏膜上皮細(xì)胞纖維發(fā)生特異性結(jié)合，使豬肺炎支原體 能夠附殖并造成致病性。Raznis (1983)研究發(fā)現(xiàn)，豬肺炎支原體的致病力及免疫原性都與 其細(xì)胞膜上的膜蛋白有關(guān)，Gear S J等(1985)從豬肺炎支原體菌株VPPll的細(xì)胞膜中分 離得到了一種致病蛋白因子，發(fā)現(xiàn)其具有明顯的免疫原性，并證實(shí)細(xì)胞膜蛋白是導(dǎo)致豬患 豬支原體肺炎的主要因素。根據(jù)衣阿華大學(xué)的Ross研究發(fā)現(xiàn)，豬肺炎支原體感染后淋巴細(xì) 胞產(chǎn)生抗體的能力下降，細(xì)胞免疫力下降，肺泡巨噬細(xì)胞對(duì)病原的吞噬和清除能力亦下降， 抑制性T細(xì)胞的活動(dòng)增強(qiáng)，導(dǎo)致呼吸道免疫力減弱，抗病力下降，從而使其它病原體更容易 侵入。
對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株和野外分離菌株的抗原分析表明，支原體肺炎含有幾種主要免疫原， 即胞內(nèi)具 LDH 活性的蛋白(P36) (Haldimann A,et al. 1993 ；Stipkovits L, et al. 1991),3 種膜蛋白(P46、P65 和 P70) (Kim M F，et al. 1990 ；Mori Y T，et al. 1988)和粘附素(P97) (Zhang Q T，et al. 1995)。這些蛋白在急性或初次感染肺炎支原體后，可刺激產(chǎn)生早期和 特異抗體。
目前關(guān)于豬支原體肺炎的診斷方法，國外研究較多，而國內(nèi)研究較少，而且主要是 間接血凝實(shí)驗(yàn)(IHA)和單抗原包被的ELISA方法。但是，IHA的檢測(cè)中存在著檢測(cè)滴度低、 結(jié)果和感染的相關(guān)性低、凝集終點(diǎn)判定的主觀性較強(qiáng)以及本身固有的技術(shù)缺陷等問題，因 此IHA在商品豬群的Mhp檢測(cè)中實(shí)際應(yīng)用前景有限。ELISA是目前應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)技術(shù)， 它具有敏感度高、特異性強(qiáng)和操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)。通過研究其特異性蛋白而建立的診斷方法 是目前研究的熱點(diǎn)。但是只選用一種蛋白作為唯一的包被蛋白，對(duì)于Mhp感染初期的豬很 可能存在假陰性，若將Mhp的功能蛋白組合后再檢測(cè)該病，可能檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠，易于大規(guī)模推廣應(yīng)用，具有更加廣闊的應(yīng)用前景。
研究發(fā)現(xiàn)，p46蛋白是豬肺炎支原體的一種種屬特異的膜抗原，高度保守，可以誘 導(dǎo)早期免疫應(yīng)答，并且引起的抗體反應(yīng)的持續(xù)時(shí)間最長。其序列中3個(gè)TGA密碼子編碼Trp， 而TGA在通用密碼子中為終止密碼子，需要將TGA突變?yōu)門GG才能獲得其原核表達(dá)的蛋白。 S Futo等將P46基因克隆到載體，然后轉(zhuǎn)入大腸桿菌中進(jìn)行原核表達(dá)，收獲并純化該重組 蛋白，并且將其成功地應(yīng)用于檢測(cè)豬肺炎支原體抗體的ELISA實(shí)驗(yàn)，在該實(shí)驗(yàn)中可以避免 與絮狀支原體、豬鼻支原體，豬滑液支原體的交叉反應(yīng)(Futo S，et al. 1995)。M F Kim等 研究發(fā)現(xiàn)，P65蛋白是豬肺炎支原體的一個(gè)重要的免疫原，它的碳端是其主要的抗原區(qū)(Kim M F,et al. 1990)。P65蛋白是一種解脂酶(lipolytic enzyme),是豬肺炎支原體主要的具 免疫原性的表面蛋白即膜蛋白之一(Jono A，et al. 2004)，其功能可能是損害肺組織中表 面活性劑，即一種由脂蛋白組成的物質(zhì)，是由肺部的肺泡細(xì)胞分泌的，可以通過減小肺部表 面的液體表面張力來維持肺組織的穩(wěn)定性(Wise K. S. et al. 1987)，還可以觸發(fā)急性或首 次感染豬肺炎支原體的斷奶仔豬及生長豬的早期免疫應(yīng)答。P65蛋白序列中也有I個(gè)TGA 密碼子需要進(jìn)行定點(diǎn)突變才能在大腸桿菌中表達(dá)。K. Cheikh Saad Bouh等將P46基因和 P65基因克隆到載體上，在大腸桿菌中對(duì)其進(jìn)行原核表達(dá)，收獲表達(dá)產(chǎn)物并對(duì)其進(jìn)行復(fù)性 后免疫BALB/c小鼠，從而獲得相應(yīng)的單克隆抗體，并對(duì)該單克隆抗體進(jìn)行了交叉反應(yīng)的研 究，結(jié)果顯示該蛋白具有很高的種間保守性和特異性(Cheikh Saad Bouh K, et al. 2003)。 因此，P46蛋白和P65蛋白均可以作為建立Mhp診斷方法的優(yōu)選抗原。在血清學(xué)檢測(cè)方法 中，ELISA方法具有方便、快速、敏感性和特異性高等特點(diǎn)，在動(dòng)物疾病的檢測(cè)中得到了廣泛 的應(yīng)用。本研究克隆了 Mhp P46和P65基因，并以其表達(dá)的蛋白共同作為抗原建立了檢測(cè) Mhp的間接ELISA方法，為臨床檢測(cè)豬肺炎支原體感染和流行病學(xué)調(diào)查奠定了初步基礎(chǔ)。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)的的主要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)上存在的缺陷，提供一種豬肺炎支原體間接 ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，以解決豬群中豬肺炎支原體抗體的檢測(cè)。
本發(fā)明的第一個(gè)目的是獲得分別表達(dá)豬支原體肺炎主要免疫原性膜蛋白p46蛋 白和p65蛋白的重組大腸桿菌菌株，重組菌株pGEX-KG-46中的p46蛋白基因中三個(gè)編碼色 氨酸的TGA密碼子均已經(jīng)定點(diǎn)突變?yōu)門GG，重組菌株pGEX-KG-65中的p65蛋白基因中一個(gè) 編碼色氨酸的TGA密碼子已經(jīng)定點(diǎn)突變?yōu)門GG，以便于這兩種蛋白的原核表達(dá)；
本發(fā)明的第二個(gè)目的是利用上述重組菌株建立一種豬肺炎支原體間接ELISA抗 體檢測(cè)方法。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是組裝一種豬肺炎支原體間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒。
本發(fā)明的第四個(gè)目的是利用該試劑盒在豬群中豬肺炎支原體抗體檢測(cè)中的應(yīng)用。
本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)
申請(qǐng)人通過基因工程的方法，獲得兩株分別表達(dá)豬支原體肺炎主要免疫原性膜蛋 白p46蛋白和p65蛋白的重組的大腸桿菌(Escherichia coli)pGEX_KG_46和pGEX_KG_65, 將這兩株菌株于2011年08月22日送交湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏 中心(CCTCC)保藏，其保藏編號(hào)分別為 CCTCC NO M2011294 ；CCTCC NO :M2011295。
申請(qǐng)人提供了一種重組的大腸桿菌pGEX-KG-46和pGEX_KG_65的制備方法，它包括下列步驟
I)構(gòu)建重組質(zhì)粒 pGEX-46 和 pGEX-65
分別擴(kuò)增豬肺炎支原體膜蛋白p46和p65的基因片斷，并將其亞克隆至原核表達(dá) 載體pGEX-KG上，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pGEX-46和pGEX_65。
所用引物對(duì)的DNA序列如下所示(引物的下劃線部分為酶切位點(diǎn)):
p46 正向引物CCCGGATCCATGAAAAAAATGCTTA (5' — 3')，
p46 反向引物CCCAAGCTTTTAGGCATCAGGATTA (5' — 3')；
p65 正向引物AAAGGATCCATGGCAAAAGAA (5' — 3')，
d65 反向引物=CCCAAGCTTAATCCTGCTTGAh' —3')；
2)利用三個(gè)引物對(duì)將豬肺炎支原體的p46蛋白基因片斷中210bp、303bp和662bp 處的堿基A人工定點(diǎn)突變?yōu)閴A基G，所用引物對(duì)的DNA序列如下所示
正向引物AATCCTCGATGGATTAGTGCCC—3')，
反向引物CCATCGAGGATTATCCGGAT(5' — 3')；
正向引物CAAAATAACTGGCTCACTCAG(5' — 3')，
反向引物CCAGTTATTTTGTGCATCCTG(5' — 3')；
正向引物TCCCAGGATGGAATTATGGAA(5' — 3')，
反向引物CCATCCTGGGACATAAACAGC(5' — 3')；
利用一個(gè)引物對(duì)將豬肺炎支原體的p65蛋白基因片斷633bp處的堿基A人工定點(diǎn) 突變?yōu)閴A基G，所用引物對(duì)的DNA序列如下所示
正向引物CCCTTGTAAATTGGCTTGTTAAA(5' — 3')，
反向引物CCCCCAATTTACAATTTCATTAT(5' — 3')；
3)用上述突變之后的重組質(zhì)粒pGEX-46和pGEX_65轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM105，進(jìn)行PCR 和酶切鑒定并測(cè)序。將突變正確的菌株命名為大腸桿菌(Escherichia coli)pGEX-KG-46 和pGEX-KG-65，于2011年08月22日送交湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏 中心(CCTCC)保藏，其保藏編號(hào)分別為CCTCC NO M2011294 ；CCTCC NO :M2011295 (其詳細(xì) 構(gòu)建過程參見圖2)。
將上述重組的大腸桿菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后收集菌體進(jìn)行超聲波破碎提取豬肺炎支原 體p46蛋白和p65蛋白，所提取的p46蛋白和p65蛋白經(jīng)過親和層析純化后可用于制備檢 測(cè)豬肺炎支原體間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒。
申請(qǐng)人獲得兩種能分別原核表達(dá)豬肺炎支原體主要免疫原性膜蛋白p46和p65的 基因片段，將編碼色氨酸的密碼子TGA定點(diǎn)突變?yōu)門GG，p46蛋白和p65蛋白的基因片段的 核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :1，表SEQ ID N0:3所示。
申請(qǐng)人利用所述的兩株重組菌株pGEX-KG-46和pGEX_KG_65所表達(dá)純化的p46蛋 白和P65蛋白為包被抗原制備成間接ELISA核心試劑，組裝了一種用于快速檢測(cè)適用于豬 群的豬肺炎支原體間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明的試劑盒是由包被板、樣品稀釋液、 陽性對(duì)照血清、陰性對(duì)照血清、洗滌液、羊抗豬酶標(biāo)二抗、底物顯色液A、底物顯色液B、終止 液，其中所述的包被板包被有由保藏號(hào)為CCTCC NO :M2011294和CCTCC NO M2011295的重 組的大腸桿菌pGEX-KG-46和pGEX-KG-65表達(dá)的p46和p65蛋白共同包被的抗原，所述的 樣品稀釋液、洗滌液、羊抗豬酶標(biāo)二抗、底物顯色液A、底物顯色液B、終止液、陽性對(duì)照血清和陰性對(duì)照血清的成分和制備步驟如下所示
樣品稀釋液牛血清白蛋白5g、Tween-20 O. 5ml、氯化鈉8. Og,磷酸二氫鉀O. 2g, 十二水磷酸氫二鈉2. 9g,氯化鉀O. 2g和硫柳汞鈉O. 2g ;先用注射用水溶解并定容至 1000ml，再用O. 22 μ m濾膜過濾除菌，無菌分裝后置2 8°C保存?zhèn)溆茫?br> 濃縮洗滌液NaCl 170g, Tween-20 IOml ;加注射用水溶解并定容至1000ml，用 O. 22 μ m濾膜過濾除菌，得到20倍濃縮洗滌液，無菌分裝后置2 8°C保存?zhèn)溆茫?br> 羊抗豬酶標(biāo)二抗將羊抗豬IgG-HRP酶標(biāo)抗體，用保護(hù)劑按體積比1: 15000稀釋成工作濃度，再用O. 22 μ m濾膜過濾除菌，無菌分裝后置2 8°C保存?zhèn)溆茫?br> 底物顯色液A Na2HP04. 12H20 14. 6g、檸檬酸9. 33g、過氧化氫脲O. 52g，加注射用水溶解并定容至1000ml，調(diào)pH值至5. O 5. 4，用O. 22 μ m濾膜過濾除菌，無菌分裝后置 2 8°C保存?zhèn)溆茫?br> 底物顯色液B :四甲基聯(lián)苯胺20mg,加入無水乙醇IOml溶解,再用注射用水定容至 IOOOmL, O. 22 um濾膜過濾除菌，無菌分裝后置2 8°C保存?zhèn)溆茫?br> 終止液將2. 5ml氫氟酸加到900ml注射用水中，定容至IOOOmL,用O. 22 μ m濾膜過濾除菌，無菌分裝后置2 8°C保存?zhèn)溆茫?br> 保護(hù)劑BSA0. 5g、蔗糖2g，加注射用水溶解并定容至100ml，置2 8°C保存?zhèn)溆谩?br> 所述的陽性對(duì)照血清是感染豬支原體肺炎的豬血清；
所述的陰性對(duì)照血清是未感染豬支原體肺炎的豬血清。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)是
1、本發(fā)明的試劑盒能直接對(duì)豬肺炎支原體進(jìn)行檢測(cè)，具有特異性強(qiáng)，靈敏度高，檢測(cè)時(shí)間短的特點(diǎn)，可用于豬肺炎支原體抗體的臨床大規(guī)模檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查，具有廣闊的市場(chǎng)前景。
2、本發(fā)明將所需的各種試劑組裝成試劑盒，操作簡(jiǎn)單易行，不需由專業(yè)人員操作。 本發(fā)明的試劑盒穩(wěn)定性好、保存期長，在2 8°C條件下放置半年不會(huì)影響其敏感性。
3、目前國內(nèi)市場(chǎng)上還沒有同時(shí)應(yīng)用Mhp的兩種功能蛋白作為包被抗原檢測(cè)豬肺炎支原體抗體的間接ELISA試劑盒。
更詳細(xì)的技術(shù)方案見實(shí)施例所述。


序列表SEQ ID NO :1是本發(fā)明克隆的豬肺炎支原體免疫原性膜蛋白p46的基因片段，序列全長為1260bp，在210bp、303bp和662bp處存在堿基的人工定點(diǎn)突變。
序列表SEQ ID NO :2是克隆的豬肺炎支原體免疫原性膜蛋白p46的基因片段編碼的蛋白質(zhì)的序列，它編碼419個(gè)氨基酸。
序列表SEQ ID NO :3是本發(fā)明克隆的豬肺炎支原體免疫原性膜蛋白p65的基因片段，序列全長為1803bp，存在一個(gè)A633-G633的人工定點(diǎn)突變。
序列表SEQ ID NO :4是克隆的豬肺 炎支原體免疫原性膜蛋白p65的基因片段編碼的蛋白質(zhì)的序列，它編碼600個(gè)氨基酸。
圖1 :本發(fā)明總體技術(shù)路線圖。
圖2 :本發(fā)明制備的能夠原核表達(dá)的p46和p65基因片段的流程圖。
圖3 :本發(fā)明擴(kuò)增的p46和p65基因片段的PCR鑒定圖其中，圖3A p46片段的 PCR擴(kuò)增的膠圖3B p65片段的PCR擴(kuò)增的膠圖。
圖4 :本發(fā)明制備的p46基因210bp、303bp和662bp處A-G突變后的PCR鑒定圖和p65基因A633突變?yōu)镚633的PCR鑒定圖。其中，圖4A :突變后p46片段的PCR擴(kuò)增的膠圖；圖4B :突變后p65片段的PCR擴(kuò)增的膠圖。
圖5 :本發(fā)明制備的p46基因210bp、303bp和662bp處A-G突變后的重組質(zhì)粒的酶切鑒定圖和P65基因A633突變?yōu)镚633的重組質(zhì)粒的酶切鑒定圖。其中，圖5A p46經(jīng)定點(diǎn)突變后的酶切鑒定的膠圖；圖5B p65經(jīng)定點(diǎn)突變后的酶切鑒定的膠圖。
圖6 :本發(fā)明制備豬肺炎支原體p46基因和p65基因突變前后的BLAST圖。其中， 圖6A p46經(jīng)定點(diǎn)突變后的測(cè)序結(jié)果；圖6B p65經(jīng)定點(diǎn)突變后的測(cè)序結(jié)果。
圖7 :本發(fā)明制備的p46和p65重組蛋白的表達(dá)。其中，圖7A :p46蛋白表達(dá)的 SDS-PAGE分析；圖7B p65蛋白表達(dá)的SDS-PAGE分析。
圖8 :本發(fā)明制備的p46和p65重組蛋白的親和層析純化。其中，圖8A:重組p46 蛋白的SDS-PAGE分析；圖8B :重組p65蛋白的SDS-PAGE分析。
圖9 :本發(fā)明制備的p46和p65重組蛋白的Western-blot分析。其中，圖9A: ffestern-blot鑒定p46蛋白的表達(dá)；圖9B ffestern-blot鑒定p65蛋白的表達(dá)。
圖10 :本發(fā)明克隆的豬肺炎支原體免疫原膜蛋白p46和p65基因片段。括號(hào)內(nèi)顯示的是突變的堿基的位置。其中，圖1OA :p46基因片段；圖10B:p65基因片段。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合說明書附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，本發(fā)明的技術(shù)流程如圖1所示
實(shí)施例1豬肺炎支原體p46蛋白和p65蛋白的基因片段的克隆
1、豬肺炎支原體p46和p65蛋白基因片段的克隆方法見圖2所示。
制備能夠原核表達(dá)的p46基因片段所需的引物如表I所述。
表I制備能夠原核表達(dá)的p46基因片段所需的引物
權(quán)利要求
1.一種重組的大腸桿菌pGEX-KG-46和pGEX_KG_65，其特征在于，所述的大腸桿菌pGEX-KG-46和pGEX-KG-65保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號(hào)分別為CCTCC NO M2011294和CCTCC NO :M2011295，所述的大腸桿菌分別表達(dá)豬肺炎支原體主要免疫原性膜蛋白p46和p65，其編碼的蛋白質(zhì)的序列分別如序列表SEQ ID NO :2和SEQ ID N0:4所示。
2.—種重組的大腸桿菌pGEX-KG-46和pGEX_KG_65的制備方法，它包括下列步驟1)分別構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-46和pGEX-65，用如下所示的兩個(gè)引物對(duì)分別擴(kuò)增豬肺炎支原體膜蛋白P46和p65的基因片斷，所述的p46和p65的基因片斷的核苷酸序列如SEQID NO 1 和 SEQ ID NO 3 所示；所用引物對(duì)的DNA序列分別如下所示p46 正向引物CCCGGATCCATGAAAAAAATGCTTA (5' — 3')，p46 反向引物CCCAAGCTITTAGGCATCAGGATTA (5' — 3')；p65 正向引物AAAGGATCCATGGCAAAAGAA (5' — 3')，p65 反向引物CCCAAGCTTAATCCTGCTTGAC —3');分別將其亞克隆至原核表達(dá)載體pGEX-KG上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-46和pGEX_65，其中重組質(zhì)粒pGEX-46包含如序列表SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列；重組質(zhì)粒pGEX_65包含如序列表SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列；2)利用三個(gè)弓I物對(duì)將豬肺炎支原體的P46蛋白基因片斷中2IObp、303bp和662bp處的堿基A人工定點(diǎn)突變?yōu)閴A基G，所用引物對(duì)的DNA序列如下所示其中擴(kuò)增SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的210bp處堿基突變的引物對(duì)的DNA序列如下所示正向引物AATCCTCGATGGATTAGTGCC (5' — 3')，反向引物CCATCGAGGATTATCCGGAT(5' —3');擴(kuò)增SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的303bp處堿基突變的引物對(duì)的DNA序列如下所示正向引物CAAAATAACTGGCTCACTCAG (5' — 3')，反向引物CCAGTTATTTTGTGCATCCTG (5; — 3')；擴(kuò)增SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的662bp處堿基突變的引物對(duì)的DNA序列如下所示正向引物TCCCAGGATGGAATTATGGAA (5' — 3')，反向引物CCATCCTGGGACATAAACAGC (5' — 3')；利用一個(gè)引物對(duì)將豬肺炎支原體的P65蛋白基因片斷中633bp處的堿基A人工定點(diǎn)突變?yōu)閴A基G，所用引物對(duì)的DNA序列如下所示正向引物CCCTTGTAAATTGGCTTGTTAAA (5' — 3')，反向引物CCCCCAATTTACAATTTCATTAT (5' — 3')。
3.P46蛋白和p65蛋白的基因片段在表達(dá)豬肺炎支原體主要免疫原性膜蛋白中的應(yīng)用，其特征在于，所述的P46蛋白的基因片段的核苷酸序列如下所示ATGAAAAAAA TGCTTAGAAA AAAATTCTTG TATTCATCAG CTATTTATGC AACTTCGCTT
4.一種適用于豬肺炎支原體抗體檢測(cè)的間接ELISA試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括包被板、樣品稀釋液、陽性對(duì)照血清、陰性對(duì)照血清、洗滌液、羊抗豬酶標(biāo)二抗、底物顯色液A、底物顯色液B、終止液，其中所述的包被板包被有由保藏號(hào)為CCTCC NO :M2011294和CCTCC NO M2011295的重組的大腸桿菌pGEX-KG-46和pGEX_KG_65表達(dá)的p46和p65蛋白共同包被的抗原，所述的樣品稀釋液、洗滌液、羊抗豬酶標(biāo)二抗、底物顯色液A、底物顯色液B、終止液、陽性對(duì)照血清和陰性對(duì)照血清的成分和制備步驟如下所示樣品稀釋液牛血清白蛋白5g、Tween-20 O. 5ml、氯化鈉8. Og,磷酸二氫鉀O. 2g,十二水磷酸氫二鈉2. 9g，氯化鉀O. 2g和硫柳汞鈉O. 2g ;先用注射用水溶解并定容至1000ml，再用O. 22 μ m濾膜過濾除菌，無菌分裝后置2 8°C保存?zhèn)溆茫粷饪s洗滌液NaCl 170g, Tween-20 IOml ;加注射用水溶解并定容至1000ml，用O.22 μ m濾膜過濾除菌，得到20倍濃縮洗滌液，無菌分裝后置2 8°C保存?zhèn)溆?；羊抗豬酶標(biāo)二抗將羊抗豬IgG-HRP酶標(biāo)抗體，用保護(hù)劑按體積比1: 15000稀釋成工作濃度，再用O. 22 μ m濾膜過濾除菌，無菌分裝后置2 8°C保存?zhèn)溆?；底物顯色液A =Na2HPO4. 12H20 14. 6g、檸檬酸9. 33g、過氧化氫脲O. 52g，加注射用水溶解并定容至1000ml,調(diào)pH值至5. O 5. 4,用O. 22 μ m濾膜過濾除菌,無菌分裝后置2 8°C保存?zhèn)溆?；底物顯色液B:四甲基聯(lián)苯胺20mg，加入無水乙醇IOml溶解，再用注射用水定容至IOOOmL, O. 22 μ m濾膜過濾除菌，無菌分裝后置2 8°C保存?zhèn)溆?；終止液將2. 5ml氫氟酸加到900ml注射用水中，定容至IOOOmL,用O. 22 μ m濾膜過濾除菌，無菌分裝后置2 8°C保存?zhèn)溆?；保護(hù)劑BSA0. 5g、蔗糖2g，加注射用水溶解并定容至100ml，置2 8°C保存?zhèn)溆?。所述的陽性?duì)照血清是感染豬支原體肺炎的豬血清；所述的陰性對(duì)照血清是未感染豬支原體肺炎的豬血清。
5.權(quán)利要求1所述的大腸桿菌pGEX-KG-46和pGEX-KG-65表達(dá)的抗原蛋白在制備豬肺炎支原體間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于動(dòng)物病毒學(xué)與動(dòng)物傳染病學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種豬肺炎支原體間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒及應(yīng)用。本發(fā)明通過基因工程重組技術(shù)得到兩株表達(dá)豬肺炎支原體p46蛋白和p65蛋白的重組的大腸桿菌pGEX-KG-46和pGEX-KG-65。本發(fā)明的試劑盒包括以突變后豬肺炎支原體膜蛋白P46和P65基因表達(dá)蛋白共同作為抗原包被的酶標(biāo)板和其他核心試劑。本發(fā)明公開了豬肺炎支原體膜蛋白P46和P65基因的克隆，定點(diǎn)突變以及P46和P65蛋白的表達(dá)及純化方法。還公開了豬肺炎支原體間接ELISA抗體檢測(cè)方法。本發(fā)明制備的間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒可用于豬肺炎支原體抗體的臨床大規(guī)模檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查，具有廣闊的市場(chǎng)前景。
文檔編號(hào)G01N33/531GK103018442SQ20111028691
公開日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2011年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月23日
發(fā)明者何啟蓋, 馬豐英, 李燕, 庫旭鋼, 鄒浩勇, 陳煥春, 郭愛珍, 徐高原 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 武漢科前動(dòng)物生物制品有限責(zé)任公司