十字花科蔬菜根腫病菌熒光定量pcr檢測技術及應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種根腫菌的熒光定量PCR檢測技術及應用。用于快速準確地對十字花科蔬菜根腫病菌進行定量檢測。該技術包括如下步驟：樣本中DNA提取，特異性引物設計，應用以SYBRGreenI為基礎的染料法熒光定量PCR檢測技術對根腫菌的ITS區(qū)基因片段進行實時熒光定量PCR檢測，構建標準曲線，計算待測樣本中的ITS區(qū)基因片段拷貝數(shù)和根腫病菌的濃度。該檢測技術操作簡便、快速；特異性強、靈敏度高；檢測靈敏度最高可達到24個拷貝數(shù)每個反應，并且可以同時進行大批量的樣本分析。為病害的早期預測預報提供了良好的基礎，因此，該方法適于在植物病害診斷檢測領域廣泛推廣應用。
【專利說明】十字花科蔬菜根腫病菌熒光定量PCR檢測技術及應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明為一種十字花科蔬菜根腫病菌的熒光定量PCR檢測技術及應用，專用于檢測十字花科蔬菜根腫病菌，屬于農作物病害診斷與防治【技術領域】。
【背景技術】
[0002]蕓薹根腫菌feassicae)引起十字花科蔬菜的根腫病，主要寄生于蕓苔屬多種植株的根部。在全世界均有分布，近年來其危害范圍從十字花科蔬菜擴展到一些花卉植物，侵染栽培及野生植物100個種(變種)以上。根腫病每年造成的世界范圍內的損失達到10-15%。感病植株被根腫菌侵染后形成根腫組織，植株矮小、易萎蔫(Voorips,1995) 0病原菌從腐爛的根腫組織中釋放出來形成休眠孢子能夠存活很多年(ffalIenhammar, 1996)。根腫菌休眠孢子萌發(fā)和侵染的最適土溫為18~25°C,最適土壤持水量為70%，最適土壤酸堿度為5.4~6.5 (李寶聚，2008)。根腫菌休眠孢子在感病寄主根系分泌物的溶液中萌發(fā)率可以達到75% (肖崇剛，2002)。在蕓薹屬植株重復種植的過程中這些休眠孢子在土壤中逐漸積累，病害程度逐年加重(Robert等2009)。
[0003]在病害癥狀明顯表現(xiàn)之前不容易預測和避免根腫病菌的侵染，甚至在農民認為沒有根腫病侵染或田間無病菌 的情況下，根腫菌的休眠孢子已經悄無聲息地從一個地方的土壤以及水中傳播到另一個地方，由于上述種種原因導致十字花科蔬菜根腫病的防治十分困難，因此，發(fā)展有效且快速的十字花科根腫病菌檢測技術，有效的避免該病的蔓延和傳播，對于十字花科根腫病的防治具有十分重要的意義。
[0004]由于根腫病菌不能直接培養(yǎng)，它的常規(guī)土壤檢測依賴于感病植株的生測實驗，或者通過根部的癥狀直接評估，或者通過顯微鏡檢測根腫菌侵染情況(Toxopeus等1975)。近來，熒光顯微鏡，免疫學和建立在DNA基礎上的檢測方法逐漸應用于檢測土壤，水或植株樣品中的根腫菌。這些檢測方法不夠快速，并且不能對植株、水以及土壤樣品中的根腫菌進行定量，隨著分子診斷技術在醫(yī)學、畜牧學以及植物病理學的廣泛應用，并且一方面從診斷單一靶標到雙重以及多重PCR方向發(fā)展，另一方面從定性PCR向實時熒光定量PCR(RT1-PCR)方向發(fā)展，這為我們對植株、土壤以及水中根腫菌的快速檢測提供了強有力的基礎。
[0005]RT-PCR是通過PCR在指數(shù)擴增期間連續(xù)檢測熒光信號的強弱來即時檢測特異性產物的量，并據(jù)此評估目的基因的起始模板量。與常規(guī)PCR相比，具有操作簡便、高效快速、敏感性強、可重復性好和特異性高的優(yōu)點。SYBR Green I熒光定量PCR的工作原理是在常規(guī)PCR的體系中加入熒光染料SYBR Green I，SYBR Green I是一種結合于雙鏈DNA小溝中的熒光染料，與雙鏈DNA結合后，其熒光大大增強。在PCR反應體系中加入過量的SYBRGreen I熒光染料，熒光染料能夠特異性地摻入到DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的熒光染料分子不發(fā)射任何熒光信號。從而隨著PCR反應的進行，保證熒光信號的增強與PCR產物增加完全同步，信號增強到某一閾值的循環(huán)次數(shù)(用循環(huán)閾值Ct表示)被記錄下來，Ct值和PCR體系中起始模板的對數(shù)之間有嚴格的線性關系，利用陽性定量標準品擴增的Ct值和標準曲線，再根據(jù)待測樣品的Ct值就可以準確計算出起始模板中某核酸的存在及數(shù)量。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明的目的在于克服根腫菌傳統(tǒng)檢測方法的不足，提供一種根腫菌的熒光定量PCR快速檢測的方法。
[0007]本發(fā)明的另一個目的在于提供一種熒光定量PCR檢測技術在十字花科蔬菜根腫病流行監(jiān)測預報，土壤帶菌以及種子帶菌檢測方面的應用。
[0008]該檢測技術，在植物病害診斷與防治領域可以大規(guī)模推廣。
[0009]本發(fā)明的目的通過以下技術方案實現(xiàn):
該方法的實驗步驟為:從待測樣本提取DNA ;將加入標準品及待測樣品的熒光定量反應液上機，用熒光定量檢測儀進行PCR檢測；通過比較待測樣品和標準品的循環(huán)閾值，根據(jù)標準曲線計算出待測樣品的起始DNA濃度。
[0010]本發(fā)明的技術具體包括如下步驟:
1、取田間自然發(fā)病土壤、發(fā)病植株、十字花科蔬菜種子，進行總DNA的提取純化，得到DNA樣本；
2、特異性引物設計，為避免由于引物?；暂^低，PCR反應中出現(xiàn)假陽性結果或對非目標真菌產生非特異性擴增，本發(fā)明在系統(tǒng)分析根腫病菌的ITS區(qū)、18SrRNA和5.8 SrRNA核酸序列系統(tǒng)發(fā)育的基礎上，采用CLUSTAL，與根腫菌綱及土傳病原菌的該區(qū)序列進行比較，尋找根腫病菌的特異性序列區(qū)域；選擇根腫病菌特異性序列區(qū)域，設計實時突光 PCR 弓丨物，通過 Blast pogram (http: //blast, ncb1.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比較所設計的引物序列與其它生物種沒有顯著同源性。引物對1，正義引物序列為:(5’ -TCTTGCGTGTCGCTGTATTC-3’)，反義引物序列為:(5’ -ATAGGTTGGGGTAACTTGGC-3’)，擴增片段大小為137bp (圖1);引物對2，正義引物序列為:(CTCACAACGATGAAGAAC)，反義引物序列為:(5’-ACTCACAGCCAAAGACAAGC-3’)，擴增片段大小為 140bp (圖 2)。
[0011]Plasmodi ophora brassicae 18S rRNA、ITSl、5.8S rRNA 和 ITS2 部分序列 NCBI 登錄號分別為(HM015883.1)和(EF195335.1)。
[0012]3、實時熒光定量PCR反應體系為:熒光定量PCR反應體系總體積為25μ1，其中SYBR Premix Ex Taq (內含 TaKaRa Ex Taq TM HS, dNTP Mixture，Mg2+和 SYBR Green I )12.5μ1，濃度為10Mmol/L的正義引物PBF2 (PBF3)和反義引物PBR2 (PBR3)各0.5μ1，標準品10倍梯度稀釋液或待檢測樣品DNA溶液2μ1，ddH20補齊至25μ1 ；
4、PCR反應程序為:PCR采用兩步法，950C3min,接著進行40個循環(huán)，每個循環(huán)包括950C IOs,60 0C 30s ;PCR完成后，按0.1°C s—1升溫速率從72°C升至95°C進行融解曲線的分析驗證；
5、插入ITS區(qū)的pMD-20載體轉化大腸桿菌DH5α增殖后提取的質?；蚪MDNA，DNA經紫外分光光度計Α260定量并10倍梯度稀釋，稀釋成6個濃度梯度，按照上述PCR反應體系和程序進行擴增；反應結束后，根據(jù)各個濃度梯度的循環(huán)閾值(Ct)采用計算機自動繪制熒光定量PCR標準曲線；
6、取步驟I)中得到的DNA樣本作為模板，按上述熒光定量PCR反應體系和反應程序在實時熒光定量PCR儀上進行擴增，并同時進行陰性對照和陽性對照的擴增，其中陰性對照采用ddH20，陽性對照采用質粒基因組DNA ;反應結束后，將DNA樣本的循環(huán)閾值(Ct)與標準曲線對照，得到DNA樣本中的ITS區(qū)基因片段拷貝數(shù)，進而得到原來樣本中根腫病菌的濃度。
[0013] 十字花科蔬菜根腫病菌實時熒光定量PCR檢測技術可以生成試劑盒包括標準陽性DNA模板、熒光定量反應液。
[0014]標準陽性DNA模板由含有插入目的片段的pGM-T (購自天根公司)載體制備而成。標準品的制備過程為:采用引物ITSl和ITS4擴增根腫病菌的ITS區(qū)，PCR產物電泳后切下含有目標片段的凝膠，目標片段用凝膠試劑盒回收純化后與PGM-T載體16°C過夜連接，轉化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞。轉化產物涂平板培養(yǎng)，挑去白斑，采用引物為GZ10/GZ11和PBF2/PBR2以及PBF3/PBF3進行PCR鑒定。陽性克隆通過序列分析進一步鑒定結果的可靠性。選擇PCR和序列分析均為陽性的克隆，接種到含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，采用質粒小提試劑盒(購自天根公司)制備質粒DNA。DNA經紫外分光光度計A260定量，經10 倍梯度稀釋為 104ng-104fg/ μ L 和 216ng_216fg/ μ L，保存于 _20°C。
[0015]熒光定量反應液由正義引物PBF2、反義引物PBR2、熒光染料SYBR Premix Ex Taq內含 TaKaRa Ex Taq TM HS, dNTP Mixture，Mg2+和 SYBR Green I 組成。
[0016]熒光定量反應液由正義引物PBF3、反義引物PBR3、熒光染料SYBR Premix Ex Taq內含 TaKaRa Ex Taq TM HS, dNTP Mixture，Mg2+和 SYBR Green I 組成。
[0017]本發(fā)明提供的根腫病菌熒光定量PCR檢測技術，針對根腫病菌基因組ITS區(qū)特異的靶序列設計引物，通過優(yōu)化反應體系(引物濃度、擴增程序等)的優(yōu)化，采用定量檢測系統(tǒng)(包括ABI Prism系統(tǒng)、PE Applied Bioasystems、Bio_Rad),可用于各種來源的根腫病菌的定量檢測。弓丨物對I的檢測限點為1.04fg質粒DNA/μ I相當于24個細胞，引物對2的檢測限點為2.16fg質粒DNA/μ I相當于45個細胞。
[0018]本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有以下優(yōu)點和效果:
I)特異性好、鑒定快速
引物包括根腫菌的特異性序列，檢測特異性高。環(huán)境中，特別是十字花科蔬菜的根際微生物種類繁多，根腫菌為嚴格的專性寄生菌，不能離體培養(yǎng)，因此，不能采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)的方法檢測，本發(fā)明克服了這一不足之處，并且檢測快速。
[0019]2)準確定量、靈敏度高
與普通PCR檢測相比，本發(fā)明可以準確定量，目標DNA在KMng-KMfg/yL濃度范圍內，都有良好的線性關系；同時檢測具有重復性好的特點。
[0020]3)實用性好、應用范圍廣
可以定量檢測植物植株、土壤、種子以及水中的根腫菌，結合十字花科蔬菜根腫病的田間發(fā)病閾值，可以為病害的早期預測預報提供有力參考。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1是引物對PBF2/PBR2特異性檢測PCR擴增結果。1，2的模板為白菜腫根基因組DNA，3-10的模板分別為馬鈴薯粉痂菌DNA、禾谷多粘霉菌DNA、尖孢鐮刀菌DNA、辣椒疫霉菌DNA、瓜果腐霉菌DNA、立枯絲核菌DNA、半裸鐮刀菌DNA、串珠鐮刀菌DNA，M為150bp DNAladder (Takara 公司)。[0022]圖2是引物對PBF3/PBR3特異性檢測PCR擴增結果。I的模板為白菜腫根基因組DNA，2-9的模板分別為馬鈴薯粉痂菌DNA、禾谷多粘霉菌DNA、尖孢鐮刀菌DNA、辣椒疫霉菌DNA、瓜果腐霉菌DNA、立枯絲核菌DNA、半裸鐮刀菌DNA、串珠鐮刀菌DNA，M為150bp DNAladder (Takara 公司)。
[0023]圖3實施例2熒光定量PCR擴增的標準曲線，縱軸為Ct，橫軸為Log CO ;標準誤為
0.995。
[0024]圖4實施例2熒光定量PCR陽性標準品的擴增曲線，縱軸為Delta Rn ；橫軸為Cycle Number,曲線1，2，3，4，5和6的模板為陽性標準品，反應體系中DNA含量分別為
1.04ng, 104pg, 10.4pg, 1.04pg, 104fg, 10.4fg。
[0025]圖5實施例3熒光定量PCR的擴增曲線，縱軸為Delta Rn ;橫軸為Cycle Number,曲線1，2，3，4，5和6的模板為陽性標準品，反應體系中DNA含量分別為1.04ng, 104pg,10.4pg，1.04pg，104fg, 10.4fg ；7 和 8 是待測樣品。
[0026]圖6實施例4熒光定量PCR擴增的標準曲線，縱軸為Ct，橫軸為Log CO ;標準誤為
0.999。
[0027]圖7實施例4熒光定量PCR陽性標準品的擴增曲線，縱軸為Delta Rn ;橫軸為Cycle Number,曲線1，2，3，4，5和6的模板為陽性標準品，反應體系中DNA含量分別為
2.16ng, 216pg, 21.6pg, 2.16pg, 216fg, 21.6fg。
【具體實施方式】
[0028]下面結合具體實例，進一步闡述發(fā)明。應當理解，下列實例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護范圍。應用實例中DNA提取采用的是試劑盒，實際應用中也可以采用改良CTAB等方法。
[0029]實施例1:根腫病菌的特異性引物檢測
采用十字花科蔬菜作物根際微生物中常見的土傳病原菌為材料，對根腫病菌引物對PBF2/PBR2和PBF3/PBR3進行特異性檢測。白菜腫根于_20°C冰箱中保存。其它土傳病原真菌菌株用PDA或H)液體培養(yǎng)基培養(yǎng)。所有菌株先在固體培養(yǎng)基上活化，然后轉入液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，I周后收集菌絲或菌體提取DNA。DNA的提取采用改良的CTAB提取法。
[0030]以蕓薹根腫菌及其它土傳病害的病原菌真菌基因組DNA為模板，利用引物PBF2/PBR2進行普通PCR擴增，以檢測該引物的特異性。普通PCR反應體系如下:總反應體積25 μ L, 10XPCR buffer 2.5 μ L, dNTP (10 μ mol/L) 0.5 μ L，引物(10 μ mol/L)各 0.5 μ L，模板DNA 2.0μ L, TapDNA聚合酶(λ 5 μ L，最后以ddH20補足至25 μ L。PCR反應程序為:94°C預變性3min ;94°C變性30s，60。。退火lmin，72°C延伸1.5min，共38個循環(huán)；72°C延伸7 min。PCR擴增產物在1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測(圖1)。
[0031]利用引物PBF3/PBR3進行普通PCR擴增，以檢測該引物的特異性。普通PCR反應體系如下:總反應體積 25μ L，10XPCR buffer 2.5 μ L, dNTP (10 μ mol/L) 0.5 μ L，引物(10 μ mol/L)各 0.5 μ L，模板 DNA2.0 μ L，TapDNA 聚合酶 0.5 μ L，最后以 ddH20 補足至 25μ L。PCR 反應程序為:94°C預變性 3min ;94°C變性 30s，57。。退火 lmin，72°C延伸 1.5min，共35個循環(huán)；72°C延伸7 min。PCR擴增產物在1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測(圖2)。
[0032]表1引物特異性檢測菌株
【權利要求】
1.一種十字花科蔬菜根腫病菌的熒光定量PCR檢測技術，其特征在于包括以下步驟: 取田間自然發(fā)病土壤、發(fā)病植株、十字花科蔬菜種子，進行總DNA的提取純化，得到DNA樣本； 特異性引物設計，在系統(tǒng)分析根腫病菌的ITS區(qū)、18SrRNA和5.8rRNA核酸序列系統(tǒng)發(fā)育的基礎上，采用CLUSTAL，與根腫菌綱及土傳病原菌的該區(qū)序列進行比較，尋找根腫病菌的特異性序列區(qū)域，設計特異性引物對I (PBF2/PBR2)，引物對2 (PBF3/PBR3)，所述的引物對為:
弓 I物對 I 正向引物 5’ -CTTGCGTGTCGCTGTATTC-3’ 反向引物 5’-ATAGGTTGGGGTAACTTGGC-3’ ； 引物對 2 正向引物 5’ -CTCACAACGATGAAGAAC-3’
反向引物 5’ -ACTCACAGCCAAAGACAAGC-3’ 3)實時熒光定量PCR反應體系為:熒光定量PCR反應體系總體積為25μ1，其中SYBRPremix Ex Taq(內含 TaKaRa Ex Taq TM HS, dNTP Mixture, Mg2+和 SYBR Green I )12.5μ1，濃度為10Mmol/L的正義引物PBF2 (PBF3)和反義引物PBR2 (PBR3)各0.5μ1，標準品10倍梯度稀釋液或待檢測樣品DNA溶液2μ1，ddH20補齊至25μ1 ； 4)PCR反應程序為:PCR采用兩步法，950C 3min，接著進行40個循環(huán)，每個循環(huán)包括950C IOs,60 0C 30s ;PCR完成后，按0.1°C s—1升溫速率從72°C升至95°C進行融解曲線的分析驗證； 5)插入ITS區(qū)的pMD-20載體轉化大腸桿菌DH5α增殖后提取的質?；蚪MDNA，DNA經紫外分光光度計Α260定量并10倍梯度稀釋，稀釋成6個濃度梯度，按照上述PCR反應體系和程序進行擴增；反應結束后，根據(jù)各個濃度梯度的循環(huán)閾值(Ct)采用計算機自動繪制熒光定量PCR標準曲線； 6)取步驟I)中得到的DNA樣本作為模板，按上述熒光定量PCR反應體系和反應程序在實時熒光定量PCR儀上進行擴增，并同時進行陰性對照和陽性對照的擴增，其中陰性對照采用ddH20，陽性對照采用根腫菌菌株基因組DNA ;反應結束后，將DNA樣本的循環(huán)閾值(Ct)與標準曲線對照，得到DNA樣本中的ITS區(qū)基因片段拷貝數(shù)，進而得到原來樣本中根腫病菌的濃度。
2.權利要求書I所述的檢測十字花科蔬菜根腫病的熒光定量PCR檢測技術可以轉化成商品化的試劑盒，試劑盒包括:正義引物PBF2、反義引物PBR2 (正義引物PBF3、反義引物PBR3)、熒光染料 SYBR Premix Ex Taq 內含 TaKaRa Ex Taq TM HS, dNTP Mixture, Mg2+和SYBR Green 1、以及由插入ITS區(qū)的pMD_20載體轉化大腸桿菌DH5 α增殖后提取的質粒DNA, DNA經紫外分光光度計Α260定量并10倍梯度稀釋。
3 .該技術可以應用于對農田環(huán)境中，包括對土壤中越冬菌量和十字花科蔬菜植株上根腫病菌進行實時監(jiān)測，以及檢測十字花科蔬菜種子帶菌和田間灌溉水中的根腫病菌。
【文檔編號】C12Q1/68GK103966307SQ201310044418
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2013年2月5日 優(yōu)先權日:2013年2月5日
【發(fā)明者】謝學文, 李金萍, 李寶聚, 石延霞, 柴阿麗 申請人:中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所