專利名稱：犬瘟熱狂犬病細(xì)小病毒三聯(lián)活疫苗、毒種及制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及犬瘟熱、狂犬病、犬細(xì)小病毒病三聯(lián)活疫苗、毒種及制造方法，屬于獸醫(yī)藥品技術(shù)領(lǐng)域。
關(guān)于犬的疫苗國(guó)內(nèi)外近20年來(lái)研究較多，但二聯(lián)及多聯(lián)苗的研究不多，1983年美國(guó)CABABSTRACTS及AGRICOLA收集的文獻(xiàn)有56篇，其中包括犬用細(xì)小病毒、狂犬病毒、犬瘟熱病毒病三聯(lián)疫苗的文獻(xiàn)共有5篇，這些報(bào)告中所用細(xì)小病毒疫苗多數(shù)為貓細(xì)小病毒弱毒、滅活的貓細(xì)小病毒或滅活的犬細(xì)小病毒，對(duì)犬細(xì)小病毒強(qiáng)毒攻擊并不能完全保護(hù)；聯(lián)苗中的狂犬病毒疫苗多為滅活的或弱毒株(ERA SAD FLURY株)均為對(duì)幼犬及12-20克小白鼠腦內(nèi)存在致病性，因此其應(yīng)用范圍及安全性受到限制；美國(guó)多聯(lián)疫苗中，犬瘟熱病毒利用的毒株為A-CDV對(duì)雪貉有致病性，因此其安全性存在一定間題。國(guó)內(nèi)研制的五聯(lián)疫苗、細(xì)小病毒株用貉細(xì)小病毒株、狂犬病毒用ERA株，也存在以上同樣的問(wèn)題。
從1970年到現(xiàn)在，美國(guó)及歐洲日本有關(guān)的專利共有四個(gè)，US P5000951為一種犬瘟熱滅活疫苗專利。E P0023731A2為單一的細(xì)胞系制備多價(jià)疫苗的方法專利，為一種方法發(fā)明。E P0169958A2為犬細(xì)小病毒疫苗的專利。E P0044920A2為用豬睪丸細(xì)胞制備的狂犬病滅活疫苗專利，故無(wú)狂犬病、犬瘟熱、犬細(xì)小病毒三聯(lián)活疫苗的專利報(bào)道。
本發(fā)明的目的是提供一種犬瘟熱、狂犬病、犬細(xì)小病毒病三聯(lián)活疫苗、毒種以及與此相配套的制造方法本發(fā)明的一種犬瘟熱、狂犬病、犬細(xì)小病毒病三聯(lián)弱毒活疫苗毒種，是指犬瘟熱弱毒毒種屬副粘病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒屬(Morbilliviridae)犬瘟熱病毒(Caninedistemper virus)、編號(hào)為CDV-FAC株；狂犬病弱毒毒種屬?gòu)棤畈《究?Rhabdoviridae)狂犬病病毒屬(Lyssa virus，or Rahies virus group)狂犬病毒(Rabies virus)、編號(hào)為CTNB12；犬細(xì)小病毒弱毒毒種屬細(xì)小病毒科，又名微小病毒科(Pavoviridae)，細(xì)小病毒屬，又名微小病毒屬(Parvovirus)，犬細(xì)小病毒(CanineParvovirus)、編號(hào)為A2-CPV；這三種毒種均于1995年3月6日，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC NO 0222。
本發(fā)明的一種犬瘟熱、狂犬病、犬細(xì)小病毒病三聯(lián)弱毒活疫苗，是將犬瘟熱病毒，狂犬病病毒，犬細(xì)小病毒三種弱毒疫苗株分別制備的病毒液按比例混合而制備三聯(lián)活疫苗。這種活疫苗能預(yù)防犬瘟熱、狂犬病、犬細(xì)小病毒病三種傳染??；該三聯(lián)弱毒活疫苗含有犬瘟熱弱毒大于103.5TCID50/劑量，狂犬病弱毒大于105.0PFU/劑量、犬細(xì)小病毒弱毒大于103.5TCID50/劑量。
本發(fā)明的一種犬瘟熱、狂犬病、犬細(xì)小病毒病三聯(lián)弱毒活疫苗的制造方法，包括三種毒種標(biāo)準(zhǔn)、毒種傳代及保存、疫苗制造配比及凍于檢驗(yàn)。將分別生產(chǎn)犬瘟熱、狂犬病、犬細(xì)小病毒病三聯(lián)弱毒活疫苗，然后進(jìn)行病毒滴定，依所含免疫劑量，按犬瘟熱弱毒大于103.5TCID50，狂犬病弱毒大于105.0PFU、犬細(xì)小病毒弱毒大于103.5TCID50混合，過(guò)濾，凍干制成三聯(lián)苗。
狂犬病弱毒的培養(yǎng)為將經(jīng)無(wú)菌，支原體檢驗(yàn)陰性的正常成片的BHK21細(xì)胞消化，加原培養(yǎng)液的3—5倍的培養(yǎng)液量，調(diào)pH至7.6—7.8，并加培養(yǎng)液2％的病毒，混勻分裝于細(xì)胞瓶?jī)?nèi)或發(fā)酵罐內(nèi)微載體培養(yǎng)，33℃-37℃培養(yǎng)3-10天收上清，再換維持液3天后再收毒一次。收毒時(shí)作無(wú)菌檢驗(yàn)和用蝕斑法進(jìn)行病毒滴定，收獲液存于-20℃，保存時(shí)間不超過(guò)3個(gè)月。
狂犬病弱毒毒種的傳代及保存為毒種傳代用BHK21細(xì)胞，BHK21細(xì)胞為經(jīng)支原體、外源因子檢驗(yàn)合格的150代以內(nèi)細(xì)胞，長(zhǎng)成單層后，換維持液，維持液加2％的病毒原液，放33℃-37℃培養(yǎng)3-10天收毒，將收獲的病毒液加等量的保護(hù)劑(脫胎牛奶、小牛血清、6％明膠、6％麥芽糖均可)，凍干，并進(jìn)行檢驗(yàn)，達(dá)到毒種標(biāo)準(zhǔn)即可存于-30℃，每3年傳代一次。
犬細(xì)小病毒弱毒的培養(yǎng)為選健康新生仔貓，無(wú)菌取腎，制成單層細(xì)胞于培養(yǎng)瓶中或發(fā)酵罐中，pH值為7.4—7.6，培養(yǎng)2-3天，接種犬細(xì)小病毒弱毒，A2-CPV繁殖條件為pH7.2-7.6，溫度35-38℃條件下，培養(yǎng)3-6天，待40％以上細(xì)胞發(fā)生病變時(shí)凍融收毒或收上清；最佳條件為pH7.4，溫度37℃，培養(yǎng)4-5天，待75％以上細(xì)胞發(fā)生病變時(shí)凍融3次收毒；保存于-20℃以下，保存時(shí)間不能超過(guò)3個(gè)月，如超過(guò)則凍干前應(yīng)重新滴定病毒，液氮保存可存10年，每10年傳代一次。
犬細(xì)小病毒弱毒毒種的傳代及保存為毒種傳代用A72細(xì)胞。常規(guī)將A72細(xì)胞培養(yǎng)成單層，接種維持液量2％的犬細(xì)小病毒36℃吸附1小時(shí)，加維持液37℃培養(yǎng)4—5天，待70％以上細(xì)胞發(fā)生病變時(shí)凍融收毒，經(jīng)檢無(wú)菌，加等量5％蔗糖脫脂奶凍干，并檢驗(yàn)，達(dá)到毒種標(biāo)準(zhǔn)即存于-30℃，每3年傳代一次。
犬瘟熱弱毒的培養(yǎng)、傳代及保存為選6-15日齡發(fā)育良好SPF雞胚，制備雞成纖維細(xì)胞，于細(xì)胞培養(yǎng)瓶或發(fā)酵罐中，36-39℃培養(yǎng)2-10天，吸附接種病毒，30-35℃培養(yǎng)2-10天，待40％以上細(xì)胞發(fā)生病變時(shí)，將細(xì)胞移至2-8℃過(guò)夜，收上清，與等量保護(hù)劑混合凍干，并檢驗(yàn)達(dá)到毒種標(biāo)準(zhǔn)放-30℃保存，每三年傳代一次；最佳條件為33℃，培養(yǎng)2-3天，待70％以上細(xì)胞發(fā)生病變時(shí)，將細(xì)胞移至3-5℃過(guò)夜，反復(fù)搖動(dòng)后收上清，液氮保存可存10年，每10年傳代一次。
制造凍干疫苗的保護(hù)劑為5％蔗糖脫脂乳、經(jīng)110—116℃滅菌30—40分鐘，經(jīng)檢驗(yàn)無(wú)菌后，并按每毫升加入青霉素100—500單位、鏈霉素100—500微克或慶大霉素100—500單位，用于配苗，最后將疫苗分裝于有三叉膠塞的青瓶中，然后進(jìn)行真空凍干。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果如下1、弱毒株的優(yōu)點(diǎn)CDV-FAC株對(duì)雪貂小白鼠無(wú)毒性，可在雞胚，雞胚成纖維細(xì)胞繁殖，滴度高達(dá)107.3TCID50/ml，可在犬腎細(xì)胞，F(xiàn)L細(xì)胞Vero細(xì)胞上繁殖，對(duì)犬具有良好的免疫原性，對(duì)犬80％免疫保護(hù)劑量為101.4TCID50，100％免疫保護(hù)劑量為102.1TCID50。
CTNB12株對(duì)小白鼠(體重10-20g)腦內(nèi)及幼犬不致的熱穩(wěn)定株，在BHK21細(xì)胞上滴度可達(dá)107.25PFU/ml，對(duì)犬、豚鼠、兔均無(wú)致病性，免疫原性與Flury株相近，對(duì)犬的最小免疫劑量為104.5PFU。
A2--CPV株適應(yīng)新生貓?jiān)I細(xì)胞，滴度高達(dá)105.5TCID50/ml，對(duì)小白鼠腦內(nèi)，腹腔注射均無(wú)致病性，對(duì)貓犬均無(wú)致病性，無(wú)反祖現(xiàn)象，對(duì)犬的最小免疫劑量為101.5TCID50。
2、疫苗的效力及免疫持久性好為了本證實(shí)本發(fā)明的效力及免疫持久性，對(duì)中試生產(chǎn)的五批疫苗隨機(jī)取樣(同安全試驗(yàn))在上海、北京、廣東、內(nèi)蒙、河南等地作中試生產(chǎn)疫苗的區(qū)域性試驗(yàn)，接種犬39540只，試驗(yàn)所在地參加合作單位將試驗(yàn)數(shù)據(jù)收集同時(shí)對(duì)每批疫苗免疫的犬隨機(jī)抽取20—35只在免前、免后一個(gè)月、12個(gè)月分別采血測(cè)RV及CEV的中和抗體、CPV的HI抗體。重點(diǎn)選擇一個(gè)試驗(yàn)區(qū)進(jìn)行觀察，對(duì)免疫前后及對(duì)照區(qū)的流行病學(xué)情況進(jìn)行比較。
以上地區(qū)收集的試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，免疫犬在一年內(nèi)無(wú)狂犬病、犬瘟熱及細(xì)小病毒性疾病發(fā)生，對(duì)其血清進(jìn)行抗體檢測(cè)。中試生產(chǎn)的5批疫苗經(jīng)免后抗體監(jiān)測(cè)免前抗體水平較低，或無(wú)抗體，免后1個(gè)月產(chǎn)生較高抗體，證明非自然感染所至，為疫苗免疫刺激機(jī)體產(chǎn)生。免后12個(gè)月血中抗狂犬病、犬瘟熱病毒中和抗體及犬細(xì)小病毒血清抑制抗體水平均較高于保護(hù)抗體水平，故認(rèn)為免后12個(gè)月犬應(yīng)具有保護(hù)作用，疫苗的免疫持久性較好。
在對(duì)比接種疫苗前，對(duì)犬檢測(cè)抗體每組平均為RV＜2、CDV＜1、CPV＜4。①免疫組接種疫苗犬，因賣出等原因減少348只，12個(gè)月追蹤調(diào)查組表明均未出現(xiàn)犬瘟熱、狂犬病、細(xì)小病毒性腸炎臨床發(fā)病、防疫效果達(dá)到100％，試驗(yàn)證實(shí)疫苗效果良好安全可靠。②對(duì)照組因賣出等原因減少19只、獸醫(yī)業(yè)務(wù)人員診斷為狂犬病臨床發(fā)病撲殺1只(發(fā)病率0.94％)，犬瘟熱17只(發(fā)病死亡率16％)。犬細(xì)小病毒引起傳染性腸炎死亡9只(發(fā)病死亡率8.4％)。
3、安全可靠性好在上海、廣東、廣西、內(nèi)蒙、河南、北京等地對(duì)中試疫苗進(jìn)行了區(qū)域性試驗(yàn)，共接種犬39540只，收集到的有關(guān)疫苗安全性的數(shù)據(jù)表明犬注射三聯(lián)疫苗后局部發(fā)生紅腫的犬占0.02％，發(fā)生全身過(guò)敏反應(yīng)的占0.0025％，試驗(yàn)中在北京發(fā)生一例在第二次注射三聯(lián)疫苗時(shí)發(fā)生全身過(guò)敏反應(yīng)，經(jīng)搶救已康復(fù)，經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)該犬已經(jīng)在6個(gè)月內(nèi)免疫過(guò)兩次國(guó)產(chǎn)的單價(jià)疫苗。故分析原因可能與免疫次數(shù)過(guò)多、且單價(jià)疫苗中含牛血清及細(xì)胞成份過(guò)多有關(guān)?？傊?jīng)安全試驗(yàn)觀察證明該三聯(lián)疫苗應(yīng)用39540劑量無(wú)一例因注射疫苗而造成發(fā)病死亡。本發(fā)明的疫苗安全可靠性好。


圖1為本發(fā)明的工藝流程圖下面敘述
具體實(shí)施例方式一、毒種實(shí)施例本發(fā)明的犬瘟熱、狂犬病、犬細(xì)小病毒病三聯(lián)弱毒活疫苗毒種的分類，編號(hào)和保藏號(hào)為犬瘟熱弱毒毒種屬副粘病毒科麻疹病毒屬、編號(hào)為CDV-FAC株，狂犬病弱毒毒種屬?gòu)棤畈《究瓶袢〔《緦?、編?hào)為CTNB12，犬細(xì)小病毒弱毒毒種屬細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬、編號(hào)為A2-CPV，這三種毒種均于1995年3月6日，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，三種毒種的保藏號(hào)為CGMCC NO 0222。
二、產(chǎn)品實(shí)施例本發(fā)明的犬瘟熱、狂犬病、犬細(xì)小病毒病三聯(lián)弱毒活疫苗產(chǎn)品，該三聯(lián)弱毒活疫苗產(chǎn)品含有犬瘟熱弱毒大于103.5TCID50/劑量，狂犬病弱毒大于105.0PFU/劑量、犬細(xì)小病毒弱毒大于103.5TCID50/劑量。
三、制造方法實(shí)施例本發(fā)明的一種犬瘟熱、狂犬病、犬細(xì)小病毒病三聯(lián)弱毒活疫苗的制造方法，包括三種毒種標(biāo)準(zhǔn)、毒種傳代及保存、疫苗制造配比及凍干檢驗(yàn)。本發(fā)明先分別生產(chǎn)犬瘟熱、狂犬病、犬細(xì)小病毒病三種弱毒活疫苗，然后進(jìn)行病毒滴定，依所含免疫劑量，按犬瘟熱弱毒大于103.5TCID50，狂犬病弱毒大于105.0PFU、犬細(xì)小病毒弱毒大于103.5TCID50混合，過(guò)濾，凍干制成三聯(lián)苗。
(一)、毒種制造犬瘟熱、狂犬病、犬細(xì)小病毒病三聯(lián)活疫苗的毒種于1995年3月6日，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，由該中心負(fù)責(zé)本發(fā)明毒種的保存和供給。
1、制造狂犬病弱毒疫苗毒種必須符合下列標(biāo)準(zhǔn)(1)、毒種必須純凈，凍干毒種開(kāi)封后每次傳代后均須做細(xì)菌、霉菌、支原體及外源病原檢驗(yàn)(方法見(jiàn)獸醫(yī)生物制品制造及檢驗(yàn)規(guī)程85年1月版本)合格者方可用于疫苗生產(chǎn)。
(2)、效力標(biāo)準(zhǔn)按《獸醫(yī)生物制品制造及檢驗(yàn)規(guī)程》85年1月版本方法進(jìn)行效力試驗(yàn)對(duì)小白鼠保護(hù)指數(shù)應(yīng)不低于10000LD50。
(3)、毒力標(biāo)準(zhǔn)對(duì)1—3日齡乳鼠腦內(nèi)感染LD50不少于105.0/0.03ml。對(duì)12—14克小白鼠腦內(nèi)感染LD50為0。
(4)、安全標(biāo)準(zhǔn)用10個(gè)疫苗劑量的病毒浸潤(rùn)5只易感犬的坐骨神經(jīng)，90天內(nèi)不應(yīng)發(fā)現(xiàn)狂犬病癥狀或死亡。
(5)、免疫原性標(biāo)準(zhǔn)對(duì)易感犬的免疫保護(hù)一年的最小免疫劑量不高于為104.5PFU。
2、制造犬細(xì)小病毒弱毒疫苗毒種必須符合下列標(biāo)準(zhǔn)(1)、純凈檢驗(yàn)，凍干毒種開(kāi)封后每次傳代后均須做細(xì)菌、霉苗、支原體及外源病原檢驗(yàn)，合格者方可用于疫苗生產(chǎn)。
(2)、毒種對(duì)3—12月齡犬口服及滴鼻接種105.5TCID50，經(jīng)幼犬體內(nèi)傳代5代毒力不變，即對(duì)犬不致病。
(3)、毒種在A72細(xì)胞的滴度不低于105.0TCID50/ml。在新生貓腎原代細(xì)胞上傳代滴度不低于105.0TCID50/ml。
(4)、毒種對(duì)幼犬免疫保護(hù)一年的最小免疫劑量不高于103.5TCID50。
(5)、毒種以最小免疫劑量免疫易感犬20只，免后21天攻毒，攻毒后抗感染保護(hù)率不低于95％。
3、制造犬瘟熱病毒弱毒疫苗毒種必須符合下列標(biāo)準(zhǔn)(1)、純凈檢驗(yàn)凍干毒種開(kāi)封后每次傳代后均須做細(xì)菌、霉菌、支原體及外源病原檢驗(yàn)，合格者方可用于疫苗生產(chǎn)。
(2)、毒力標(biāo)準(zhǔn)1個(gè)犬使用劑量接種2只易感雪貂，接種后21天無(wú)不良反應(yīng)。對(duì)犬及小白鼠均無(wú)致病性。
(3)、毒種對(duì)雞胚成纖維細(xì)胞的滴度不低于105.0TCID50/0.05ml。
(4)、毒種對(duì)犬最小免疫劑量不高于102.1TCID50。
(5)、毒種以最小免疫劑量免疫易感犬，免后21天用500ID50CDV強(qiáng)毒攻毒，攻毒保護(hù)率不低于95％。
4、毒種的傳代及保存
(1)、狂犬病弱毒毒種的傳代及保存毒種傳代用BHK21細(xì)胞，BHK21細(xì)胞為經(jīng)支原體、外源因子檢定合格的150代以內(nèi)細(xì)胞，長(zhǎng)成單層后，換維持液，維持液加2％的病毒原液，放33℃培養(yǎng)6天收毒。將收獲的病毒液加等量的小牛血清，凍干，并進(jìn)行檢驗(yàn)，達(dá)到毒種標(biāo)準(zhǔn)即可存于-30℃，每3年傳代一次。
(2)、犬細(xì)小病毒弱毒毒種的傳代及保存毒種傳代用A72細(xì)胞。常規(guī)將A72細(xì)胞培養(yǎng)成單層，接種維持液量2％的犬細(xì)小病毒36℃吸附1小時(shí)，加維持液37℃培養(yǎng)4—5天，待70％以上細(xì)胞發(fā)生病變時(shí)凍融收毒，經(jīng)檢無(wú)菌，加等量5％蔗糖脫脂奶凍干，并檢驗(yàn)，達(dá)到毒種標(biāo)準(zhǔn)即存于-30℃，每3年傳代一次。
(3)、犬瘟熱弱毒的傳代及保存選用9日齡發(fā)育良好SPF雞胚，無(wú)菌取胎兒，去頭及內(nèi)臟，剪碎，用0.25％胰酶溶液37℃消化30分鐘，然后吸出酶液用Hank′s液洗3次，加適量營(yíng)養(yǎng)液吹打后，靜置10分鐘，吸出上部無(wú)可見(jiàn)組織塊液體于無(wú)菌瓶?jī)?nèi)再次吹打，靜置10分鐘，吸出上部液與第一次吸出的混合，制成細(xì)胞懸液，營(yíng)養(yǎng)液為含5—10％牛血清的199培養(yǎng)基。稀釋成每毫升含細(xì)胞數(shù)80—100萬(wàn)，分裝于培養(yǎng)瓶中，于37℃培養(yǎng)2—3天長(zhǎng)成良好單層細(xì)胞，棄培養(yǎng)液，按生長(zhǎng)液的2—2.5％加入毒種，吸附1小時(shí)，中間搖1次，換入維持液35℃培養(yǎng)4—5天，等70％以上細(xì)胞發(fā)生病變時(shí)，將細(xì)胞移至4℃過(guò)夜，收上清。經(jīng)無(wú)菌檢驗(yàn)合格，即與等量的小牛血清混合，分裝凍干，并檢驗(yàn)，達(dá)到毒種標(biāo)準(zhǔn)-30℃保存，每3年傳代一次。
(二)、疫苗的制造1、狂犬病弱毒的培養(yǎng)將經(jīng)無(wú)菌，支原體檢驗(yàn)陰性的正常成片的BHK21細(xì)胞用0.25％的胰酶消化，加原培養(yǎng)液的3—5倍的培養(yǎng)液量(50％的MEM培養(yǎng)液，50％的0.5％水解乳蛋白Earle氏緩沖液，10％小牛血清、青、鏈霉毒各100單位/ml用7.5％碳酸氫鈉調(diào)pH至7.6—7.8)，并加培養(yǎng)液2％的病毒，混勻分裝于細(xì)胞瓶?jī)?nèi)，37℃培養(yǎng)6天收上清，再換維持液3天后再收毒一次。收毒時(shí)每三瓶混合分別作無(wú)菌試驗(yàn)和用飲斑法(見(jiàn)附錄)進(jìn)行病毒滴定。收獲液存于-20，保存時(shí)間不超過(guò)3個(gè)月。
2、犬細(xì)小病毒弱毒的培養(yǎng)選健康新生仔貓，乙醚麻醉，水淹死，適當(dāng)消毒液洗3次，最后一次泡20分鐘，無(wú)菌取腎，去包膜剪碎，用Eagle氏液洗3次，加0.25％胰酶37℃消化40分鐘，去掉胰酶液，用Eagle氏液洗3次，吹打加入適量營(yíng)養(yǎng)液(50％199培養(yǎng)基、40％0.5％的水解乳蛋白、10％小牛血清、慶大霉毒100單位/ml、1.1/萬(wàn)的谷氨酰氨7.5％NaHCO3調(diào)pH至7.4—7.6)、靜置10分鐘，將上部液體倒入營(yíng)養(yǎng)液瓶中，再次加入營(yíng)養(yǎng)液吹打，靜置10分鐘，再倒出上部液體，如此重復(fù)3次；上部液體都收集到同一個(gè)瓶中，每只貓腎細(xì)胞加營(yíng)養(yǎng)液約500—1000ml，再分裝于培養(yǎng)瓶中，37℃培養(yǎng)2—3天長(zhǎng)成單層，接種培養(yǎng)液量2％的犬細(xì)小病毒弱毒，36℃吸附1小時(shí)，加維持液(3％小牛備清的199培養(yǎng)基，內(nèi)含100單位慶大毒素/ml，pH為7.4)，37℃培養(yǎng)4—5天，待70％以上細(xì)胞發(fā)生病變時(shí)凍融收毒，收毒時(shí)每三瓶混合分別作無(wú)菌試驗(yàn)和病毒滴定，保存于-20℃，保存時(shí)間不能超過(guò)3個(gè)月，如超過(guò)則凍于前應(yīng)重新滴定病毒。
3、犬瘟熱的毒弱培養(yǎng)培養(yǎng)方法同毒種制造。
(三)、疫苗的配比及凍干1、以上法制備并經(jīng)檢驗(yàn)合格的病毒原液方可用于凍干。
2、制造凍干疫苗的保護(hù)劑為5％蔗糖脫脂乳、經(jīng)110—116℃滅菌30—40分鐘，經(jīng)檢驗(yàn)無(wú)菌后用于配苗。
3、配苗方法根據(jù)每種病毒的滴度決定配苗比例，將苗充分混合后，過(guò)濾即可分裝凍干。為了抑制雜菌，每毫升加入青霉素100—500單位、鏈霉素100—500微克或慶大霉素100—500單位。
4、疫苗的凍干將疫苗分裝于有三叉膠塞的青瓶中，然后進(jìn)行真空凍干。
5、凍干完畢即在凍干機(jī)內(nèi)處于真空裝態(tài)下壓上三叉膠塞，取出后壓上鋁帽。
6、每瓶疫苗應(yīng)標(biāo)明疫苗名稱、批量、裝量。若干瓶疫苗裝于包裝盒內(nèi)，并附有說(shuō)明書(shū)。每盒疫苗標(biāo)簽，注明制品名稱、制苗成分、批準(zhǔn)文號(hào)、批號(hào)、裝量、檢驗(yàn)號(hào)樹(shù)、用法，以及保存方法、效期、制造日期及廠名等。
7、所有制造及凍干過(guò)程，均須詳細(xì)記錄于專用表冊(cè)中，并注有實(shí)驗(yàn)人及核對(duì)人。
(四)、疫苗的檢驗(yàn)1、無(wú)菌檢驗(yàn)按《獸醫(yī)生物制品制造及檢驗(yàn)規(guī)程》中的《成品檢驗(yàn)有關(guān)規(guī)定》進(jìn)行。凍干疫苗有菌生長(zhǎng)時(shí)應(yīng)作雜菌計(jì)數(shù)和病原性鑒定。雜菌病原性鑒定按《成品檢驗(yàn)有關(guān)規(guī)定》。雜菌計(jì)數(shù)每毫升疫苗的非病原菌數(shù)不超過(guò)1000個(gè)。
2、安全檢驗(yàn)小白鼠安全試驗(yàn)取8只18—20克小白鼠，各腦內(nèi)接種0.03ml疫苗，另取同樣重量的8只各腹腔注射0.5ml，觀察7天。觀察期間，若任何一組有2只或2只以上小白鼠出現(xiàn)了疫苗本身所致的不良反應(yīng)，為不合格。若2只或2只以上小自鼠出現(xiàn)非疫苗本身所致的不良反應(yīng)，則為無(wú)結(jié)果，應(yīng)重檢；若不重檢判為不合格。
狗安全試驗(yàn)取3只易感犬，按瓶簽上注明的途徑，各注射10個(gè)使用劑量的疫苗，逐日觀察至21天。出現(xiàn)疫苗本身所致的不良反應(yīng)，判不合格；若不良反應(yīng)并非本品所致，判無(wú)結(jié)果，可重檢，若不重檢則判不合格。
3、效力檢驗(yàn)
犬瘟熱病毒用雞胚成纖維細(xì)胞對(duì)疫苗中犬瘟熱病毒含量進(jìn)行組織細(xì)胞半數(shù)致死量(TCID50)測(cè)定TCID50滴度不低于103.5判為合格，不合格可重檢一次。
狂犬病毒用微量蝕斑法測(cè)定疫苗中狂犬弱毒的蝕斑單位(PFU)，設(shè)有標(biāo)準(zhǔn)狂犬病血清中和試驗(yàn)對(duì)照。對(duì)照試驗(yàn)成立情況下，每批和每?jī)膳呙缰锌袢《竞坎坏陀?05.0PFU/頭劑。疫苗對(duì)小鼠保護(hù)指數(shù)測(cè)定按《獸醫(yī)生物制品制造及檢驗(yàn)規(guī)程》85年1月版本《狂犬病疫苗制造及檢驗(yàn)規(guī)程》中的效力檢定進(jìn)行，對(duì)小白鼠的保護(hù)指數(shù)不得低于10000LD50為合格，不合格者可重檢兩次。
犬細(xì)小病毒用A72細(xì)胞對(duì)疫苗中犬細(xì)小病毒的含量進(jìn)行微量組織細(xì)胞半數(shù)致死量測(cè)定(TCID50)，測(cè)定前將疫苗與等量的無(wú)犬細(xì)小病毒抗體的抗狂犬病血清37℃水浴中和1個(gè)小時(shí)。TCID50測(cè)定滴度不低103.5判為合格，不合格可重檢一次。
4、剩余水份檢驗(yàn)每批凍干苗任抽4個(gè)樣品，按《獸醫(yī)生物制品制造及檢驗(yàn)規(guī)程》85年1月版本《剩余水份測(cè)定法》測(cè)定水份。各樣品剩余水份應(yīng)不超過(guò)4％。
5、真空度測(cè)定按《獸醫(yī)生物制品制造及檢驗(yàn)規(guī)程》85年1月版本《成品檢驗(yàn)的有關(guān)規(guī)定》進(jìn)行。
6、物理性狀檢驗(yàn)凍干疫苗按《獸醫(yī)生物制品制造及檢驗(yàn)規(guī)程》85年1月版本《成品檢驗(yàn)有關(guān)規(guī)定》進(jìn)行。
7、所有檢驗(yàn)過(guò)程及檢驗(yàn)結(jié)果，均須詳細(xì)記錄于專用的表冊(cè)中。
8、成品留樣按《獸醫(yī)生物制品制造及檢驗(yàn)規(guī)程》85年1月版本《成品檢驗(yàn)的有關(guān)規(guī)定》進(jìn)行。
(五)、疫苗的保存及使用1、凍干疫苗的有效保存期自效力檢驗(yàn)開(kāi)始日期算，2—8℃保存最長(zhǎng)不超過(guò)1年。10—30℃保存最長(zhǎng)不超過(guò)2個(gè)月。
2、本疫苗專供用于動(dòng)物預(yù)防犬瘟熱、狂犬病及犬細(xì)小病毒腸炎三種傳染病。
3、用1ml生理鹽水或蒸餾水溶解l瓶三聯(lián)凍于疫苗為一只犬一次皮下或肌肉接種量，幼犬8周齡首次免疫，隔3—4周二次免疫，以后間隔1年免疫一次。成年犬初次免疫注射2次，間隔3—4周，以后每年免疫一次。
4、免疫使用的針頭及注射器必須消毒，但不可用化學(xué)藥物消毒，否則嚴(yán)重影響疫苗效力。懷孕期母犬及不健康犬勿使用。對(duì)個(gè)別犬可能出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)，可使用腎上腺素治療。
權(quán)利要求
1.一種犬瘟熱、狂犬病、犬細(xì)小病毒病三聯(lián)弱毒活疫苗毒種，其特征在于犬瘟熱弱毒毒種屬副粘病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒屬(Morbilliviridae)犬瘟熱病毒(Caninedistemper virus)、編號(hào)為CDV-FAC株；狂犬病弱毒毒種屬?gòu)棤畈《究?Rhabdoviridae)狂犬病病毒屬(Lyssa virus，or Rabies virus group)狂犬病毒(Rahies virus)、編號(hào)為CTNB12；犬細(xì)小病毒弱毒毒種屬細(xì)小病毒科，又名微小病毒科(Pavoviridae)細(xì)小病毒屬，又名微小病毒屬(Parvovirus)，犬細(xì)小病毒(Canine Parvovirus)、編號(hào)為A2-CPV；這三種毒種的保藏號(hào)為CGMCC NO 0222。
2.一種犬瘟熱、狂犬病、犬細(xì)小病毒病三聯(lián)弱毒活疫苗，其特征在于該三聯(lián)弱毒活疫苗含有犬瘟熱弱毒大于103.5TCID50/劑量，狂犬病弱毒大于105.0PFU/劑量、犬細(xì)小病毒弱毒大于103.5TCID50/劑量。
3.一種犬瘟熱、狂犬病、犬細(xì)小病毒病三聯(lián)弱毒活疫苗的制造方法，包括三種毒種標(biāo)準(zhǔn)、毒種傳代及保存、疫苗制造配比及凍干檢驗(yàn)，其特征在于將分別生產(chǎn)犬瘟熱、狂犬病、犬細(xì)小病毒弱毒活疫苗，然后進(jìn)行病毒滴定，依所含免疫劑量，按犬瘟熱弱毒大于103.5TCID50，狂犬病弱毒大于105.0PFU、犬細(xì)小病毒弱毒大于103.5TCID50混合，過(guò)濾，凍干制成三聯(lián)苗。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制造方法，其特征在于狂犬病弱毒的培養(yǎng)為將經(jīng)無(wú)菌，支原體檢驗(yàn)陰性的正常成片的BHK21細(xì)胞消化，加原培養(yǎng)液的3—5倍的培養(yǎng)液量，調(diào)pH至7.6—7.8，并加培養(yǎng)液2％的病毒，混勻分裝于細(xì)胞瓶?jī)?nèi)或發(fā)酵罐內(nèi)微載體培養(yǎng)，33℃-37℃培養(yǎng)3-10天收上清，再換維持液3天后再收毒一次；收毒時(shí)作無(wú)菌檢驗(yàn)和用蝕斑法進(jìn)行病毒滴定，收獲液存于-20℃，保存時(shí)間不超過(guò)3個(gè)月。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制造方法，其特征在于狂犬病弱毒毒種的傳代及保存為毒種傳代用BHK21細(xì)胞，BHK21細(xì)胞為經(jīng)支原體、外源因子檢驗(yàn)合格的150代以內(nèi)細(xì)胞，長(zhǎng)成單層后，換維持液，維持液加2％的病毒原液，放33℃-37℃培養(yǎng)3-10天收毒，將收獲的病毒液加等量的保護(hù)劑(脫胎牛奶、小牛血清、6％明膠、6％麥芽糖均可)，凍干，并進(jìn)行檢驗(yàn)，達(dá)到毒種標(biāo)準(zhǔn)即可存于-30℃，每3年傳代一次。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制造方法，其特征在于犬細(xì)小病毒弱毒的培養(yǎng)為選健康新生仔貓，無(wú)菌取腎，制成單層細(xì)胞于培養(yǎng)瓶中或發(fā)酵罐中，pH值為7.4—7.6，培養(yǎng)2-3天，接種犬細(xì)小病毒弱毒，A2-CPV的繁殖條件為pH7.2-7.6，35-38℃，培養(yǎng)3-6天，待40％以上細(xì)胞發(fā)生病變時(shí)凍融收毒或收上清；最佳條件為pH7.4，溫度37℃，培養(yǎng)4-5天待75％以上細(xì)胞發(fā)生病變時(shí)凍融3次收毒；保存于-20℃以下，保存時(shí)間不能超過(guò)3個(gè)月，如超過(guò)則凍干前應(yīng)重新滴定病毒，液氮保存可存10年，每10年傳代一次。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制造方法，其特征在于犬細(xì)小病毒弱毒毒種的傳代及保存為毒種傳代用A72細(xì)胞，常規(guī)將A72細(xì)胞培養(yǎng)成單層，接種維持液量2％的犬細(xì)小病毒36℃吸附1小時(shí)，加維持液37℃培養(yǎng)4—5天，待70％以上細(xì)胞發(fā)生病變時(shí)凍融收毒，經(jīng)檢無(wú)菌，加等量5％蔗糖脫脂奶凍干，并檢驗(yàn)，達(dá)到毒種標(biāo)準(zhǔn)即存于-30℃，每3年傳代一次。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制造方法，其特征在于犬瘟熱弱毒的培養(yǎng)、傳代及保存為選6-15日齡發(fā)育良好SPF雞胚，制備雞成纖維細(xì)胞，于細(xì)胞培養(yǎng)瓶或發(fā)酵罐中，36-39℃培養(yǎng)2-10天，吸附接種病毒，30-35℃培養(yǎng)2-10天，待40％以上細(xì)胞發(fā)生病變時(shí)，將細(xì)胞移至2-8℃過(guò)夜，收上清，與等量保護(hù)劑混合凍干，并檢驗(yàn)達(dá)到毒種標(biāo)準(zhǔn)放-30℃保存，每三年傳代一次；最佳條件為33℃，培養(yǎng)2-3天，待70％以上細(xì)胞發(fā)生病變時(shí)，將細(xì)胞移至3-5℃過(guò)夜，反復(fù)搖動(dòng)后收上清，液氮保存可存10年，每10年傳代一次。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制造方法，其特征在于制造凍干疫苗的保護(hù)劑為5％蔗糖脫脂乳、經(jīng)110—116℃滅菌30—40分鐘，經(jīng)檢驗(yàn)無(wú)菌后，并按每毫升加入青霉素100—500單位、鏈霉素100—500微克或慶大霉素100—500單位，用于配苗，最后將疫苗分裝于有三叉膠塞的青瓶中，然后進(jìn)行真空凍干。
全文摘要
一種犬瘟熱、狂犬病、犬細(xì)小病毒病三聯(lián)弱毒活疫苗、毒種及制造，三種毒種的保藏號(hào)為CGMCC NO 0222。該三聯(lián)弱毒活疫苗含有犬瘟熱弱毒大于10
文檔編號(hào)C12N7/04GK1117081SQ95102239
公開(kāi)日1996年2月21日 申請(qǐng)日期1995年3月16日 優(yōu)先權(quán)日1995年3月16日
發(fā)明者鄭海發(fā), 楊培豫, 高云 申請(qǐng)人:高云