高靈敏監(jiān)測POPs的轉(zhuǎn)熒光蛋白基因魚的制作與應用的制作方法

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高靈敏監(jiān)測POPs的轉(zhuǎn)熒光蛋白基因魚的制作與應用的制造方法與工藝

本發(fā)明涉及基因工程與環(huán)境科學領域，特別是涉及一種高靈敏監(jiān)測pops的轉(zhuǎn)熒光蛋白基因魚的制作與應用。

背景技術(shù)：

生物監(jiān)測是指從生物學角度評價環(huán)境質(zhì)量狀況的過程，通過觀測生物個體、種群或群落對環(huán)境質(zhì)量及其變化所產(chǎn)生的反應和影響，進而闡明其所處環(huán)境污染的性質(zhì)、程度和范圍，包括生物種群及群落調(diào)查、急性慢性毒性試驗、水體微生物測試和魚類組織污染物分析。德國是最早開展生物監(jiān)測的國家，早在20世紀初，已經(jīng)開展利用水生生物監(jiān)測水質(zhì)的工作，時至今日，歐盟、美國等發(fā)達國家均已建立了相對比較完備的環(huán)境生物監(jiān)測體系。中國起步相對較晚，1993年隨著《水生生物監(jiān)測手冊》的出版，初次建立了國家水生生物監(jiān)測網(wǎng)，開始在全國范圍內(nèi)開展水生生物監(jiān)測工作。直至21世紀初，生物監(jiān)測工作才再次得到重視。

目前傳統(tǒng)的生物監(jiān)測方法，耗時費力，且不能用于直觀監(jiān)測。2001年，mattingly等證實人的cyp1a1啟動子在tcdd的誘導下在48hpf前胚胎中可以觀察到gfp的局部表達，但不能用于活體直觀監(jiān)測。2004年，nebert等公布了利用luc轉(zhuǎn)基因斑馬魚監(jiān)測芳香烴類pops的專利(專利號：us20040147030)，但是該技術(shù)所使用的斑馬魚所轉(zhuǎn)基因為luc，檢測持續(xù)性有機物靈敏度低，同時也不能解決外源基因在受體魚中的整合、表達和遺傳問題；此外，檢測luc基因表達需要特殊儀器。因而，他們所研制的轉(zhuǎn)luc基因斑馬魚一直未能在環(huán)境有毒污染物的監(jiān)測中得到實際應用。ngghb(2013)制作了轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白青鳉以及kun-heekima(2013)制作了轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白斑馬魚，這個綠色熒光蛋白前帶有可以誘導的cyp1a啟動子，在進行tcdd暴露后青鳉和斑馬魚熒光表達均有不同程度的增強，但是這些轉(zhuǎn)基因魚只在實驗室內(nèi)進行毒物的檢測，并沒有將其應用到環(huán)境監(jiān)測中來，并且綠色熒光在顯微鏡觀察下腹部具有明顯的背景值，不便于觀察。因此構(gòu)建熒光蛋白斑馬魚并在環(huán)境中進行有效應用是當前急需解決的問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點，本發(fā)明的目的在于提供一種監(jiān)測pops的轉(zhuǎn)熒光蛋白基因魚的制作與應用，用于解決現(xiàn)有技術(shù)中監(jiān)測環(huán)境中有毒物質(zhì)時靈敏度低、不便于觀察等問題。

為實現(xiàn)上述目的及其他相關目的，本發(fā)明第一方面提供一種監(jiān)測pops的轉(zhuǎn)熒光蛋白基因魚的培養(yǎng)方法，包括如下步驟：

1)獲取響應啟動子：提供能被pops誘導表達的基因的啟動子序列，設計引物，擴增得到對持續(xù)有機污染物有響應的啟動子，即響應啟動子；

2)載體構(gòu)建：將步驟1)獲得的響應啟動子連接到載體中，得到連接有響應啟動子的載體，即響應載體，所述響應載體還包括熒光蛋白序列；

3)注射培養(yǎng)：將核酸酶與步驟2)獲得的響應載體共同注射至魚的受精卵，培養(yǎng)獲得能夠監(jiān)測水體中pops的轉(zhuǎn)熒光蛋白基因魚。

進一步地，步驟1)中，被pops誘導表達的基因選自cyp1a基因。

進一步地，步驟1)中，所述響應啟動子選自cyp1a啟動子，所述cyp1a啟動子含有如seqidno.1所示的序列。

進一步地，步驟3)中，所述魚選自斑馬魚，當然，其他魚類也可適用。根據(jù)魚的種類擴增其cyp1a啟動子序列。

進一步地，所述pops選自tcdd、pahs中的至少一種。pahs包括但不限于nap、phe、baa、bap、bghip。

進一步地，步驟1)中，提取并純化魚的基因組dna，通過巢式pcr獲得響應啟動子。

進一步地，步驟1)中，巢式pcr第一輪反應的引物為cyp1a-nested-f和cyp1a-nested-r，cyp1a-nested-f的序列如seqidno.2所示，cyp1a-nested-r的序列如seqidno.3所示。

進一步地，步驟1)中，巢式pcr第二輪反應的引物為cyp1a-apa1-f和cyp1a-apa1-r，cyp1a-apa1-f的序列如seqidno.4所示，cyp1a-apa1-r的序列如seqidno.5所示。

進一步地，步驟2)中，所述響應載體帶有i-scei大范圍核酸酶轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。

進一步地，步驟2)中，所述熒光蛋白選自mcherry。

進一步地，步驟1)中，將pcr產(chǎn)物與peasy-blunt3cloningvector連接，獲得peasy-cyp1apromoter質(zhì)粒。

進一步地，步驟2)中，采用轉(zhuǎn)染試劑將響應載體瞬時轉(zhuǎn)染至細胞中，污染物暴露，篩選得到對pops有響應效果的響應載體，轉(zhuǎn)入下一步進行注射。

進一步地，步驟3)中，所述核酸酶選自i-scei酶。

進一步地，步驟3)中，將核酸酶與步驟2)獲得的響應載體共同注射至魚的受精卵，培養(yǎng)獲得f0代魚，篩選獲得對pops有響應的f0代魚，將有響應的f0代魚與野生型魚雜交，收集魚卵，污染物暴露，篩選得到對pops有響應的f1代魚，f1代魚再次與野生型魚雜交，收集魚卵，污染物暴露，篩選得到對pops有響應的f2代魚，將f2代魚自交，獲得f3代魚，從f3代魚中篩選得到對pops有響應的純系轉(zhuǎn)熒光蛋白基因魚。

本發(fā)明第二方面提供上述方法培養(yǎng)獲得的轉(zhuǎn)熒光蛋白基因魚。

本發(fā)明第三方面提供上述轉(zhuǎn)熒光蛋白基因魚在監(jiān)測水體pops中的應用。

本發(fā)明第四方面提供一種響應載體，所述響應載體帶有i-scei大范圍核酸酶轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，所述響應載體包括響應啟動子序列以及熒光蛋白序列。

進一步地，所述響應啟動子選自cyp1a啟動子，所述cyp1a啟動子含有如seqidno.1所示的序列。

進一步地，所述熒光蛋白選自mcherry。

本發(fā)明第五方面提供上述響應載體用于培養(yǎng)熒光蛋白基因魚的用途。

如上所述，本發(fā)明的一種監(jiān)測pops的轉(zhuǎn)熒光蛋白基因魚的制作與應用，具有以下有益效果：本發(fā)明針對目前傳統(tǒng)水環(huán)境pops(持續(xù)性有機污染物)監(jiān)測方法繁瑣，且需昂貴的儀器及專業(yè)的技術(shù)人員，不能實現(xiàn)對環(huán)境pops進行有效的監(jiān)測等缺陷，本發(fā)明利用pcr技術(shù)原理，從魚的自身獲得對pops敏感的cyp1a基因啟動子，并構(gòu)建攜帶i-scei大范圍核酸酶轉(zhuǎn)移系統(tǒng)和熒光蛋白的pi-scei-cyp1apromoter-mcherry質(zhì)粒，最后通過顯微注射技術(shù)，獲得可以對水體中pops進行簡單、高效、直觀監(jiān)測的轉(zhuǎn)紅色熒光斑馬魚。因此，與傳統(tǒng)的pops監(jiān)測手段相比，本發(fā)明提供了一種方便快捷的生物監(jiān)測手段，對實現(xiàn)pops實時監(jiān)測有重要的推動作用。

附圖說明

圖1顯示為本發(fā)明實施例的pi-scei-cyp1apromoter-mcherry質(zhì)粒圖譜。

圖2顯示為本發(fā)明實施例的細胞熒光驗證圖。

圖3顯示為本發(fā)明實施例中采用tcdd暴露轉(zhuǎn)紅色熒光斑馬魚之后的熒光驗證圖。

圖4顯示為本發(fā)明實施例中不同pahs暴露轉(zhuǎn)紅色熒光斑馬魚之后的熒光圖。

圖5顯示為本發(fā)明實施例中各土樣提取液暴露轉(zhuǎn)紅色熒光斑馬魚之后的熒光圖。

圖6顯示本發(fā)明實施例中各土樣提取液暴露轉(zhuǎn)紅色熒光斑馬魚之后的熒光強度定量圖。

圖7顯示為本發(fā)明實施例中各土樣的pahs含量圖。

具體實施方式

以下通過特定的具體實例說明本發(fā)明的實施方式，本領域技術(shù)人員可由本說明書所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的具體實施方式加以實施或應用，本說明書中的各項細節(jié)也可以基于不同觀點與應用，在沒有背離本發(fā)明的精神下進行各種修飾或改變。

實施例1

一、cyp1a啟動子擴增

1、斑馬魚基因組dna提取：取野生型ab斑馬魚，剪取尾鰭20-30mg于蒸餾水中漂洗數(shù)次，吸水紙吸干表面水分，置于1.5ml離心管中，眼科剪剪碎，按takara組織提取試劑盒操作說明，加入組織裂解液200μl，蛋白酶k20μl，rna酶10μl，漩渦混勻，置于56℃水浴鍋裂解2-3h，至無明顯組織塊。后續(xù)按試劑盒說明進行基因組dna的提取與純化。采用的試劑盒為takaramninbestuniversalgenomicdnaextactcionkitver5.0，貨號：9765，供應商：寶生物工程(大連)有限公司。cyp1a基因是根據(jù)文獻查找，根據(jù)前人的實驗結(jié)果得到，其具體公開于：zeruthg1,pollenzrs.isolationandcharacterizationofadioxin-induciblecyp1a1promoter/enhancerregionfromzebrafish(daniorerio)zebrafish2(3),197-210(2005)。

2、pcr擴增：根據(jù)在ncbi上查詢所得cyp1a啟動子序列，其序列如seqidno.1所示，用primer5引物設計軟件進行引物設計。利用hsdnapolymerase進行巢式pcr，第一輪反應采用引物cyp1a-nested-f(其序列如seqidno.2所示)和cyp1a-nested-r(其序列如seqidno.3所示)，pcr反應體系為50μl，具體包括：5xprimestarbuffer(mg²⁺plus)10μl、dntpmixture(2.5mmeach)4μl、cyp1a-nested-f+rmix1μl、hsdnapolymerase0.5μl、zebrafishgenomedna1μl、ddh2o33.5μl；pcr反應程序為：98℃預熱2min，98℃變性10s，55℃退火15s，72℃延伸3min，共30個循環(huán)，最后72℃延伸10min；以第一輪反應液為模板進行第二輪pcr反應，引物為cyp1a-apa1-f和cyp1a-age1-r，cyp1a-apa1-f序列如seqidno.4所示，cyp1a-age1-r序列如seqidno.5所示，反應體系同第一輪反應，反應退火溫度提高到58℃，待反應結(jié)束后，采用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測pcr產(chǎn)物，利用天根瓊脂糖凝膠回收試劑盒(該試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司)回收目的條帶，回收方法按試劑盒操作說明進行操作。

3、目的片段連平端載體并測序：膠回收pcr產(chǎn)物與peasy-blunt3cloningkit(貨號：cb301-01生產(chǎn)商：北京全式金生物技術(shù)有限公司)連接，克隆反應體系為5μl，具體包括：pcr產(chǎn)物50ng、peasy-blunt3cloningkit1μl，總體積不足5μl時，用水補足至5μl，25℃反應18min，反應結(jié)束后將連接產(chǎn)物加入50μltrans1-t1感受態(tài)細胞中，輕彈混勻，冰浴30min，42℃熱激30s，立即置于冰上2min，加入250μl平衡至室溫的lb培養(yǎng)基，在200rpm(搖床轉(zhuǎn)速)、37℃下培養(yǎng)1h。5000rpm離心1min，棄掉部分上清，剩余部分混勻，取全部菌液涂la平板，37℃過夜培養(yǎng)。次日菌落pcr挑取陽性克隆，搖菌過夜，提質(zhì)粒送江蘇金維智生物科技有限公司測序，測序結(jié)果與ncbi序列進行比對，與預期結(jié)果一致，該載體命名為peasy-cyp1apromoter。

二、質(zhì)粒構(gòu)建

1、質(zhì)粒酶切回收目的條帶：將質(zhì)粒peasy-cyp1apromoter和質(zhì)粒pi-scei-cmv-mcherry質(zhì)粒(實驗室已有質(zhì)粒，其序列如seqidno.12所示)用賽默飛快切酶apai和agei進行雙酶切，37℃恒溫水浴鍋放置30min，瓊脂糖凝膠電泳回收cyp1apromoter片段和pi-scei–mcherry骨架。cyp1apromoter即cyp1a啟動子，其序列如seqidno.1所示，pi-scei–mcherry骨架序列如seqidno.10所示?？烨忻竌pai和agei均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。mcherry序列如seqidno.8所示。

2、采用t4dna連接酶(購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司)進行連接反應：20μl反應體系包括10×buffer2μl、cyp1apromoter片段50ng、pi-scei–mcherry骨架100ng、t4dna連接酶0.2μl、余量為水。pcr儀中22℃連接1h，取10μl加入100μl感受態(tài)中，輕彈混勻，冰浴30min，42℃熱激90s，立即置于冰上2min，加入850μl平衡至室溫(25℃)的lb培養(yǎng)基，180rpm、37℃培養(yǎng)1h。5000rpm離心1min，棄掉部分上清，剩余混勻，取全部菌液涂la平板，37℃過夜培養(yǎng)。次日菌落pcr挑取陽性克隆，搖菌過夜，提質(zhì)粒酶切鑒定，陽性質(zhì)粒送江蘇金維智生物科技有限公司測序，測序結(jié)果與預期一致，該載體命名為pi-scei-cyp1apromoter-mcherry，圖1所示為pi-scei-cyp1apromoter-mcherry質(zhì)粒圖譜。pi-scei-cyp1apromoter-mcherry的序列如seqidno.9所示。

三、質(zhì)粒熒光誘導效果驗證

1、細胞傳代鋪板：利用人肝癌細胞hepg2進行熒光誘導效果驗證試驗，將25ml細胞培養(yǎng)瓶中細胞消化傳代至96孔細胞培養(yǎng)板中，接種細胞數(shù)量為1×10⁴個/孔，培養(yǎng)基為有血清無抗生素高糖dmem培養(yǎng)基。胎牛血清(fbs)含量為10％；dmem，highglucose(貨號：11965175)；胎牛血清(fbs)貨號：10100147。dmem與胎牛血清均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

2、細胞轉(zhuǎn)染：第二天，待上述96孔板中細胞長至70～80％融合，將步驟二中構(gòu)建好的質(zhì)粒pi-scei-cyp1apromoter-mcherry利用viafect^tm轉(zhuǎn)染試劑(名稱：viafect^tmtransfectionreagent；貨號：e4981；供應商：普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司)進行細胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染液體系為：10μldmem、0.1μg質(zhì)粒、0.3μl轉(zhuǎn)染試劑，配制混合物時，先加質(zhì)粒至dmem培養(yǎng)基中混合均勻，然后將轉(zhuǎn)染試劑直接加入到培養(yǎng)基中，不要沾到離心管壁上，立即吹打混勻，室溫孵育10min。然后將混合物滴加至培養(yǎng)的細胞中，輕輕吹打混合均勻，繼續(xù)培養(yǎng)6-8h。

3、tcdd梯度暴露：tcdd設置的濃度梯度為0、0.01、0.05、0.1和0.5nm，按照濃度要求加入完全培養(yǎng)基中，細胞繼續(xù)培養(yǎng)24h，利用熒光倒置顯微鏡觀察熒光表達情況，如圖2所示為細胞熒光圖，其中，c圖是指沒有轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細胞熒光圖。

四、顯微注射

顯微注射采用eppendorffemtojet4i顯微注射儀。顯微注射前夜，挑取性成熟ab型斑馬魚雌雄魚進行配對，雌雄數(shù)量比例為1:1(雌雄斑馬魚各兩條)，雌雄魚用隔板分開，待第二天開燈后根據(jù)注射需要依次打開隔板，打開隔板后，雄魚追尾雌魚，數(shù)分鐘后雌性斑馬魚即可排卵，收集受精卵用清水簡單清洗，用吸管依次排放在注射凹槽中。取步驟三驗證的重組質(zhì)粒pi-scei-cyp1apromoter-mcherry，將該重組質(zhì)粒和i-scei酶共注射到斑馬魚一細胞期胚胎中，注射液體系為10μl：pi-scei-cyp1apromoter-mcherry質(zhì)粒終濃度20～50ng/μl、10×buffer1μl、i-scei酶0.5μl、酚紅0.5μl，加雙蒸水補足至10μl。注射時，根據(jù)毛細玻璃管針尖大小，調(diào)試合適的注射壓力和注射時間，注射針從植物極穿過到達動物極，輕踏注射踏板可以看到紅色注射液進入胚胎動物極，輕輕抽出即可完成注射，單個胚胎質(zhì)粒注射量控制在20-50pg。斑馬魚1細胞期的時間約為0.5h，超過1細胞期的胚胎不進行注射。注射完成后吸取孵化水將胚胎從注射盤上沖洗到一個干凈的培養(yǎng)皿中，28℃恒溫培養(yǎng)，獲得轉(zhuǎn)基因斑馬魚f0代。

五、純合子篩選

1、斑馬魚基因組dna提取：將步驟四顯微注射所得斑馬魚胚胎精心飼養(yǎng)至兩月齡。剪取尾部，雙蒸水漂洗數(shù)次，吸水紙吸干表面水分，鑷子夾取放入1.5ml離心管中，用眼科剪盡量剪碎，加入100μlctab(hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化銨)裂解液(100mmtris-hclph8.5,0.5medta,10％sds,5mnacl)，同時加入1μl20mg/ml的蛋白酶k漩渦振蕩混勻，55℃水浴裂解2-3h，中間漩渦振蕩混勻數(shù)次，直至組織塊完全裂解。加入150μl氯仿，顛倒混勻，12000rpm離心4min，小心吸取上清(約80μl)至新的0.6ml離心管中，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻可見絮狀沉淀，12000rpm離心4min，棄上清，加入300μl75％乙醇，顛倒懸浮洗滌沉淀，10000rpm離心4min，棄上清，倒置晾干，加入20μl雙蒸水溶解沉淀，微量分光光度計進行濃度和純度檢測。

2、pcr檢測目的基因：根據(jù)注射外源質(zhì)粒pi-scei-cyp1apromoter-mcherry的序列設計檢測引物，pcr反應采用fasttaqdna聚合酶(購自北京全式金生物技術(shù)有限公司)，反應體系為20μl，具體包括：10xbuffer2μl、dntpmix1.6μl、fasttaqdnapolymerase0.1μl、10μm引物cyp1a-jc-f和cyp1a-jc-r的混合液0.4μl、斑馬魚基因組dna模板1μl、雙蒸水14.9μl。反應程序為：94℃3min，94℃5s，55℃15s，72℃10s；共35個循環(huán)，72℃延伸5min，16℃保存。反應結(jié)束后，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。引物cyp1a-jc-f序列如seqidno.6所示，引物cyp1a-jc-r序列如seqidno.7所示。

3、連接pmd-19t送測序驗證：取上述步驟2中有目的條帶的陽性pcr產(chǎn)物2μl，加入2μl雙蒸水和1μlpmd-19t載體(名稱：pmd-19tvectorcloningkit；貨號：6013；供應商：寶生物工程(大連)有限公司)，加入5μlsolutioni混勻，16℃反應30min。反應結(jié)束后，取反應液加入100μl感受態(tài)中，用槍頭輕輕攪拌混勻，冰浴30min，42℃熱激1.5min，加入850μllb培養(yǎng)基，180rpm、37℃恒溫搖床活化1h，5000rpm離心1min，棄部分上清，余下部分混勻涂布在具有羧芐青霉素的lb平板(羧芐青霉素在lb培養(yǎng)基中的濃度為100μg/ml)上，37℃倒置過夜培養(yǎng)。次日，菌落pcr驗證，陽性菌落搖菌過夜擴大培養(yǎng)，提質(zhì)粒送江蘇金維智公司測序，測序結(jié)果如seqidno.11所示，與預期一致。

4、f0代陽性轉(zhuǎn)基因魚后代驗證：取前述步驟四獲得的轉(zhuǎn)基因斑馬魚f0代，將f0代轉(zhuǎn)基因斑馬魚與野生斑馬魚進行一對一配對，收集f1代受精卵，次日隨機挑取5顆，按照步驟1-2的方法提取基因組dna，并進行pcr驗證。對pcr擴增獲得陽性條帶的受精卵，加入終濃度為1nm的tcdd進行暴露，暴露2天，熒光顯微鏡觀察熒光。將具有熒光的仔魚挑出進行飼養(yǎng)，直至性成熟。

5、轉(zhuǎn)紅色熒光斑馬魚純合子篩選：篩選出有紅色熒光表達的f1代，繼續(xù)培養(yǎng)至性成熟，再次與野生型斑馬魚雜交，低濃度tcdd暴露獲得有熒光表達的斑馬魚f2代，最后將篩選的f2代斑馬魚培育至性成熟后自交獲得f3代，f3代與野生型雜交，若后代均有熒光表達，則表示該f3代個體為純合子。

六：化學標準品和環(huán)境樣品檢測

1、轉(zhuǎn)熒光斑馬魚胚胎收集：試驗前夜，將轉(zhuǎn)基因紅色熒光蛋白斑馬魚品性成熟雌雄斑馬魚配對，次日收集胚胎于28℃恒溫培養(yǎng)箱12h，剔除其中未受精的斑馬魚胚胎。

2、化學標準品暴露：tcdd暴露共設置0.05、0.1、0.5、1和5nm五個濃度梯度，五種多環(huán)芳烴(pahs)暴露濃度為0μm萘、10μm菲、10μm苯并蒽、1μm苯并芘、10μm苯并苝，用dmso作為對照組，每個濃度梯度設置3個平行樣，每個平行樣放置50顆胚胎。胚胎置于生化恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)60h，期間注意觀察，及時清除死卵，避免惡化水質(zhì)。暴露結(jié)束，ms-222麻醉，利用nikon體式熒光顯微鏡進行熒光觀察記錄。

3、環(huán)境樣品暴露：

3.1、樣品來源：巴基斯坦卡拉奇電子垃圾回收站點土樣，采自卡拉奇三個地區(qū)共14個采樣點：lyari(ly124°85'71"n66°99'44"e、ly224°86'51"n67°01'96"e、ly324°88'09"n67°02'26"e、ly424°86'62"n67°08'52"e)、surjanitown(sj125°06'01"n67°06'01"e、sj225°02'77"n67°07'40"e、sj325°05'28"n67°11'83"e、sj425°02'23"n67°11'77"e、sj524°97'53"n66°09'64"e)和jacoblines(jc124°86'81"n67°02'40"e、jc224°85'26"n67°04'39"e、jc324°87'50"n67°04'42"e、jc424°86'99"n67°09'76"e、jc524°89'46"n67°07'64"e)。其中16種pahs含量由該地球化學所分析提供。

3.2、樣品處理：采用quechers方法對土樣中的pahs進行提取。在50ml玻璃離心管中加入4g電子垃圾樣品、4gmgso4和1gnacl，然后加入10ml提取溶劑(按體積計，二氯甲烷：己烷＝1:1)。漩渦振蕩混勻，室溫放置過夜。次日，漩渦振蕩15min，超聲2min，重復兩次。2500rpm離心5min，吸取上清液至30ml玻璃離心管中，加入150mg硫酸鎂和25mgpsa。漩渦振蕩2min，2500rpm離心5min。吸取上清液5ml到8ml棕色樣品瓶中，氮吹儀吹干，加入1mldmso漩渦振蕩重新溶解，振蕩時注意轉(zhuǎn)速，避免將液體振蕩到蓋子上。

3.3、樣品提取液暴露轉(zhuǎn)基因熒光斑馬魚胚胎：按步驟1中方法收集轉(zhuǎn)基因熒光斑馬魚胚胎，采用90mm玻璃培養(yǎng)皿進行暴露，每個培養(yǎng)皿中加入50顆胚胎、30ml去離子水，并加入30μl上述步驟3.2中電子垃圾樣品提取液，對照組加30μldmso，倒八字混勻，置于28℃生化恒溫培養(yǎng)箱中暴露60h，每個樣品三個平行。暴露結(jié)束用nikon熒光體式顯微鏡對暴露幼魚進行熒光觀察，并進行熒光強度測定。

4、轉(zhuǎn)基因熒光斑馬魚檢測結(jié)果分析

4.1、化學標準品檢測驗證

利用不同梯度tcdd暴露轉(zhuǎn)基因熒光斑馬魚結(jié)果如圖3所示，斑馬魚熒光強度隨暴露濃度的增加而增加，具有明顯的濃度依賴效應。圖4中pahs暴露結(jié)果顯示，萘和菲無明顯的誘導效果，苯并苝有誘導效果但不是很明顯；苯并芘誘導效果最為明顯，可見腹部熒光明顯增強，苯并蒽熒光誘導效果次之。

4.2、電子垃圾掩埋點附近土樣浸提液暴露結(jié)果

圖5顯示為各土樣提取液的暴露結(jié)果圖，nc是指沒有暴露的對照組結(jié)果圖；圖6顯示為各土樣提取液暴露的斑馬魚熒光強度圖，c是指沒有暴露的斑馬魚熒光強度圖。

如圖7所示為各土樣的pahs含量圖，三個地區(qū)中，采自lyari的土樣pahs含量最高，其熒光誘導效果也最明顯。熒光強度和樣品中pahs含量總體趨勢一致。但樣品中成分相對比較復雜，不能達到一一對應的效果。

三個地區(qū)土樣中pahs含量數(shù)據(jù)如下表1所示：

表1

綜上所述，本發(fā)明針對目前傳統(tǒng)水環(huán)境持久性有機污染物(pops)檢測方法繁瑣，且需昂貴的儀器及專業(yè)的技術(shù)人員，不能實現(xiàn)對環(huán)境pops進行有效的檢測等缺陷，本發(fā)明利用pcr技術(shù)原理，從魚的自身獲得對pops敏感的cyp1a基因啟動子，并構(gòu)建攜帶iscei大范圍核酸酶轉(zhuǎn)移系統(tǒng)和熒光蛋白的pi-scei-cyp1apromoter-mcherry質(zhì)粒，最后通過顯微注射技術(shù)，獲得可以對水體中pops進行簡單、高效、直觀監(jiān)測的轉(zhuǎn)熒光斑馬魚。因此，與傳統(tǒng)的pops檢測手段相比，本發(fā)明提供了一種方便快捷的生物檢測手段，對實現(xiàn)pops實時監(jiān)測有重要的推動作用。

上述實施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟悉此技術(shù)的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對上述實施例進行修飾或改變。因此，舉凡所屬技術(shù)領域中具有通常知識者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)思想下所完成的一切等效修飾或改變，仍應由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。

sequencelisting

<110>中國科學院重慶綠色智能技術(shù)研究院

<120>高靈敏監(jiān)測pops的轉(zhuǎn)熒光蛋白基因魚的制作與應用

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