專利名稱：豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因工程標(biāo)記弱毒疫苗株及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因工程標(biāo)記弱毒疫苗株及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是目前嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的傳染病之一，該病是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome Virus,PRRSV)白勺，臨懷孕母豬發(fā)生流產(chǎn)、早產(chǎn)和死胎等嚴(yán)重的繁殖障礙以及仔豬和育肥豬表現(xiàn)明顯的呼吸障礙等癥狀。至今為止，PRRS仍在全球大部分地區(qū)流行，是豬主要的傳染病之一。2006年5月以來，我國暴發(fā)了由美洲型變異株引起的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征，給我國的養(yǎng)豬業(yè)造成很大經(jīng)濟損失。同以前流行的毒株相比較，這次流行的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的致病力明顯增強，在其非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp2中的482位和534 562 位分別存在一個特征性1+ 個氨基酸缺失。PRRSV的Nsp2蛋白是一種特殊的非結(jié)構(gòu)蛋白， 具有半胱氨酸蛋白酶活性，眾多研究證明Nsp2蛋白中間區(qū)及PL2區(qū)附近在各毒株之間存在明顯的突變、插入或者刪除現(xiàn)象。通過反向遺傳操作發(fā)現(xiàn)Nsp2在病毒的復(fù)制過程中起到重要作用。雖然有研究證實其毒力增強與該毒株的Nsp2特征性缺失30個氨基酸無關(guān)，但是目前對該病毒毒力增強的原因仍然尚不清楚。疫苗免疫仍然是預(yù)防和控制該病的重要手段，目前在市場上商品化的滅活疫苗與弱毒疫苗均有使用，相比較而言，針對高致病性豬繁殖與呼吸綜合征的預(yù)防和控制來說弱毒活疫苗的效果更為明顯，我國現(xiàn)有的幾個針對高致病性豬繁殖與呼吸綜合征的弱毒疫苗，都是將強毒株在細(xì)胞上經(jīng)過體外連續(xù)傳代至弱獲得的，如高致病性豬繁殖與呼吸綜合征HuN4-F112弱毒疫苗，目前這些疫苗已經(jīng)在高致病性PRRSV的防控中發(fā)揮了重要作用。盡管如此，現(xiàn)有弱毒疫苗在使用過程中仍存在不能有效區(qū)分自然感染和疫苗免疫動物這一重要問題，這對于將來更加有效控制和凈化高致病PRRSV帶來嚴(yán)重阻礙，因此有必要研制能夠達(dá)到鑒別診斷目的的新型基因工程標(biāo)記弱毒疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因工程標(biāo)記弱毒疫苗株，該疫苗株能有效區(qū)分自然感染野毒株與疫苗免疫毒株的動物。此外，還需要提供一種上述基因工程標(biāo)記弱毒疫苗株的應(yīng)用。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)在本發(fā)明的一個方面，提供了一種重組豬繁殖與呼吸綜合征病毒，包含豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒疫苗株HuM-Fl 12的基因組核酸，所述HuM-Fl 12基因組在編碼豬繁殖與呼吸綜合征病毒Nsp2蛋白的基因區(qū)域內(nèi)包含一個缺失或突變，所述缺失選自
(1)編碼Nsp2蛋白第480-532位氨基酸的核苷酸序列的缺失；(2)編碼Nsp2蛋白第508-532位氨基酸的核苷酸序列的缺失；所述突變選自(a)在(1)所述的缺失區(qū)域插入編碼新城疫病毒NP蛋白的核苷酸序列；(b)在( 所述的缺失區(qū)域插入編碼新城疫病毒NP蛋白的核苷酸序列。優(yōu)選的，所述缺失區(qū)域插入的核苷酸序列是編碼新城疫病毒NP蛋白C末端49個氨基酸的核苷酸序列(SEQ ID NO. 19)。優(yōu)選的，所述HUN4-F112基因組還包含標(biāo)記性的MluI限制性內(nèi)切酶位點。更優(yōu)選的，Nsp2基因在缺失編碼第480-532位氨基酸(Δ 52氨基酸)的核苷酸序列之后，其基因序列如SEQ ID NO. 1所示；Nsp2基因在缺失編碼第508-532位氨基酸(Δ 25 氨基酸)的核苷酸序列之后，其基因序列如SEQ ID NO. 2所示。更優(yōu)選的，Nsp2基因在其Δ 52氨基酸缺失區(qū)域插入編碼新城疫病毒NP蛋白C末端49個氨基酸的核苷酸序列之后，其基因序列如SEQ ID NO. 3所示；Nsp2基因在其Δ 25氨基酸缺失區(qū)域插入編碼新城疫病毒NP蛋白C末端49個氨基酸的核苷酸序列之后，其基因序列如SEQ ID NO. 4所示。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種核酸分子，包含豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒疫苗株HUN4-F112的基因組多核苷酸序列，該多核苷酸序列在編碼豬繁殖與呼吸綜合征病毒Nsp2蛋白的基因區(qū)域內(nèi)包含一個缺失或突變，所述缺失選自(1)編碼Nsp2蛋白第480-532位氨基酸的核苷酸序列的缺失；(2)編碼Nsp2蛋白第508-532位氨基酸的核苷酸序列的缺失；所述突變選自
(a)在(1)所述的缺失區(qū)域插入編碼新城疫病毒NP蛋白的核苷酸序列；(b)在( 所述的缺失區(qū)域插入編碼新城疫病毒NP蛋白的核苷酸序列。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種包含上述核酸分子的重組載體。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒疫苗株，包含豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒疫苗株HuM-Fl 12的基因組核酸，所述HuM-Fl 12基因組在編碼豬繁殖與呼吸綜合征病毒Nsp2蛋白的基因區(qū)域內(nèi)包含一個突變，該突變是在編碼 Nsp2蛋白第480-532位氨基酸的核苷酸序列的缺失區(qū)域，插入編碼新城疫病毒NP蛋白的核苷酸序列；或在編碼Nsp2蛋白第508-532位氨基酸的核苷酸序列的缺失區(qū)域，插入編碼新城疫病毒NP蛋白的核苷酸序列。優(yōu)選的，所述缺失區(qū)域插入的核苷酸序列是編碼新城疫病毒NP蛋白C末端49個氨基酸的核苷酸序列(SEQ ID N0. 19)。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種上述重組豬繁殖與呼吸綜合征病毒在制備預(yù)防或治療高致病性豬繁殖與呼吸綜合征的疫苗中的應(yīng)用。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種上述豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒疫苗株在制備預(yù)防或治療高致病性豬繁殖與呼吸綜合征的疫苗中的應(yīng)用。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種區(qū)分上述豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒疫苗株與自然感染毒株的檢測方法，包括以下步驟
5
利用表達(dá)的新城疫病毒NP蛋白作為檢測抗原，建立ELISA抗體檢測方法，用該方法檢測免疫動物針對NP49蛋白產(chǎn)生的抗體，以區(qū)分出具有基因工程標(biāo)記的弱毒疫苗株與自然感染毒株。本發(fā)明豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因工程標(biāo)記弱毒疫苗株，在免疫豬體后可有效誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，對免疫豬抵抗高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的致死性攻擊提供100%的免疫保護率，安全可靠，而且本發(fā)明的基因工程標(biāo)記弱毒疫苗株，能有效區(qū)分豬繁殖與呼吸綜合征自然感染豬和豬繁殖與呼吸綜合征疫苗免疫豬，滿足臨床上對高致病性 PRRSV疫苗免疫毒株與自然感染毒株的鑒別診斷，非常有利于高致病性PRRSV的預(yù)防和控制。


下面結(jié)合附圖和具體實施方式
對本發(fā)明作進一步詳細(xì)的說明。圖1是本發(fā)明拯救不同基因缺失和插入標(biāo)記的感染性克隆毒株的RT-PCR檢測結(jié)果圖；圖2是本發(fā)明基因缺失與基因標(biāo)記感染性克隆毒感染Macr-145細(xì)胞后的細(xì)胞病變圖；圖3是本發(fā)明救獲的不同基因缺失和插入標(biāo)記的感染性克隆毒株遺傳穩(wěn)定性序列分析圖；圖4是本發(fā)明利用抗PRRSV N蛋白單抗對基因缺失與插入標(biāo)記的感染性克隆毒株進行間接免疫熒光鑒定結(jié)果圖；圖5是本發(fā)明不同感染性克隆毒株與親本毒HUN4-F112株生長曲線比較圖；圖6是本發(fā)明實施例3基因工程標(biāo)記弱毒疫苗株免疫豬ELISA檢測PRRSV抗體水平變化圖；圖7是本發(fā)明實施例3利用間接ELISA方法檢測免疫豬抗NP49蛋白抗體鑒別免疫豬與自然強毒感染豬的柱狀圖；圖8是本發(fā)明實施例3利用RT-PCR結(jié)合MluI酶切鑒別免疫豬與自然強毒感染豬的電泳圖；圖9是本發(fā)明實施例3基因工程標(biāo)記弱毒疫苗株攻毒后死亡保護率統(tǒng)計結(jié)果圖。
具體實施例方式下列實施例中，未注明具體條件的實驗方法，通常按常規(guī)條件，如《精編分子生物學(xué)實驗指南》(F.M.奧斯伯，R.E.金斯頓，J.G.塞德曼等主編，馬學(xué)軍，舒躍龍的譯.北京 科學(xué)出版社，2004)中所述的方法進行。由于目前的豬繁殖與呼吸綜合征病毒的弱毒疫苗存在不能有效區(qū)分自然感染和疫苗免疫動物的問題，有必要利用新的技術(shù)研制PRRS新型疫苗。本實驗室?guī)啄昵胺蛛x到一株高致病性PRRSV毒株HuN4，與經(jīng)典的美洲型毒株VR-2332序列相比在Nsp2基因的第 483位和535 563位氨基酸發(fā)生缺失，是一株典型的PRRSV強毒變異株。通過將高致病性PRRSV強毒HuM株體外傳代致弱獲得的減毒活疫苗株HuM-Fl 12，由大量臨床實驗證實所獲得的HuN4-F112弱毒疫苗株具有很好的免疫保護力，實驗組動物可以抵抗致死性強毒攻擊而不出現(xiàn)高致病PRRS的臨床癥狀(專利號為200810097546. 8的中國發(fā)明專利)。正是在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明利用豬繁殖與呼吸綜合征病毒HuN4-F112疫苗株基因組全長cDNA克隆pSK-HuN4-F112，通過突變PCR等技術(shù)構(gòu)建了兩個Nsp2基因的穩(wěn)定缺失區(qū)域的突變體感染性克隆，即(1ΗΝ4-Δ52和(1ΗΜ-Δ25，同時在上述兩個缺失區(qū)域內(nèi)分別插入抗原性比較強的新城疫病毒NP蛋白的表位(C末端49個氨基酸)作為標(biāo)記基因，并成功獲得了能夠穩(wěn)定遺傳的基因工程標(biāo)記弱毒疫苗毒株，即rHN4- Δ 52+ΝΡ49和rHN4_ Δ 25+ΝΡ49，通過實驗證實所獲得的上述具有遺傳標(biāo)記的感染性克隆毒株可以作為基因工程標(biāo)記弱毒疫苗應(yīng)用于對高致病性豬繁殖與呼吸綜合征的防治。實施例1豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因缺失毒株的構(gòu)建及鑒定1.材料與方法1. 1病毒、載體與試劑PRRSV疫苗株HuM-Fl 12由本實驗室傳代致弱并保存、感染性克隆載體 pSK-Hun4-F112 由本實驗室構(gòu)建并保存(童光志等 2007 ；Tong GZ et al.，2007 ；Zhou YJ et al.，2008 ；TianZJ et al.，2009)，RNeasy Plus Mini Kit 試劑盒購自 QIAGEN ；膠回收試劑盒購自上海華舜生物科技有限公司；SupersciptIII reverse transcriptase和platinum pfx DNA polymerase 購自 Invitrogen ;RNase H, T4DNA 連接酶、限制性內(nèi)切酶購自 NEB 公司；DL-15000，DL-2000DNA Marker購自TakaRa ；其它化學(xué)試劑均是進口或國產(chǎn)分析純。1.2引物設(shè)計根據(jù)PRRSV HuM 株(GenBank 登錄號EF635006)Nsp2 基因序列，用 Olio 6. 0 軟件設(shè)計了 2對引物F Δ 52/R Δ 52與R Δ 25/F Δ 25 (見表1)，其中引物涵蓋了進行缺失突變的
基因區(qū)域。表lNsp2基因突變引物名稱及序列
權(quán)利要求
1.一種重組豬繁殖與呼吸綜合征病毒，其特征在于，包含豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒疫苗株HuN4-F112的基因組核酸，所述HuM-Fl 12基因組在編碼豬繁殖與呼吸綜合征病毒Nsp2蛋白的基因區(qū)域內(nèi)包含一個缺失或突變，所述缺失選自(1)編碼Nsp2蛋白第480-532位氨基酸的核苷酸序列的缺失；(2)編碼Nsp2蛋白第508-532位氨基酸的核苷酸序列的缺失；所述突變選自(a)在(1)所述的缺失區(qū)域插入編碼新城疫病毒NP蛋白的核苷酸序列；(b)在( 所述的缺失區(qū)域插入編碼新城疫病毒NP蛋白的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組豬繁殖與呼吸綜合征病毒，其特征在于，所述缺失區(qū)域插入的核苷酸序列是編碼新城疫病毒NP蛋白C末端49個氨基酸的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組豬繁殖與呼吸綜合征病毒，其特征在于，所述HuN4-F112 基因組還包含標(biāo)記性的MluI限制性內(nèi)切酶位點。
4.一種核酸分子，其特征在于，包含豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒疫苗株HuN4-F112 的基因組多核苷酸序列，該多核苷酸序列在編碼豬繁殖與呼吸綜合征病毒Nsp2蛋白的基因區(qū)域內(nèi)包含一個缺失或突變，所述缺失選自(1)編碼Nsp2蛋白第480-532位氨基酸的核苷酸序列的缺失；(2)編碼Nsp2蛋白第508-532位氨基酸的核苷酸序列的缺失；所述突變選自(a)在(1)所述的缺失區(qū)域插入編碼新城疫病毒NP蛋白的核苷酸序列；(b)在( 所述的缺失區(qū)域插入編碼新城疫病毒NP蛋白的核苷酸序列。
5.一種包含權(quán)利要求4所述核酸分子的重組載體。
6.一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒疫苗株，其特征在于，包含豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒疫苗株HuM-Fl 12的基因組核酸，所述HuM-Fl 12基因組在編碼豬繁殖與呼吸綜合征病毒Nsp2蛋白的基因區(qū)域內(nèi)包含一個突變，該突變是在編碼Nsp2蛋白第480-532 位氨基酸的核苷酸序列的缺失區(qū)域，插入編碼新城疫病毒NP蛋白的核苷酸序列；或在編碼 Nsp2蛋白第508-532位氨基酸的核苷酸序列的缺失區(qū)域，插入編碼新城疫病毒NP蛋白的核苷酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒疫苗株，其特征在于，所述缺失區(qū)域插入的核苷酸序列是編碼新城疫病毒NP蛋白C末端49個氨基酸的核苷酸序列。
8.權(quán)利要求1所述的重組豬繁殖與呼吸綜合征病毒在制備預(yù)防或治療高致病性豬繁殖與呼吸綜合征的疫苗中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求6所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒疫苗株在制備預(yù)防或治療高致病性豬繁殖與呼吸綜合征的疫苗中的應(yīng)用。
10.一種區(qū)分權(quán)利要求6所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒疫苗株與自然感染毒株的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟利用表達(dá)的新城疫病毒NP蛋白作為檢測抗原，建立ELISA抗體檢測方法，用該方法檢測免疫動物針對NP49蛋白產(chǎn)生的抗體，以區(qū)分出具有基因工程標(biāo)記的弱毒疫苗株與自然感染毒株。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因工程標(biāo)記弱毒疫苗株，該疫苗株包含豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒疫苗株HuN4-F112的基因組核酸，所述HuN4-F112基因組在編碼Nsp2蛋白的基因區(qū)域內(nèi)包含一個突變，該突變是在編碼Nsp2蛋白第480-532位氨基酸的核苷酸序列的缺失區(qū)域，插入編碼新城疫病毒NP蛋白的核苷酸序列；或在編碼Nsp2蛋白第508-532位氨基酸的核苷酸序列的缺失區(qū)域，插入編碼新城疫病毒NP蛋白的核苷酸序列。本發(fā)明還公開了一種上述基因工程標(biāo)記弱毒疫苗株的應(yīng)用。本發(fā)明的豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因工程標(biāo)記弱毒疫苗株，不僅在免疫豬體后能對豬抵抗高致病性PRRSV提供完全的安全免疫保護，而且能在血清學(xué)和病原學(xué)上有效區(qū)分豬繁殖與呼吸綜合征疫苗免疫豬與野毒自然感染豬。
文檔編號C12N15/63GK102250843SQ20111014682
公開日2011年11月23日 申請日期2011年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月1日
發(fā)明者周艷君, 張善瑞, 徐彥召, 童光志 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所