減毒的豬流感疫苗及其制備和使用方法
【專利說明】減毒的豬流感疫苗及其制備和使用方法
[0001] 通過引用并入
[0002] 本申請要求于2012年7月17日提交的臨時申請USSN 61/672, 398的優(yōu)先權，且 通過引用將其整體并入本文。 發(fā)明領域
[0003] 本發(fā)明一般設及減毒的病毒疫苗，特別是對豬提供抵抗由豬流感引起的感染/疾 病的廣泛、安全和有效保護的那些疫苗。本發(fā)明進一步設及產(chǎn)生減毒病毒的方法，W及與減 毒病毒的毒力減少相關的核酸變異的鑒定。
[0004] 本發(fā)明相應地設及包含本發(fā)明的病毒例如減毒活病毒的免疫原性組合物或疫苗 組合物。病毒還可W在組合物中被滅活；但病毒是減毒的活豬流感可W是有利的。本發(fā)明 因此進一步設及用于制備和/或配制此類組合物的方法；例如在合適培養(yǎng)基上或中培養(yǎng)或 生長或繁殖病毒，收獲病毒，任選地滅活病毒，且任選地與合適的獸醫(yī)學或藥學可接受的運 載體、賦形劑、稀釋劑或媒介物和/或佐劑和/或穩(wěn)定劑混合。因此，本發(fā)明還設及病毒在 配制此類組合物中的用途。
[000引發(fā)明背景
[0006] 流感病毒具有逃避針對介導病毒進入的血凝素的（HA)的宿主體液免疫的許 多機制?；蚪M區(qū)段的重排可W導致抗原轉(zhuǎn)換，同時突變的逐步累積導致遺傳漂變 值esse化erger U等人，1978，Schild G等人，1974)。除了可W影響預先存在的抗體識別突 變型HA的能力的HA抗原性表位中的突變之外，HA的N聯(lián)糖基化中的突變可W通過改變圍 繞HA的寡糖層來促進抗體識別的病毒逃避（Schulze IT，1997)。聚糖殘基可W限制一些抗 體與其表位的結合，導致在稱為聚糖屏蔽的現(xiàn)象中的抗體識別和免疫原性的喪失（Wanzeck K等人，2011，Wei C-J等人，2010)。另外，突變和遺傳漂變優(yōu)先在不受聚糖保護的HA球狀 頭部中的位置處發(fā)生值as SR等人，2010)。聚糖殘基還影響受體結合且因此可W影響病毒 復制動力學。
[0007] 流感病毒的進化經(jīng)常包括糖基化位點的數(shù)目和位置的修飾（Long J等人，2011)。 對于H3N2病毒，糖基化位點的數(shù)目在過去40年已從兩個增加到十個（4)。然而，增加糖基 化的HA已與小鼠中的毒力減少和降低的病毒適合度關聯(lián)值as SR等人，2011，Vigerust DJ 等人，2007)。雖然增加糖基化可W使HA屏蔽中和抗體，但關于細胞受體的病毒親和力強制 性減少（Abe Y等人，2004,化S SR等人，2011)。此外，需要HA或神經(jīng)氨酸酶（NA)中的代償 突變W平衡受體結合和釋放活性（Wagner R等人，2000)。M中的該些補償突變已與對NA 抑制劑的天然抗性的獲得相關化ensley SE等人，2011)。
[000引豬流感病毒的眾多遺傳和抗原上不同的譜系同時在豬中循環(huán)，包括0、丫和 5 -簇化N1和化N2病毒，W及冊N2亞型（Lorusso A等人，2012)。5 -簇最初再分成兩個 亞簇（5-I和5-II)，然而，最近的工作證實代表至少S個抗原上不同的組的五個不同遺 傳亞簇（5-A、5-B、5-C、5-D、5-E)化auseBM等人，2011，VincentAL等人，2009)。
[0009] 雖然當疫苗株匹配野外攻擊病毒時，被殺死的病毒疫苗是有效的，但流感的快速 突變率需要頻繁毒株變化，w確保在疫苗株和循環(huán)病毒之間的遺傳和抗原匹配。另外，豬中 共循環(huán)的多重亞型和譜系經(jīng)常要求五種或更多種疫苗株，W便包括每個類型的代表。引發(fā) 廣譜免疫的單一活疫苗提供在豬衛(wèi)生計劃中的顯著進展。
[0010] 發(fā)明概述
[0011] 本發(fā)明的目的是提供減毒疫苗W及治療和預防豬流感的感染的方法。
[0012] 在一個實施方案中，疫苗包含減毒的流感病毒，其已經(jīng)修飾為表達相對于其親本 株具有另外糖基化位點的ha基因。
[001引在特定實施方案中，HA基因和/或基因產(chǎn)物具有與SEQ ID NOs:17和21 ;SEQ ID NOs:17和23 ;SEQ ID NOs:18和22 ;或SEQ ID NOs:18和24之間存在的相同的修飾。在另 外一個實施方案中，HA基因和/或基因產(chǎn)物具有5種修飾中的至少1種。在更特定的實施 方案中，HA基因和/或基因產(chǎn)物具有4或5種修飾，導致相對于親本HA基因產(chǎn)物的+4和 巧個糖基化位點。
[0014] 本發(fā)明的另一個目的是提供用于反向遺傳學系統(tǒng)中的cDNA和/或質(zhì)粒，用于產(chǎn)生 根據(jù)本公開內(nèi)容的減毒流感。在一個實施方案中，cDNA和/或質(zhì)粒中的至少一種包含相對 于如SEQ ID NO: 18所示的序列具有增加數(shù)目的糖基化位點的HA序列。
[00巧]在特定實施方案中，HA序列如SEQ ID NO: 21或23中所示。
[0016] 本發(fā)明進一步設及新的流感減毒株，其提供安全、有效和廣泛的保護性免疫。相對 于親本流感毒株，減毒株可W具有由其HA基因編碼的另外的糖基化位點和/或假定糖基化 位點，所述糖基化位點的存在與毒力降低相關。
[0017] 因此，本發(fā)明提供了相對于野生型/親本病毒，在一種或多種核酸序列中包含突 變的突變型病毒，所述突變致使突變型病毒相對于親本病毒是減毒的，所述親本病毒包含 編碼野生型HA蛋白質(zhì)的核酸。如本文定義的，"野生型'輸?shù)鞍踪|(zhì)是相對于如SEQ ID N0:18 所示的序列，具有相同數(shù)目的糖基化位點和/或假定糖基化位點的蛋白質(zhì)。
[0018] 在特定實施方案中，突變型病毒包含vRNA核酸序列，其對應于（即，是反向互補的 且具有尿喀晚代替胸巧）SEQ ID NO: 21或23所示的DNA序列，所述DNA序列分別編碼如 SEQ ID N0:22或24所示的膚，并且促使突變型病毒相對于劇毒野生型/親本病毒是減毒的 /無毒力的。
[0019] 如本文定義的，術語"基因"將W廣義使用，并且應涵蓋編碼和非編碼序列兩者 (即上游和下游調(diào)節(jié)序列、啟動子、5 V3'UTR、內(nèi)含子和外顯子）。當預期僅提及基因的編碼 序列時，術語"基因的編碼序列"或"CDS"在本公開內(nèi)容自始至終可互換使用。當討論特定 核酸例如如SEQ ID NO: 17所示的序列（親本病毒cRNA "有義"鏈的DNA序列等價物）時， 技術人員將立即擁有該序列的所有可衍生形式〇111?歴、￥1?歴、〇1?歴、0臟、蛋白質(zhì)等）。例如， 流感病毒是負單鏈RNA病毒（ssRNA)。為了復制，它的負ssRNA(本文定義為％RNA")必須 轉(zhuǎn)錄為正或有義RNA (本文定義為"cRNA")。宿主細胞機制共選擇W使用cRNA產(chǎn)生病毒蛋 白質(zhì)和vRNA。技術人員使用眾所周知的遺傳密碼可W照常規(guī)由DNA序列衍生vRNA、cRNA和 膚序列。
[0020] 在特定實施方案中，減毒疫苗包含佐劑。佐劑可W是與單獨的減毒疫苗相比較，增 加和/或增強引發(fā)的免疫原性的任何物質(zhì)。粘膜佐劑包括殼聚糖及其衍生物對于公開的經(jīng) 口減毒疫苗特別有用。
[0021] 本發(fā)明進一步提供了用于誘導針對流感的免疫學（或免疫原性）或保護性應答的 方法，W及用于預防或治療流感或由流感引起的疾病狀態(tài)的方法，其包括給有此需要的動 物施用所述減毒病毒或包含所述減毒病毒的組合物。
[0022] 還提供了包含至少所述減毒的流感毒株和使用說明書的試劑盒。
[0023] 該些及其他實施方案得到公開或由下述詳述的顯而易見的且由其涵蓋。
[0024] 附圖簡述
[0025] 對于本領域普通技術人員，本發(fā)明的完全和披露的公開內(nèi)容包括其最佳模式在說 明書的其余部分包括對附圖的提及中更具體地闡述，在所述附圖中
[0026] 圖1表示使用反向遺傳學制備的病毒的基因型；
[0027] 圖2是在SEQ ID NO:18(親本流感病毒的HA蛋白質(zhì)）和SEQ ID NO:22(n巧糖基 化突變型的HA蛋白質(zhì)）之間的氨基酸比對；
[002引圖3是在親本和糖基化突變型流感病毒的培養(yǎng)細胞中的生長曲線圖，所述糖基化 突變型流感病毒相對于親本在其HA基因中具有1至5個另外的糖基化位點；
[0029] 圖4是本公開內(nèi)容的SEQ ID的表格列表。
[0030] 發(fā)明詳述
[0031] 本發(fā)明提供了設及對微生物例如病毒（例如流感）減毒的核巧酸序列和基因，由 核巧酸序列編碼的產(chǎn)物（例如蛋白質(zhì)、抗原、免疫原、表位），用于產(chǎn)生此類核巧酸序列、產(chǎn) 物、微生物的方法及其例如用于制備疫苗或免疫原性組合物或者引起免疫學或免疫應答或 者作為載體例如作為表達載體（例如體外或體內(nèi)表達載體）的用途。
[0032] 在微生物的核巧酸序列和基因內(nèi)引入的突變產(chǎn)生新型和非顯而易見的減毒突變 體。該些突變體用于產(chǎn)生減毒的活免疫原性組合物或具有高度免疫原性的減毒活疫苗。
[0033] 突變的鑒定提供新型和非顯而易見的核巧酸序列和基因，W及由核巧酸序列和基 因編碼的新型和非顯而易見的基因產(chǎn)物。
[0034] 在一個實施方案中，本發(fā)明提供了減毒的高糖基化豬流感毒株，其能夠在豬中提 供針對流感或由流感引起的疾病的安全有效的免疫應答。在一個實施方案中，毒株可W編 碼相對于劇毒親本株具有至少1個另外的糖基化位點的HA基因。
[0035] 在另一個實施方案中，減毒株可W編碼相對于劇毒親本株具有4或5個另外糖基 化位點的HA基因。在特定實施方案中，毒株糖基化位點選自S71N、K90N、L173T、P287T和 K294T，其中氨基酸變化的位置是基于具有如SEQ ID NO: 18所示的序列的HA基因。
[0036] 在一個實施方案中，通過減毒的流感毒株產(chǎn)生的HA蛋白質(zhì)具有如SEQ ID NO:22 所示的序列或與SEQ ID N0:22具有至少90%同源性的序列，條件是下述位置具有下述氨基 酸；71N、90N、173T、287T 和 294T。
[0037] 在另一個實施方案中，減毒流感產(chǎn)生具有如SEQ ID N0:24所示的序列或與SEQ ID N0:24具有至少90%同源性的序列的HA蛋白質(zhì)，條件是下述位置具有下述氨基酸；71N、 90N、173T、287T。
[003引在另一個方面，本發(fā)明提供了包含減毒的流感毒株的免疫原性組合物，其編碼高 糖基化的HA蛋白質(zhì)。在一個實施方案中，該組合物可W進一步包含藥學或獸醫(yī)學可接受的 媒介物、稀釋劑或賦形劑。
[0039] 在一個實施方案中，該組合物在豬中提供針對劇毒豬流