一種豬丹毒活疫苗的生產(chǎn)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及合成培養(yǎng)基及凍干保護(hù)劑在豬丹毒活疫苗生產(chǎn)中的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的合成培養(yǎng)基根據(jù)豬丹毒桿菌的生長特點(diǎn)和生長需求設(shè)計(jì)而成，配方原材料來源可控，不受牛肉、牛肝和豬胃等材料的影響，批次穩(wěn)定、制作簡單、使用方便，適合進(jìn)行細(xì)菌高細(xì)胞密度培養(yǎng)，培養(yǎng)菌數(shù)高；凍干過程采用針對(duì)豬丹毒桿菌特性研制的凍干保護(hù)劑及配套凍干曲線，在凍干過程中有效保護(hù)細(xì)菌的活性，提高凍干菌存率，實(shí)現(xiàn)疫苗2～8℃長期保存，保存期可達(dá)24個(gè)月。
【專利說明】一種豬丹毒活疫苗的生產(chǎn)方法
[0001]

【技術(shù)領(lǐng)域】本發(fā)明涉及一種豬丹毒活疫苗的生產(chǎn)方法，屬于生物學(xué)領(lǐng)域，特別是 獸用生物制品領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 豬丹毒是豬的三大傳染病之一，呈世界性分布，也是一種人畜共患病，其病原是豬 丹毒桿菌。目前我國現(xiàn)有的豬丹毒活疫苗，有單苗、二聯(lián)苗和三聯(lián)苗，他們對(duì)預(yù)防豬丹毒病 起到了重要的作用。但目前在菌液培養(yǎng)及凍干工藝上存在以下突出問題，與發(fā)達(dá)國家差距 大。（1)培養(yǎng)穩(wěn)定性差。60?70年代，生產(chǎn)疫苗采用含2%?4%裂解全血的肉肝胃（膜） 消化湯作為培養(yǎng)基，至80年代后至今，國內(nèi)獸用生物制品企業(yè)開始采用吐溫-80替代裂解 血球全血生產(chǎn)豬丹毒活疫苗，使培養(yǎng)活菌數(shù)平均提高40%，雖然在培養(yǎng)工藝上擺脫了對(duì)動(dòng) 物血的依賴。但肉肝胃（膜）消化湯主要成分肉、肝、胃浸液的質(zhì)量受動(dòng)物的種類、年齡、新 鮮及消化程度影響大，培養(yǎng)菌數(shù)低，批次間不穩(wěn)定。（2)疫苗凍干一直采用1. 5%明膠5%蔗 糖為保護(hù)劑，該保護(hù)劑為細(xì)菌類活疫苗通用保護(hù)劑，組方簡單，凍干存活率低，保護(hù)功能較 差（尤其在較高溫度下）。一般需要_15°C以下保存，低溫保存給邊遠(yuǎn)地區(qū)儲(chǔ)運(yùn)和使用帶來 困難。
[0003] 合成培養(yǎng)基按照細(xì)菌營養(yǎng)代謝特點(diǎn)設(shè)計(jì)，添加促進(jìn)菌體增殖、提高保護(hù)性抗原表 達(dá)的生長因子，具有培養(yǎng)菌數(shù)高、批次間質(zhì)量穩(wěn)定、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)；耐熱保護(hù)劑根據(jù)細(xì)菌 細(xì)胞膜與保護(hù)劑相容性特點(diǎn)設(shè)計(jì)，具有凍干存活率高，耐老化性能好特點(diǎn)，使疫苗在2? 8°C長期保存，更易于長途運(yùn)輸。有鑒于此，本發(fā)明目的在于研制一種適合豬丹毒桿菌生長、 成分相對(duì)確定、易于在線檢測(cè)、監(jiān)控和及時(shí)調(diào)整的合成培養(yǎng)基和一套適合豬丹毒桿菌凍干 的保護(hù)劑及其配套凍干工藝制備豬丹毒活疫苗。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 合成培養(yǎng)基按照細(xì)菌營養(yǎng)代謝特點(diǎn)設(shè)計(jì)，添加促進(jìn)菌體增殖、提高保護(hù)性抗原表 達(dá)的生長因子，具有培養(yǎng)菌數(shù)高、批次間質(zhì)量穩(wěn)定、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)；耐熱保護(hù)劑根據(jù)細(xì)菌 細(xì)胞膜與保護(hù)劑相容性特點(diǎn)設(shè)計(jì)，具有凍干存活率高，耐老化性能好特點(diǎn)，使疫苗在2? 8°C長期保存，更易于長途運(yùn)輸。，本發(fā)明目的在于研制一種適合豬丹毒桿菌生長、成分相對(duì) 確定、易于在線檢測(cè)、監(jiān)控和及時(shí)調(diào)整的合成培養(yǎng)基和一套適合豬丹毒桿菌凍干的耐熱保 護(hù)劑及其配套凍干工藝制備豬丹毒耐熱保護(hù)劑活疫苗。
[0005] 實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案為：
[0006] 1. -種豬丹毒活疫苗的生產(chǎn)方法，其特征是：
[0007] (1)生產(chǎn)菌種為豬丹毒桿菌CVCC1318株；
[0008] (2)所使用合成培養(yǎng)基的配方（W/V)是：大豆胨10g、蛋白胨20g、酵母粉20g、磷酸 氫二鉀0. 675g、磷酸二氫鉀0. 1632g、硫酸鎂0. 2g、葡萄糖5g、L-Arg-HCl 5g、色氨酸lg、吐 溫-800. 5ml、注射用水加至1000ml ;
[0009] (3)所使用耐熱保護(hù)劑的最佳配方（W/V)是：右旋糖苷10g，BSA lg，甘露醇50g， 海藻糖50g，水解乳蛋白5g，L-谷氨酸鈉5g，磷酸氫二鉀I. 25g，磷酸二氫鉀0. 52g，注射用 水加至IOOOml ;
[0010] (4)該方法所生產(chǎn)的豬丹毒活疫苗的保藏條件為2?8°C，有效期達(dá)24個(gè)月。
[0011] 2.本發(fā)明所述一種豬丹毒活疫苗的生產(chǎn)方法，其中豬丹毒活疫苗生產(chǎn)菌種也可以 為豬丹毒桿菌CVCC1319株。
[0012] 本發(fā)明的詳細(xì)描述
[0013] 一、疫苗生產(chǎn)用菌種
[0014] L 豬丹毒桿菌（Erysipelothrix rhusiopathiae)CVCC1318 株菌種即 GC42 株，由 哈爾濱獸醫(yī)研究所鑒定、保管和供應(yīng)。弱毒株，由強(qiáng)毒G370株致弱而成，該菌種皮下注射 500X IO8CFU活菌不致死豬，IX IO7CFU活菌免疫小鼠可產(chǎn)生80%保護(hù)。血清型為Ia型。
[0015] 2.豬丹毒桿菌（Erysipelothrix rhusiopathiae) CVCC1319 株菌種即 G4T10 株， 江蘇農(nóng)科院分離，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保管和供應(yīng)。弱毒株，皮下注射50X IO8? 500X IO8CFU活菌豬100%健活，IX IO7CFU活菌免疫小鼠可產(chǎn)生81. 8%保護(hù)。血清型為Ia 型。
[0016] 二、合成培養(yǎng)基的制備
[0017] 1.本發(fā)明設(shè)計(jì)的合成培養(yǎng)基配方（W/V)如下：
[0018] 大豆胨10g、蛋白胨20g、酵母粉20g、磷酸氫二鉀0. 675g、磷酸二氫鉀0. 1632g、硫 酸鎂0. 2g、葡萄糖5g、L-Arg-HCl 5g、色氨酸lg、吐溫-800. 5ml、注射用水加至1000ml。
[0019] 2.合成培養(yǎng)基配制方法
[0020] 按上述配方依次稱取培養(yǎng)基成分加入到注射用水中，充分溶解后用2mol/L的氫 氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為7. 8?8. 2,116°C滅菌30分鐘。臨用時(shí)，無菌操作加入終濃度0. 5% 的50 %葡萄糖溶液，混勻。
[0021] 50%葡萄糖溶液（W/V)稱取50g葡萄糖，加注射用水溶解，定容至100ml，116°C滅 菌30分鐘，2?8°C保存。
[0022] 2mol/L的氫氧化鈉溶液稱取8g氫氧化鈉，加注射用水溶解，定容至100ml，116°C 滅菌30分鐘，2?8°C保存。
[0023] 3.合成培養(yǎng)基檢驗(yàn)
[0024] (1)性狀溶液澄清透明、呈棕色。
[0025] (2)無菌檢驗(yàn)按中華人民共和國獸藥典（中國獸藥典委員會(huì).中華人民共和國獸 藥典二〇〇五版三部.中國農(nóng)業(yè)出版社，2006,以下稱《中國獸藥典》）規(guī)定的方法進(jìn)行，應(yīng) 無菌生長。
[0026] (3)口!1值應(yīng)為8.0±0.2。
[0027] ⑷生長試驗(yàn)
[0028] 1)生長試驗(yàn)中使用：豬丹毒桿菌CVCC1318株菌種即GC42株，由哈爾濱獸醫(yī)研究 所鑒定、保管和供應(yīng)。弱毒株，由強(qiáng)毒G370株致弱而成，該菌種皮下注射500 X IO8CFU活菌 不致死豬，IxlO7CFU活菌免疫小鼠可產(chǎn)生80%保護(hù)。血清型為Ia型；豬丹毒桿菌CVCC1319 株菌種即G4T10株，江蘇農(nóng)科院分離，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保管和供應(yīng)。弱毒株，皮 下注射50 X IO8?500 X IO8CFU活菌豬100 %健活，IX IO7CFU活菌免疫小鼠可產(chǎn)生81. 8% 保護(hù)。血清型為Ia型。
[0029] 2)種子液制備
[0030] 開啟凍干的豬丹毒桿菌CVCC1318株和CVCC1319株各1支，分別用LOml的馬丁 肉湯稀釋，接種明膠平板，置15?18°C培養(yǎng)3?5日，各選取合格的菌落5?10個(gè)，混合于 少量肉肝胃膜消化湯中，再劃線接種于馬丁瓊脂平板上，置36?37°C培養(yǎng)24?36小時(shí)， 分別選取中等大小光滑型菌落5?10個(gè)，混合于少量肉肝胃膜消化湯中，再接種含5%綿 羊脫纖血的馬丁瓊脂斜面5?10支，置36?37°C培養(yǎng)24小時(shí)，純粹檢驗(yàn)合格后作為一級(jí) 種子，在2?8°C保存，應(yīng)不超過1個(gè)月。取一級(jí)種子接種肉肝胃膜消化湯，36?37°C培養(yǎng) 20?22h，純粹檢查合格后，作為種子液（中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.中華人民共和國獸用生 物制品規(guī)程二〇〇〇年版.化學(xué)工業(yè)出版社，2001，以下稱《規(guī)程》）。
[0031] 3)菌液培養(yǎng)及判定下列方法任選其一種：
[0032] ①將種子液按2%接種裝有IOml液體培養(yǎng)基1管，37°C、150r/min振蕩培養(yǎng)13? 15小時(shí)，同時(shí)各設(shè)1管不接種陰性對(duì)照。分別取樣按現(xiàn)行《中國獸藥典》規(guī)定的方法進(jìn)行活 菌計(jì)數(shù)。菌數(shù)應(yīng)不低于100X l〇8CFU/ml，且陰性對(duì)照應(yīng)無菌生長。
[0033] ②將種子液按2 %接種裝有200ml液體培養(yǎng)基的500ml三角瓶1個(gè)，37°C、150r/ min振蕩培養(yǎng)13?15小時(shí)，同時(shí)設(shè)1個(gè)不接種陰性對(duì)照。分別取樣按現(xiàn)行《中國獸藥典》 附錄進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。菌數(shù)應(yīng)不低于140X 108CFU/ml，且陰性對(duì)照應(yīng)無菌生長。
[0034] 4)貯藏與有效期配制后的液體合成培養(yǎng)基置于室溫避光保存，有效期為21日。
[0035] 三、凍干保護(hù)劑
[0036] 1.保護(hù)劑的配方
[0037] 右旋糖苷10g，BSA Ig,山梨醇50g，鹿糖50g，水解乳蛋白5g，L_谷氨酸鈉 5g，磷酸 氫二鉀I. 25g，磷酸二氫鉀0. 52g，注射用水1000ml。
[0038] 2.配制方法
[0039] 溶液1:在潔凈燒杯中，加入注射用水（KKTC )適量，按配方依次稱取右旋糖苷、 BSA、山梨醇，加入燒杯中，邊加入邊用玻璃棒攪拌，使其完全溶解，再用注射用水定容至 500ml，經(jīng)116°C滅菌30分鐘。
[0040] 溶液2 :按配方依次稱取蔗糖、水解乳蛋白、L-谷氨酸鈉、磷酸二氫鉀和磷酸氫二 鉀于燒杯中，加入注射用水使其充分溶解后，定容至500ml，0. 22 μ m濾膜的除菌濾器過濾 除囷。
[0041] 配苗前，在無菌條件下，將溶液1和溶液2等體積混勻，即成。
[0042] 四、疫苗制備
[0043] 將豬丹毒桿菌（Erysipelothrix rhusiopathiae) CVCC1318 株（或 CVCC1319 株） 菌種種子液按培養(yǎng)基總量的1%?2%接種于以胰酪蛋白胨、大豆胨和酵母浸出粉為主要 原材料的液體合成培養(yǎng)基中，37°C發(fā)酵或通氣培養(yǎng)8?10小時(shí)，培養(yǎng)過程中根據(jù)需要加 入適量消泡劑，并根據(jù)pH下降情況加入適量2mol/L氫氧化鈉溶液以控制pH值在7. 0以 上。培養(yǎng)結(jié)束后菌液經(jīng)3500r/min離心20min，沉淀加入經(jīng)過滅菌處理并預(yù)熱至37°C的凍 干保護(hù)劑，充分混勻分裝后，真空冷凍干燥而成。CVCC1318株活疫苗每頭份活菌數(shù)不少于 7X IO8CFU, CVCC1319株活疫苗每頭份活菌數(shù)不少于5X 108CFU。
[0044] 半成品檢驗(yàn)
[0045] 純粹檢驗(yàn)取菌液用馬丁瓊脂平板，按《中國獸藥典》（中國獸藥典委員會(huì)）規(guī)定的 方法進(jìn)行，應(yīng)純粹。
[0046] 活菌計(jì)數(shù)取樣用含10%牛血清的馬丁瓊脂平板培養(yǎng)計(jì)活菌數(shù)，按《中國獸藥典》規(guī) 定的方法進(jìn)行，作為計(jì)算凍干活菌率的基數(shù)及配苗時(shí)參考。
[0047] 配苗、分裝、凍干將懸浮菌液充分混勻后，按規(guī)定頭份定量分裝，CVCC1318株活疫 苗每頭份活菌數(shù)不少于10 X IO8CFU, CVCC1319株活疫苗每頭份活菌數(shù)不少于7 X IO8CFU (按 凍干菌存率不低于70%計(jì)算）。
[0048] 五、成品檢驗(yàn)
[0049] 性狀灰白色海綿狀疏松團(tuán)塊，易與瓶壁脫離，加稀釋液后迅速溶解。
[0050] 純粹檢驗(yàn)按《中國獸藥典》規(guī)定的方法進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)純粹。
[0051] 活菌計(jì)數(shù)按瓶簽注明頭份，用含10%牛血清的馬丁瓊脂平板做活菌計(jì)數(shù)（按《中 國獸藥典》規(guī)定的方法進(jìn)行）。CVCC1318株活疫苗每頭份活菌數(shù)不少于7 X IO8CFU, CVCC1319 株活疫苗每頭份活菌數(shù)不少于5X 108CFU。
[0052] 耐老化檢驗(yàn)取疫苗5瓶，置37°C保存7日，任選3瓶分別進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，放置后核 定的每頭份活菌數(shù)與"活菌計(jì)數(shù)"項(xiàng)測(cè)定的結(jié)果相比，其活菌存活率應(yīng)不低于70%。
[0053] 安全檢驗(yàn)按瓶簽注明頭份，將疫苗用20%氫氧化鋁膠生理鹽水稀釋，皮下注射體 重20?22g小白鼠10只，每只2頭份，觀察14日，注射CVCC1318株活疫苗應(yīng)全部健活，注 射CVCC1319株活疫苗應(yīng)至少8只健活。
[0054] 效力檢驗(yàn)按瓶簽注明頭份用20%氫氧化鋁膠生理鹽水稀釋成Iml含1/10使用劑 量，皮下注射體重16?18g小白鼠10只，每只0. 2ml (含1/50使用劑量）。14日后連同條 件相同的對(duì)照小白鼠6只，其中3只對(duì)照小白鼠和免疫小白鼠各皮下注射1000MLD的豬丹 毒桿菌1型和2型（各1株）強(qiáng)毒菌的混合菌液，另3只對(duì)照小白鼠各皮下注射IMLD的豬 丹毒桿菌強(qiáng)毒的混合菌液。觀察10日，注射1000MLD的對(duì)照小白鼠全部死亡，注射IMLD的 對(duì)照小鼠至少死亡2只，免疫小白鼠至少保護(hù)8只。
[0055] 剩余水分測(cè)定按《中國獸藥典》規(guī)定的方法進(jìn)行測(cè)定，應(yīng)不超過4. 0%。
[0056] 真空度測(cè)定按《中國獸藥典》規(guī)定的方法進(jìn)行測(cè)定。
[0057] 本發(fā)明涉及的微生物資源信息
[0058] 豬丹毒絲菌或稱豬丹毒丹毒絲菌（Erysipelothrix rhusiopathiae)，通稱豬丹 毒桿菌，CVCC1318株即GC42株，由哈爾濱獸醫(yī)研究所鑒定、保管和供應(yīng)。弱毒株，由強(qiáng)毒 G370株致弱而成，血清型為Ia型（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中 心編著.中國獸醫(yī)菌種目錄（第2版）中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2002, p64);豬丹毒桿 菌CVCC1319株菌種即G4T10株，江蘇農(nóng)科院分離，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保管和供 應(yīng)，弱毒株，血清型為Ia型（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心編 著.中國獸醫(yī)菌種目錄（第2版）中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2002，p65)。以上兩株菌均為 我國豬丹毒活疫苗商品疫苗生產(chǎn)菌株。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0059] 圖1 :凍干曲線1示意圖圖中顯示：-351^進(jìn)箱；-4(TC維持約4小時(shí)；產(chǎn)品由-4(TC 升至-KTC，維持10小時(shí)；板層溫度提高到28°C，維持8小時(shí)。全程約28小時(shí)。
[0060] 圖2 :凍干曲線2示意圖圖中顯示：0?5°C進(jìn)箱；以每分鐘1°C降至_40°C或以下， 維持約4小時(shí)；板層控制-KTC，維持14?16小時(shí)；每間隔2小時(shí)升溫KTC，在28°C維持 6小時(shí)出箱。全程約28小時(shí)。
[0061] 本發(fā)明的積極效果
[0062] 本發(fā)明所提供的合成培養(yǎng)基根據(jù)豬丹毒桿菌的生長特點(diǎn)和生長需求設(shè)計(jì)而成，配 方原材料來源可控，不受牛肉、牛肝和豬胃等材料的影響，批次穩(wěn)定、制作簡單、使用方便， 適合進(jìn)行細(xì)菌高細(xì)胞密度培養(yǎng)，培養(yǎng)菌數(shù)高；凍干過程采用針對(duì)豬丹毒桿菌特性研制的耐 熱凍干保護(hù)劑及配套凍干曲線，在凍干過程中有效保護(hù)細(xì)菌的活性，提高凍干菌存率，實(shí)現(xiàn) 疫苗2?8°C長期保存，保存期可達(dá)24個(gè)月。 實(shí)施例
[0063] 本實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步的說明，不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。
[0064] 實(shí)施例1
[0065]-合成培養(yǎng)基的制備
[0066] 1.合成培養(yǎng)基的制備
[0067] 合成培養(yǎng)基配方（W/V)如下：
[0068] 大豆胨10g、蛋白胨20g、酵母粉20g、磷酸氫二鉀0. 675g、磷酸二氫鉀0. 1632g、硫 酸鎂0. 2g、葡萄糖5g、L-Arg-HCl 5g、色氨酸lg、吐溫-800. 5ml、注射用水加至IOOOml ; [0069] 2.合成培養(yǎng)基配制方法
[0070] 按上述配方依次稱取培養(yǎng)基成分（除葡萄糖外）加入到注射用水中，充分溶解后 用2mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為7. 8?8. 2,116°C滅菌30分鐘。臨用時(shí)，無菌操作 加入終濃度〇. 5 %的50 %葡萄糖溶液，混勻。
[0071] 50%葡萄糖溶液（W/V)稱取50g葡萄糖，加注射用水溶解，定容至100ml，116°C滅 菌30分鐘，2?8°C保存。
[0072] 2mol/L的氫氧化鈉溶液稱取8g氫氧化鈉，加注射用水溶解，定容至100ml，116°C 滅菌30分鐘，2?8°C保存。
[0073] 實(shí)施例2
[0074] --凍干保護(hù)劑的制備 [0075] 保護(hù)劑的配方
[0076] 右旋糖苷10g，BSA Ig,山梨醇50g，鹿糖50g，水解乳蛋白5g，L_谷氨酸鈉5g，磷酸 氫二鉀I. 25g，磷酸二氫鉀0. 52g，注射用水1000ml。
[0077] 2.配制方法
[0078] 溶液1:在潔凈燒杯中，加入注射用水（KKTC )適量，按配方依次稱取右旋糖苷、 BSA、山梨醇，加入燒杯中，邊加入邊用玻璃棒攪拌，使其完全溶解，再用注射用水定容至 500ml，經(jīng)116°C滅菌30分鐘。
[0079] 溶液2 :按配方依次稱取蔗糖、水解乳蛋白、L-谷氨酸鈉、磷酸二氫鉀和磷酸氫二 鉀于燒杯中，加入注射用水使其充分溶解后，定容至500ml，0. 22 μ m濾膜的除菌濾器過濾 除囷。
[0080] 配苗前，在無菌條件下，將溶液1和溶液2等體積混勻，即成。
[0081] 實(shí)施例3
[0082] --豬丹毒活疫苗（CVCC1318)
[0083] 1制苗用菌液制備
[0084] 將豬丹毒桿菌CVCC1318株種子液按培養(yǎng)基總量的1 %?2%接種于液體培養(yǎng)基 中，37°C發(fā)酵或通氣培養(yǎng)8?10小時(shí)，培養(yǎng)過程中根據(jù)需要加入適量消泡劑，并根據(jù)pH升 高情況加入適量滅菌2mol/L的氫氧化鈉溶液以控制pH值。培養(yǎng)結(jié)束后菌液用3500r/min 離心20min，收獲菌體沉淀，沉淀加入適量經(jīng)過滅菌處理并預(yù)熱至37°C的耐熱凍干保護(hù)劑 懸浮，充分混勻后按規(guī)定頭份分裝。分裝過程中應(yīng)注意保溫振搖均勻，分裝后迅速進(jìn)行冷 凍真空干燥，按《中國獸藥典》規(guī)定的方法進(jìn)行。CVCC1318株活疫苗每頭份活菌數(shù)不少于 7 X IO8CFU。
[0085] 2半成品檢驗(yàn)
[0086] 純粹檢驗(yàn)取菌液用馬丁瓊脂平板，按《中國獸藥典》規(guī)定的方法進(jìn)行，結(jié)果純粹。
[0087] 活菌計(jì)數(shù)取樣用含10%牛血清的馬丁瓊脂平板培養(yǎng)計(jì)活菌數(shù)，按《中國獸藥典》規(guī) 定的方法進(jìn)行，作為計(jì)算凍干活菌率的基數(shù)及配苗時(shí)參考。
[0088] 配苗、分裝、凍干將懸浮菌液充分混勻后，按規(guī)定頭份定量分裝，CVCC1318株活疫 苗每頭份活菌數(shù)不少于IOX IO8CFU (按凍干菌存率不低于70%計(jì)算）。
[0089] 3.成品檢驗(yàn)
[0090] (1)性狀3批疫苗制品均為灰白色海綿狀疏松團(tuán)塊，易與瓶壁脫離，加稀釋液后迅 速溶解。
[0091] (2)純粹檢驗(yàn)按《中國獸藥典》規(guī)定的方法進(jìn)行檢驗(yàn)，3批疫苗制品均為純粹。
[0092] (3)活菌計(jì)數(shù)按瓶簽注明頭份，用含10%牛血清的馬丁瓊脂平板做活菌計(jì)數(shù)（按 《中國獸藥典》規(guī)定的方法進(jìn)行）。結(jié)果為01批為13 X IO8CFU/頭份。
[0093] (4)安全檢驗(yàn)按瓶簽注明頭份，將疫苗用20%鋁膠生理鹽水稀釋，皮下注射體重 20?22g小白鼠10只，每只2頭份，觀察14天，3批疫苗檢驗(yàn)結(jié)果小鼠10/10健活。
[0094] (5)效力檢驗(yàn)按瓶簽注明頭份用20%鋁膠生理鹽水稀釋成Iml含1/10使用劑量， 皮下注射體重16?18g小白鼠10只，每只0. 2ml (含1/50使用劑量）。14日后連同條件 相同的對(duì)照小白鼠6只，其中3只對(duì)照小白鼠和免疫小白鼠各皮下注射1000MLD的豬丹毒 桿菌1型和2型（各1株）強(qiáng)毒菌的混合菌液，另3只對(duì)照小白鼠各皮下注射IMLD的豬丹 毒桿菌強(qiáng)毒的混合菌液。觀察10日，注射1000MLD的對(duì)照小白鼠全部死亡，注射IMLD的對(duì) 照小鼠至少死亡2只，免疫小白鼠至少保護(hù)8只結(jié)果見表1。
[0095] (6)剩余水分測(cè)定按《中國獸藥典》規(guī)定的方法進(jìn)行測(cè)定，為L 25%、2· 26%、 2. 35%、1· 47%。
[0096] (7)真空度測(cè)定按《中國獸藥典》規(guī)定的方法進(jìn)行測(cè)定結(jié)果均為白色或紫色輝光。
[0097] (8)耐老化檢驗(yàn)取豬丹毒活疫苗（GC42株）5瓶，置37°C保存7日，任選3瓶分別進(jìn) 行活菌計(jì)數(shù)，放置后核定的每頭份活菌數(shù)與"活菌計(jì)數(shù)"項(xiàng)測(cè)定的結(jié)果相比，結(jié)果為86. 7%， 國內(nèi)同類制品（GC42株）37°C保存7日，活菌存活率僅達(dá)55%。
[0098] 實(shí)施例4
[0099] --豬丹毒活疫苗（CVCC1319株）
[0100] 1制苗用囷液制備
[0101] 將豬丹毒桿菌CVCC1319株種子液按培養(yǎng)基總量的1 %?2 %接種于液體培養(yǎng)基 中，37°C發(fā)酵或通氣培養(yǎng)8?10小時(shí)，培養(yǎng)過程中根據(jù)需要加入適量消泡劑，并根據(jù)pH升 高情況加入適量滅菌2mol/L的氫氧化鈉溶液以控制pH值。培養(yǎng)結(jié)束后菌液用3500r/min 離心20min，收獲菌體沉淀，沉淀加入適量經(jīng)過滅菌處理并預(yù)熱至37°C的耐熱凍干保護(hù)劑 懸浮，充分混勻后按規(guī)定頭份分裝。分裝過程中應(yīng)注意保溫振搖均勻，分裝后迅速進(jìn)行冷 凍真空干燥，按《中國獸藥典》規(guī)定的方法進(jìn)行。CVCC1319株活疫苗每頭份活菌數(shù)不少于 5 X IO8CFU。
[0102] 2半成品檢驗(yàn)
[0103] 純粹檢驗(yàn)取菌液用馬丁瓊脂平板，按《中國獸藥典》規(guī)定的方法進(jìn)行，結(jié)果純粹。
[0104] 活菌計(jì)數(shù)取樣用含10%牛血清的馬丁瓊脂平板培養(yǎng)計(jì)活菌數(shù)，按《中國獸藥典》規(guī) 定的方法進(jìn)行，作為計(jì)算凍干活菌率的基數(shù)及配苗時(shí)參考。
[0105] 配苗、分裝、凍干將懸浮菌液充分混勻后，按規(guī)定頭份定量分裝，CVCC1319株活疫 苗每頭份活菌數(shù)不少于7 X IO8CFU (按凍干菌存率不低于70%計(jì)算）。
[0106] 3成品檢驗(yàn)
[0107] 性狀3批疫苗制品均為灰白色海綿狀疏松團(tuán)塊，易與瓶壁脫離，加稀釋液后迅速 溶解。
[0108] 純粹檢驗(yàn)按《中國獸藥典》規(guī)定的方法進(jìn)行檢驗(yàn)，3批疫苗制品均純粹。
[0109] 活菌計(jì)數(shù)按瓶簽注明頭份，用含10%牛血清的馬丁瓊脂平板做活菌計(jì)數(shù)（按《中 國獸藥典》規(guī)定的方法進(jìn)行），結(jié)果為03批為9. I X IO8CFU/頭份。
[0110] 安全檢驗(yàn)按瓶簽注明頭份，將疫苗用20 %鋁膠生理鹽水稀釋，皮下注射體重20? 22g小白鼠10只，每只2頭份，觀察14日，檢驗(yàn)小鼠均全部健活。
[0111] 效力檢驗(yàn)按瓶簽注明頭份用20 %鋁膠生理鹽水稀釋成Iml含1/10使用劑量，皮下 注射體重16?18g小白鼠10只，每只0.2ml (含1/50使用劑量）。14日后連同條件相同 的對(duì)照小白鼠6只，其中3只對(duì)照小白鼠和免疫小白鼠各皮下注射1000MLD的豬丹毒桿菌 1型和2型（各1株）強(qiáng)毒菌的混合菌液，另3只對(duì)照小白鼠各皮下注射IMLD的豬丹毒桿 菌強(qiáng)毒的混合菌液。觀察10日，注射1000MLD的對(duì)照小白鼠全部死亡，注射IMLD的對(duì)照小 鼠至少死亡2只，免疫小白鼠至少保護(hù)8只（結(jié)果見表1)。
[0112] 表1豬丹毒活疫苗免疫小鼠的免疫原性檢驗(yàn)結(jié)果
[0113]

【權(quán)利要求】
1. 一種豬丹毒活疫苗的生產(chǎn)方法，其特征是： (1) 生產(chǎn)菌種為豬丹毒桿菌CVCC1318株； (2) 所使用合成培養(yǎng)基的配方（W/V)是：大豆胨10g、蛋白胨20g、酵母粉20g、磷酸氫 二鉀0. 675g、磷酸二氫鉀0. 1632g、硫酸鎂0. 2g、葡萄糖5g、L-Arg-HCl 5g、色氨酸lg、吐 溫-80 0? 5ml、注射用水加至1000ml ; (3) 所使用耐熱保護(hù)劑的最佳配方（W/V)是：右旋糖苷10g，BSA lg，甘露醇50g，海藻 糖50g，水解乳蛋白5g，L-谷氨酸鈉5g，磷酸氫二鉀I. 25g，磷酸二氫鉀0. 52g，注射用水加 至 IOOOml ; (4) 該方法所生產(chǎn)的豬丹毒活疫苗的保藏條件為2?8°C，有效期達(dá)24個(gè)月。
2. 本發(fā)明所述一種豬丹毒活疫苗的生產(chǎn)方法，其中豬丹毒活疫苗生產(chǎn)菌種也可以是豬 丹毒桿菌CVCC1319株。
【文檔編號(hào)】A61P31/04GK104306963SQ201410602361
【公開日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年10月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月31日
【發(fā)明者】朱良全, 李聰研, 丁家波, 孫曄, 沈青春 申請(qǐng)人:北京中海生物科技有限公司