蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子RHcyst-1及其基因和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子，該半胱氨酸蛋白酶抑制分子為鐮形扇頭蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子RHcyst-1。本發(fā)明還公開了鐮形扇頭蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子RHcyst-1基因，包含編碼SEQ?ID?NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。本發(fā)明鐮形扇頭蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子RHcyst-1，具有顯著的半胱氨酸蛋白酶抑制活性和抗弓形蟲感染能力，適于制備抗寄生蟲藥物。
【專利說明】蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子RHcyst-1及其基因和應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物工程【技術領域】，尤其涉及一種蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子及其基因和應用。
【背景技術】
[0002]半胱氨酸蛋白酶在寄生蟲生理代謝上具有重要功能，被認為是一個有前途的抗寄生蟲藥物靶標?；瘜W類半胱氨酸蛋白酶抑制劑已有應用于治療錐蟲和瘧原蟲的報道。生物體內(nèi)也存在與化學類抑制劑功能相似的抑制分子，它們與半胱氨酸蛋白酶產(chǎn)生可逆的緊密結(jié)合并高效抑制酶活性，被稱為半胱氨酸蛋白酶抑制分子(cystatin)。研究發(fā)現(xiàn)，蜱體內(nèi)的半胱氨酸蛋白酶抑制分子十分豐富，由于其對半胱氨酸蛋白酶普遍有較好的抑制活性，可能具有開發(fā)為抗寄生蟲藥物的價值。此外，研究發(fā)現(xiàn)，人源半胱氨酸蛋白酶抑制分子cystatin C和cystatin M顯示抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移的作用，表明這類生物分子還具有潛在的抗癌藥物開發(fā)潛力。
[0003]蜱，俗稱蜱蟲，是一種常見的動物體表寄生蟲，也經(jīng)常叮咬人，并傳播疾病。鐮形扇頭蝶(Rhipicephalus haemaphysaloide)分布于東南亞和我國南方，是我國優(yōu)勢蝶種,在牛、羊、犬、豬以及野兔等野生動物體表寄生吸血，也侵襲人。到目前為止，國內(nèi)外尚沒有鐮形扇頭蜱體內(nèi)半胱氨酸蛋白酶抑制分子的研究報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子及其基因，該半胱氨酸蛋白酶抑制分子為鐮形扇頭蝶半胱氨酸蛋白酶抑制分子RHcyst-1,可用于制備抗寄生蟲的藥物。
[0005]此外，還需要提供一種蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子在制備抗寄生蟲藥物中的應用。
[0006]為了解決上述技術問題，本發(fā)明通過如下技術方案實現(xiàn):
[0007]在本發(fā)明的一個方面，提供了一種蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子，所述半胱氨酸蛋白酶抑制分子為鐮形扇頭蝶半胱氨酸蛋白酶抑制分子RHcyst-1,其氨基酸序列選自:
[0008](1)SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列；
[0009](2) SEQ ID N0.1所示氨基酸序列中缺失、添加、插入或取代一個或多個氨基酸所得到的具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性，且與SEQ ID N0.1具有95%以上同源性的氨基酸序列。
[0010]優(yōu)選的，所述鐮形扇頭蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子RHcyst-1的氨基酸序列如SEQID N0.1 所示。
[0011]在本發(fā)明的另一方面，提供了一種蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子基因，所述基因為鐮形扇頭蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子RHcyst-1基因，包含:編碼SEQ ID N0.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。[0012]優(yōu)選的，所述RHcyst-1基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0013]在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種包含上述鐮形扇頭蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子RHcyst-1基因的重組載體。
[0014]所述重組載體包括重組克隆載體或重組表達載體。
[0015]在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種包含上述重組載體的宿主細胞。
[0016]在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子重組蛋白的制備方法，包括以下步驟:
[0017]構(gòu)建含鐮形扇頭蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子RHcyst-1基因的重組表達載體，該RHcyst-1基因包含編碼SEQ ID N0.1所示氨基酸序列的核苷酸序列；
[0018]將所述重組表達載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌宿主細胞；
[0019]培養(yǎng)包含重組表達載體的大腸桿菌宿主細胞，并在合適條件下，誘導該重組表達載體表達鐮形扇頭蝶半胱氨酸蛋白酶抑制分子RHcyst-1重組蛋白。
[0020]在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種上述蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子在制備抗寄生蟲藥物中的應用。 [0021]所述寄生蟲包括弓形蟲、錐蟲、或瘧原蟲。優(yōu)選的，所述抗寄生蟲藥物為抗弓形蟲藥物。
[0022]在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種上述蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子在制備半胱氨酸蛋白酶抑制劑中的應用。
[0023]本發(fā)明鐮形扇頭蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子，由酶的抑制試驗表明具有顯著的半胱氨酸蛋白酶抑制活性，經(jīng)抗弓形蟲感染試驗證明具有一定的抗弓形蟲感染能力，適于制備抗寄生蟲藥物和半胱氨酸蛋白酶抑制劑。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步詳細的說明。
[0025]圖1是本發(fā)明實施例1的RHcyst-1保守片段的擴增結(jié)果圖；
[0026]圖2是本發(fā)明實施例1的RHcyst-1的3’ RACE第一輪(A)和第二輪(B)PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果圖；
[0027]圖3是本發(fā)明實施例1的RHcyst-1的5’ RACE第一輪(A)和第二輪(B)PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果圖；
[0028]圖4是本發(fā)明實施例1的RHcyst-1全長基因PCR擴增電泳結(jié)果圖；
[0029]圖5是本發(fā)明實施例1的RHcyst-1與三個已知硬蝶家族Icystatin的氨基酸序列比對圖；
[0030]圖6是本發(fā)明實施例2的RHcyst-l/pGEX-4T-l重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定圖；
[0031]圖7是本發(fā)明實施例2的RHcyst-1重組蛋白誘導表達的SDS-PAGE電泳圖；
[0032]圖8是本發(fā)明實施例2的RHcyst-1重組蛋白純化后的SDS-PAGE電泳圖；
[0033]圖9是本發(fā)明實施例2的BCA標準曲線圖；
[0034]圖10是本發(fā)明實施例3的RHcyst-1酶活抑制曲線圖；
[0035]圖11是本發(fā)明實施例4弓形蟲感染小鼠的RHcyst-1治療試驗結(jié)果圖。【具體實施方式】
[0036]下列實施例中，未注明具體條件的實驗方法，通常按常規(guī)條件，如《分子克隆實驗指南》(J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾著，黃培堂，汪嘉璽，朱厚礎，等譯.第3版，北京:科學出版社，2002)中所述的方法進行。
[0037]本發(fā)明首次從鐮形扇頭蜱體內(nèi)獲得一個新的半胱氨酸蛋白酶抑制分子，命名為RHcyst-1 (鐮形扇頭蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子)，將其基因編碼區(qū)克隆到表達載體，在大腸桿菌中進行重組表達，由酶的抑制試驗表明本發(fā)明的RHcyst-1重組蛋白能對六種半胱氨酸蛋白酶產(chǎn)生有效的抑制作用，通過抗弓形蟲感染試驗證明本發(fā)明的RHcyst-1重組蛋白具有一定的抗弓形蟲感染能力。
[0038]實施例1鐮形扇頭蝶半胱氨酸蛋白酶抑制分子RHcyst-1的基因克隆和序列分析
[0039]1.半飽血鐮形扇頭蜱雌蜱總RNA的提取
[0040]將鐮形扇頭蜱按雌雄2: I的比例接種于兔耳上，4天后從兔耳上取下半飽血的雌蜱。在經(jīng)滅菌處理的研缽上用液氮進行研磨，后加入1ml的Trizol試劑充分研磨后轉(zhuǎn)移至一個無核酸酶的EP管中。用經(jīng)典Trizol法提取獲得的4只鐮形扇頭蜱半飽血雌蜱的總RNA，濃度為11.3ug/ul，0D260/0D280數(shù)值為1.942，在濃度和純度上都能滿足后續(xù)實驗的要求。
[0041]2.保守片段的擴增
[0042]2.1引物設計
[0043]對已知的幾個與鐮形扇頭蝶近親緣蝶種的家族Icystatin分子的核苷酸序列和氨基酸序列進行分析，以微小牛蜱的一個家族lcystatin(登錄號:DQ646915)為參照，在幾個蝶種的家族Icystatin的保守區(qū)域設計引物。
[0044]家族Icystatin保守區(qū)引物設計如下:
[0045]上游:5，-AAGGATGCCGATGACACAGTC-3，(SEQID N0.3)；
[0046]下游:5，-CCCTGGAAAGCCTTGTGCGC-3，(SEQID N0.4)。
[0047]2.2保守片段的擴增
[0048]將上述提取的總RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara)反轉(zhuǎn)為cDNA，并以該cDNA為模板，用上面設計的引物進行PCR反應，反應條件為:94°C 3分鐘；再940C 30秒，48°C 30秒及720C 40秒，進行35個循環(huán)；最后72°C 7分鐘。結(jié)果見圖1，擴增出來的RHcyst-1保守片段長度為197bp。
[0049]2.3保守片段的克隆測序
[0050]PCR擴增后的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠跑電泳后，用膠回收試劑盒(Axygen)對膠塊中的DNA片段進行回收純化，將純化DNA與PMD-18T載體連接，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞DH5 α中，在含有Amp抗性的瓊脂糖培養(yǎng)基上挑選單菌落，通過PCR鑒定其插入片段大小。在確定T載體插入片段大小無誤后，將菌株送至測序公司(上海Invitrogen公司)測序。
[0051]上述TA克隆測序得到RHcyst-1保守片段的序列(SEQ ID N0.5)，經(jīng)NCBI BLAST分析發(fā)現(xiàn)其與微小牛蜱的家族Icystatin(登錄號:DQ646915)具有92%的同源性。
[0052]3.3’端快速擴增
[0053]3.1引物設計
[0054]對于鐮形扇頭蜱的家族Icystatin分子，利用上述得到的保守區(qū)域的核苷酸序列進行3’端快速擴增的引物設計。
[0055]家族I的3’ RACE引物:
[0056]RHcyst-1-3R-GSPl:5’ -CAGGGAGATTTGCGAAAAGG-3’ (SEQ ID N0.6)；
[0057]RHcyst-1-3R-GSP2:5，-CGCCGAAGTGGAGACGAAGC-3，(SEQ ID N0.7)。
[0058]3.2cDNA第一鏈的合成
[0059]按cDNA 末端快速擴增的 3 ' RACE 系統(tǒng)(3' RACE System for Rapid Amplifixation of cDNA Ends, Invitrogen)的操作說明，將上述步驟I提取的總RNA與一個包含多聚胸腺嘧啶核苷酸(Oligo dT)的錨定引物(AP)在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下反轉(zhuǎn)生成cDNA與RNA雜交鏈，而后雜交鏈在RNA酶的作用下形成cDNA單鏈。
[0060]3.33’端的擴增
[0061]按操作說明對目的基因的3’端進行擴增，以3.2合成的cDNA第一鏈為模板，上游引物是3.1中所設計的基因特異性引物(GSP)，下游引物是能夠與錨定引物(AP)帶入的錨定序列互補配對的AUAP引物。
[0062]RHcyst-1 第一輪 PCR 反應條件:94°C 3 分鐘；再 94°C 30 秒，53°C 30 秒及 72°C 45秒，進行35個循環(huán)；最后72 °C 7分鐘。
[0063]RHcyst-1 第 二輪 PCR 反應條件:94°C 3 分鐘；再 94°C 30 秒，55°C 30 秒及 72°C 45秒，進行35個循環(huán)；最后72 °C 7分鐘。
[0064]結(jié)果:運用3’端快速擴增方法經(jīng)兩輪PCR，可以得到RHcyst-1的一個大約300bp左右的3’端片段(見圖2)。
[0065]3.43’端片段的克隆測序
[0066]方法同2.3。TA克隆測序得到RHcyst-1的3，端片段的序列(SEQ ID N0.8)。
[0067]4.5’端快速擴增
[0068]4.1引物設計
[0069]利用已經(jīng)得到的RHcyst-1的3’端核苷酸序列設計5’端快速擴增的基因特異性引物。
[0070]RHcyst-1-5R-GSPl:5，-CGTGGATGTGCTGGTTATTAC-3，(SEQ ID N0.9)；
[0071]RHcyst-1-5R-GSP2:5’ -CCTTTACAAAATAGTTGATGCCG-3’ (SEQ ID N0.10)。
[0072]4.2cDNA第一鏈的合成
[0073]按cDNA 末端快速擴增的 5 ' RACE 系統(tǒng)(5 ' RACE System for RapidAmplification of cDNA Ends, Invitrogen)的操作說明，將上述步驟I中提取的總RNA與
4.1設計的基因特異性引物(GSPl)在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下反轉(zhuǎn)生成cDNA與RNA雜交鏈，而后雜交鏈在RNA酶的作用下形成cDNA單鏈。
[0074]4.3cDNA第一鏈的純化
[0075]按cDNA末端快速擴增的5' RACE系統(tǒng)(Invitrogen)中關于cDNA第一鏈純化的操作說明對cDNA第一鏈進行純化。
[0076]4.4cDNA 的加尾
[0077]按cDNA末端快速擴增的5, RACE系統(tǒng)(Invitrogen)的操作說明，將4.3純化的cDNA與dCTP在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)的作用下，在cDNA的5’末端加上多聚胞嘧啶核苷酸(Oligo dC)的尾巴。[0078]4.55’端的擴增
[0079]按操作說明對目的基因的5’端進行擴增，為了提高目的基因的特異性和產(chǎn)量采用嵌套式PCR的方式進行擴增。第一輪PCR是以4.4加尾的cDNA為模板，上游引物是一個包含多聚鳥嘌呤核苷酸(Oligo dG)的錨定引物(AAP)，下游引物是4.1中根據(jù)3’端序列所設計的基因特異性引物(GSP2)。嵌套式第二輪PCR是以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，上游引物是能與錨定引物(AAP)帶入的錨定序列互補配對的AUAP引物，下游引物還是基因特異性引物(GSP2)。
[0080]RHcyst-1 第一輪 PCR 反應條件:94°C 3 分鐘；再 94°C 30 秒，50°C 30 秒及 72°C 45秒，進行35個循環(huán)；最后72 °C 7分鐘。
[0081]RHcyst-1 第二輪 PCR 反應條件:94°C 3 分鐘；再 94°C 30 秒，51 °C 30 秒及 72°C 45秒，進行35個循環(huán)；最后72 °C 7分鐘。
[0082]結(jié)果:運 用5’端快速擴增方法經(jīng)兩輪PCR，可以得到RHcyst-1的一個大約270bp左右的5’端片段(見圖3)。
[0083]4.65’端片段的克隆測序
[0084]方法同2.3。TA克隆測序得到RHcyst-1的5，端片段的序列(SEQ ID N0.11)。
[0085]5.全長基因的擴增
[0086]5.1引物設計
[0087]通過對目的基因的3’端和5’端序列的拼接可以得到全長基因的序列，在序列的5’末端設計上游引物以便于從3.2中合成的cDNA中擴增出全長基因。
[0088]RHcyst-1:5，-GTAGCAGCGCGCGCGATTAGT-3，(SEQ ID N0.12)。
[0089]5.2全長基因擴增
[0090]以3.2合成的3’ RACE cDNA第一鏈為模板，5.1設計的引物為上游引物，AUAP為下游引物，對RHcyst-1的全長進行擴增。
[0091]RHcyst-1PCR 反應條件:94°C 3 分鐘；再 94°C 35 秒，53°C 35 秒及 72°C 45 秒，進行35個循環(huán)；最后72 °C 7分鐘。
[0092]PCR擴增結(jié)果如圖4所示，得到大約500bp左右的RHcyst-1全長基因序列。
[0093]5.3全長基因的克隆測序
[0094]方法同2.3。
[0095]5.4全長基因的序列分析
[0096]應用Genetyx(version7)軟件進行序列比對和預測蛋白分子大小及等電點。
[0097]利用丹麥科技大學(DTU)的CBS服務器進行信號肽(signal peptide)預測，進入Prediction Serves 頁面。網(wǎng)址:http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/
[0098]應用NCBI (美國國家生物技術信息中心)站點的ORF Finder軟件分析基因的ORF, BLAST在線服務分析基因的同源性。網(wǎng)址:http://www.ncb1.nlm.nih.gov/
[0099]應用smart Main page軟件分析基因的功能域。網(wǎng)址:http://smart.embl-heidelberg.de/
[0100]通過對RHcyst-1的全長基因序列進行分析，可以得知:RHcyst_l全長基因為47Ibp (SEQ ID N0.2)，具有一個編碼98個氨基酸的開放閱讀框(SEQ ID N0.1)，沒有信號肽序列。和絕大多數(shù)的家族Icystatin —樣，RHcyst-1具有N端保守甘氨酸和QXVXG保守位點。推測RHcyst-1的蛋白大小約為llkDa，等電點為5.66。RHcyst-1與其它蜱的家族Icystatin具有很高的同源性,與微小牛蝶(Bmcystatin,登錄號:ABG36931)、變異革蝶(DvM602，登錄號:ACF35512)及長角血蜱(Hlcyst-1，登錄號:ABZ89553)的家族 Icystatin氨基酸序列同源性分別為90%、86%和81% (見圖5)。
[0101]實施例2鐮形扇頭蝶半胱氨酸蛋白酶抑制分子RHcyst-1的原核表達與純化
[0102]1.表達質(zhì)粒構(gòu)建
[0103]根據(jù)RHcyst-1全長序列的分析結(jié)果,在RHcyst-1基因ORF兩端設計添加有合適酶切位點的基因特異性引物。引物序列如下:
[0104]RHcyst-1express F:5’ ~CTGAATTCATGCCTCTCTGTGGTGG~3，(SEQ ID NO13)；
[0105]RHcyst-1express R:5，-TCGTCGACTCACTGGAAATGCTCGAG-3，(SEQ ID N0.14)。
[0106]PCR擴增RHcyst-1基因全長編碼區(qū)(SEQ ID N0.1所示序列)，克隆到pGEX_4T_l載體，構(gòu)建表達重組質(zhì)粒RHcyst-l/pGEX-4T-l，經(jīng)雙酶切(Sal I和EcoR I)和測序鑒定目的片段準確插入。圖6為RHcyst-l/pGEX-4T-l重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定圖，由圖6可知RHcyst-1目的片段插入準確。
[0107]2.重組蛋白表達形式分析
[0108]2.1IPTG的誘導表達
[0109]將構(gòu)建的RHcyst-l/pGEX-4T_l重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21 (DE3)感受態(tài)細胞中，通過PCR的方法篩選出陽性株。再將轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒的BL21(DE3)陽性菌株接種至兩個裝有20mlLB培養(yǎng)基(Amp抗性)的50ml離心管中，37°C 200轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)大約2h。測定菌液0D600數(shù)值，在數(shù)值達到0.4到0.6之間時，接種轉(zhuǎn)化RHcyst-1重組質(zhì)粒的菌液加入20ullM IPTG，另外一管不加作為未誘導對照。然后將表達RHcyst-1重組蛋白的培養(yǎng)液37°C下200轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)8h。最后4°C下10000rpm5min離心,去上清收集菌體。
[0110]2.2SDS-PAGE鑒定重組蛋白
[0111]超聲裂解菌體收集上清和沉淀，用常規(guī)的12% SDS-PAGE電泳分析蛋白的表達情況，結(jié)果如圖7所示，RHcyst-1重組蛋白主要以上清表達為主，在圖7中，1:未誘導菌體裂解沉淀；2:誘導菌體裂解沉淀；3:未誘導菌體裂解上清；4:誘導菌體裂解上清。
[0112]3.蛋白純化及定量
[0113]3.1蛋白純化
[0114]表達的RHcyst-1重組蛋白帶有GST標簽，可用GST樹脂對其進行純化。純化的蛋白液裝入經(jīng)去離子水煮沸處理的透析袋中，兩頭用透析袋夾夾緊，浸沒于IL PBS緩沖液中，4°C透析12h，然后更換PBS緩沖液再透析12h。經(jīng)透析處理蛋白液進行SDS-PAGE電泳鑒定蛋白大小和純度。結(jié)果見圖8，在圖8中，1:未誘導菌體裂解上清；2:誘導菌體裂解上清；3和4:純化的RHcyst-1重組蛋白。
[0115]3.2蛋白定量
[0116]根據(jù)BCA蛋白濃度測定試劑盒(BCA Protein AssayKit, Piarca)操作說明對RHcyst-1重組蛋白進行定量,具體步驟如下:
[0117]①將A液和B液按50:1的比列配制成反應液。
[0118] ②取25ul待測樣品和各種梯度的標準蛋白滴加在ELISA板孔中，每個樣品作一復孔。[0119]③ 用8道移液器向每孔加入200ul的反應液，振蕩混勻。
[0120]④蓋上ELISA板上蓋，37°C反應30min。
[0121]⑤用酶標儀測定562nm波長的OD值。
[0122]⑥根據(jù)各種梯度的標準蛋白所測OD值，制成標準曲線，輸出函數(shù)關系式，輸入待測樣品的OD值，求得待測樣品的濃度。
[0123]標準曲線如圖9所示，根據(jù)該標準曲線及其導出的函數(shù)關系式，計算得到純化的RHcyst-1重組蛋白濃度為1823ug/ml。
[0124]實施例3重組蛋白rRHcyst-Ι的酶活性分析實驗
[0125]1.方法:通過測定與成此75^-1作用后組織蛋白酶1^8、(:、!1、5、木瓜蛋白酶和其對應突光底物反應的剩余活性來驗證rRHcyst-Ι對木瓜蛋白酶樣半胱氨酸蛋白酶的抑制活性。具體方法如下:
[0126](I)按 IOOmM NaACUOOmM NaCl、ImM EDTAUmg/ml 半胱氨酸和 0.005 %TritonX-1OO的配方配制半胱氨酸蛋白酶反應液,調(diào)節(jié)pH至5.5。
[0127](2)用半胱氨酸蛋白酶反應液將六種半胱氨酸蛋白酶配制成1.5uM，將它們的對應熒光底物配制成0.5mM。
[0128](3)用 PBS 將純化好的 RHcyst-1 重組蛋白配制成 12uM、6uM、3uM、1.5uM、0.75uM、
0.375uM和OuM的濃度梯度。
[0129](4)在96孔黑色微孔板中依次加入七個濃度梯度的RHcyst-1重組蛋白20ul (每個濃度做3個重復孔)，然后分別加入20ul的1.5uM待測的半胱氨酸蛋白酶，送至恒溫箱37°C 反應 30min。
[0130](5)避光條件下向每孔加入IOOul的對應突光底物，補加60ul反應液，添加一個只加IOOul反應液和IOOul底物液的孔作為背景，37°C反應15min，送至酶標儀在激發(fā)波長(入ex) 360nm和發(fā)射波長(λ em) 460nm的條件下檢測每孔OD值。
[0131](6)各組OD數(shù)值均減去背景孔的OD值，用各個濃度組的OD值除于rRHcyst-Ι的OuM的OD值計算半胱氨酸蛋白酶的剩余活性，以此繪制RHcyst-1酶活抑制曲線。
[0132]2.結(jié)果:RHcyst_l的酶活抑制曲線如圖10所示，由圖10可知,rRHcyst-Ι能對六種半胱氨酸蛋白酶產(chǎn)生有效的抑制并呈現(xiàn)顯著的濃度依賴關系，但抑制效果不盡相同，其中對組織蛋白酶S的抑制活性最高，在0.25倍摩爾濃度的情況下就能對其酶活性達到90%以上的抑制。
[0133]實施例4重組蛋白rRHcyst-Ι的抗弓形蟲感染實驗
[0134](I)試驗動物為昆明系小鼠，25克左右體重，雄性。弓形蟲為國際標準株RH株，小鼠感染后收集腹水采集蟲體。
[0135](2)RHcyst-1重組蛋白溶解在PBS緩沖液中，試驗分為高劑量組(200ug/只)、中劑量組(IOOug/只)、低劑量組(50ug/只)、蛋白對照組(GST蛋白)和空白對照組(PBS)，每組20只試驗用鼠，每只鼠腹腔接種10000條弓形蟲。重組蛋白分別在感染弓形蟲后的第2天和第4天經(jīng)腹腔注射進行治療，然后觀察小鼠死亡率和死亡時間，組間平均死亡時間經(jīng)t檢驗分析差異顯著性來評估療效有無。
[0136]弓形蟲感染的小鼠模型是弓形蟲研究和藥效評價的常用模型，考慮到蛋白代謝特征，本試驗在感染后第2天和第4天進行連續(xù)給藥，以各組小鼠死亡率和死亡時間評價藥效。RHcyst-1重組蛋白治療結(jié)果見圖11，各劑量組和對照組小鼠均在15天內(nèi)全部死亡，死亡率100%;但死亡時間在5-15天之間不等，GST蛋白對照組與不治療空白對照組間無顯著差異(平均死亡時間分別為6.5天和6.4天)，但對照組與重組蛋白治療組間小鼠存活時間長度存在顯著差異(50ug/只組、IOOug/只組、200ug/只組，平均死亡時間分別為8.5天、
9.9天和8.9天)，表明重組RHcyst-1顯著延長小鼠存活時間，具有一定抗弓形蟲感染的能力。
[0137]以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。
[0138]序列表
[0139]〈110〉中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所
[0140]〈120〉蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子RHcyst-1及其基因和應用
[0141]<160>14
[0142]<170>PatentIn version3.3
[0143]<210>1
[0144]<211>98
[0145]<212>PRT
[0146]<213>Rhipicephalus haemaphysaloide
[0147]<400>1
[0148]Met Pro Leu Cys Gly Gly Leu Ser Glu Glu Val Lys Asp Ala Asp Asp
[0149]I51015
[0150]Thr Val Arg Glu He Cys Glu Lys Val Arg Ala Glu Val Glu Thr Lys
[0151]202530
[0152]Leu Gly Lys Cys Phe Pro Glu Phe Thr Pro Leu Lys Tyr Arg Thr Gln
[0153]354045
[0154]Leu Val Asn Gly He Asn Tyr Phe Val Lys Val His Val Gly Asn Asn
[0155]505560
[0156]Gln His He His Val Arg Ala His Lys Ala Phe Gln Gly Glu He Ser
[0157]65707580
[0158]Phe Ser Ala Val Gln Glu Glu Lys Thr Leu Glu Asp Pro Leu Glu His
[0159]859095
[0160]Phe Gln
[0161]<210>2
[0162]〈211M71
[0163]<212>DNA
[0164]<213>Rhipicephalus haemaphysaloide
[0165]〈220〉
[0166]<221>CDS
【權利要求】
1.一種蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子，其特征在于，所述半胱氨酸蛋白酶抑制分子為鐮形扇頭蝶半胱氨酸蛋白酶抑制分子RHcyst-1,其氨基酸序列選自: (1)SEQID N0.1所示的氨基酸序列； (2)SEQ ID N0.1所示氨基酸序列中缺失、添加、插入或取代一個或多個氨基酸所得到的具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性，且與SEQ ID N0.1具有95%以上同源性的氨基酸序列。
2.根據(jù)權利要求1所述的蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子，其特征在于，所述鐮形扇頭蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子RHcyst-1的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
3.—種蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子基因，其特征在于，所述基因為鐮形扇頭蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子RHcyst-1基因，包含:編碼SEQ ID N0.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。
4.根據(jù)權利要求3所述的蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子基因，其特征在于，所述RHcyst-1基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
5.一種重組載體，其特征在于，包含權利要求3所述的鐮形扇頭蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子RHcyst-1基因。
6.一種宿主細胞，其特征在于，包含權利要求5所述的重組載體。
7.—種蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子重組蛋白的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 構(gòu)建含鐮形扇頭蝶半胱氨酸蛋白酶抑制分子RHcyst-1基因的重組表達載體，該RHcyst-1基因包含編碼SEQ ID N0.1所示氨基酸序列的核苷酸序列； 將所述重組表達載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌宿主細胞； 培養(yǎng)包含重組表達載體的大腸桿菌宿主細胞，并在合適條件下，誘導該重組表達載體表達鐮形扇頭蝶半胱氨酸蛋白酶抑制分子RHcyst-1重組蛋白。
8.根據(jù)權利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述RHcyst-1基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.2 所示。
9.權利要求1所述的蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子在制備抗寄生蟲藥物中的應用。
10.權利要求1所述的蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子在制備半胱氨酸蛋白酶抑制劑中的應用。
【文檔編號】C12N15/63GK103965351SQ201310044561
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2013年2月4日 優(yōu)先權日:2013年2月4日
【發(fā)明者】周金林, 王玉儉, 周勇志, 曹杰, 張厚雙, 龔海燕 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所