專利名稱：：含有肽聚糖的糖綴合物疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明大體來說涉及用于治療細(xì)菌感染的疫苗。具體地說，本發(fā)明提供糖綴合物疫苗，其包含治療有效量的與載體蛋白結(jié)合的莢膜多糖，其中所述莢膜多糖包含一定量的能夠增強(qiáng)所述疫苗的性質(zhì)的肽聚糖，這通過例如莢膜多糖與所述載體蛋白的提高的結(jié)合效率或通過所述疫苗的提高的免疫原性證明。
背景技術(shù)：
：肽聚糖(PG)是細(xì)菌細(xì)胞壁獨有的雜聚合物并且由N-乙酰胺基葡萄糖(GlcNAc)與N-乙酰胞壁酸(MurNAc)的交替單元的聚糖主鏈組成，其中短鏈肽連接到所述MurNAc部分的乳?；Ｔ诖蠖鄶?shù)細(xì)菌種屬中，糖通過p-l，4-糖苷鍵連接，并且所述肽的一般結(jié)構(gòu)是L-丙氨酸-D-谷氨酸-二氨基酸-D-丙氨酸-D-丙氨酸。3位上的雙堿性氨基酸(上式中的"二氨基酸")通常是革蘭氏陽性球菌中的賴氨酸和革蘭氏陽性桿菌和革蘭氏陰性細(xì)菌中的二氨基庚二酸(DAP)。位于不同聚糖鏈上的氨基酸間的肽交聯(lián)鍵使得形成復(fù)雜的三維大分子，所述大分子形成細(xì)菌細(xì)胞壁的不可缺少的一部分。所述聚合性聚糖的牢固布置和與肽的進(jìn)一步交聯(lián)一起對于決定細(xì)菌細(xì)胞形狀并且從而維持細(xì)菌的物理完整性起重要作用。不同細(xì)菌種屬間在肽聚糖結(jié)構(gòu)上可能略有變化，大部分變化歸屬于交聯(lián)的肽。大量報告闡述了肽聚糖在動物模型中的致病效應(yīng)。因此，需要將肽聚糖從由細(xì)菌細(xì)胞壁制備的疫苗中除去。舉例來說，Simelyte等人，/"/e"/挑m冊.68:3535-40(2000)揭示，革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞壁的粗制細(xì)胞壁制劑當(dāng)經(jīng)腹膜腔內(nèi)加至大鼠中時可導(dǎo)致慢性關(guān)節(jié)炎。類似地，Li等人M/ecf./mm肌69:5883-91(2001)報導(dǎo)，肽聚糖的關(guān)節(jié)內(nèi)注射可導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎樣癥狀。Myhre等乂,/n/e"./mm肌72:1311-17(2004)將肽聚糖定性為敗血癥和器官損傷中的主要致病因子。與其態(tài)度類似，Mattsson寧乂，/n/e"./mm"打.70:3033-39(2002)聲稱，肽聚糖是引發(fā)細(xì)菌性敗血病和心內(nèi)膜炎的主要致病因子，同時激活促凝血系統(tǒng)。這些所報告的肽聚糖害效應(yīng)使得所屬領(lǐng)域的傳統(tǒng)研究力量集中在使疫苗和其他醫(yī)藥制劑中的肽聚糖含量降到最低。
發(fā)明內(nèi)容令人吃驚地，本發(fā)明的發(fā)明者已發(fā)現(xiàn)，有利的疫苗性質(zhì)與在包含與載體蛋白結(jié)合的莢膜多糖的糖綴合物疫苗中存在至少最低有效量的肽聚糖有關(guān)。這些優(yōu)點包括，例如，結(jié)合效率提高和免疫原性增強(qiáng)，同時不導(dǎo)致不可耐受的毒性。因此，本發(fā)明的一方面是提供一種疫苗，其包含(A)治療有效量的包含至少一種莢膜多糖和載體蛋白的糖綴合物免疫原，其中所述莢膜多糖包含最低有效量的肽聚糖，及(B)用于所述免疫原的醫(yī)藥上可接受的載劑。在一實施例中，所述莢膜多糖包含一定量的能夠使所述莢膜多糖與所述載體蛋白的結(jié)合效率相對于包含約2%的肽聚糖的莢膜多糖提高例如至少約20%的肽聚糖。在另一實施例中，所述莢膜多糖包含一定量的能夠增強(qiáng)所述疫苗的免疫原性的肽聚糖。在再一實施例中，所述莢膜多糖包含至少約5%的肽聚糖。在某些實施例中，所述糖綴合物免疫原包含一或多種由葡萄球菌(&a;^3^ococc附)表達(dá)的莢膜多糖，例如由金黃色葡萄球菌(5to/7/i;yZococaw表達(dá)的莢膜多糖和/或由表皮葡萄球菌(5te/7/^/oco"w表達(dá)的莢膜多糖。舉例來說，所述莢膜多糖可為5型莢膜多糖、8型莢膜多糖、336莢膜多糖、PS-1莢膜多糖或其組合。在又一實施例中，所述載體蛋白是來自假單胞菌(尸化Wom卵w)的外毒素A、破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素(diphtheriatoxoid)、oc溶血素或Panton-Valentine殺白細(xì)胞素(PVL)。根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供一種治療細(xì)菌感染的方法，其包括施與包含下列的疫苗(A)治療有效量的糖綴合物免疫原，其中(i)所述糖綴合物免疫原包含至少一種莢膜多糖和載體蛋白并且(ii)所述莢膜多糖包含最低有效量的肽聚糖，和(B)用于所述免疫原的醫(yī)藥上可接受的載劑。在一實施例中，所述莢膜多糖包含一定量的能夠使所述莢膜多糖與所述載體蛋白的結(jié)合效率相對于包含約2%的肽聚糖的莢膜多糖提高例如至少約20%的肽聚糖。在另一實施例中，所述莢膜多糖包含一定量的能夠增強(qiáng)所述疫苗的免疫原性的肽聚糖。在一實施例中，所述莢膜多糖包含至少約5%的肽聚糖。根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供一種制備包含糖綴合物免疫原的疫苗的方法，所述糖綴合物免疫原由至少一種莢膜多糖和載體蛋白組成，所述方法包括(A)使至少一種莢膜多糖與載體蛋白結(jié)合，以形成糖綴合物免疫原，其中所述莢膜多糖包含最低有效量的肽聚糖，及(B)將治療有效量的所述糖綴合物免疫原與用于所述免疫原的醫(yī)藥上可接受的載劑一起調(diào)配。在一實施例中，所述莢膜多糖包含一定量的能夠使所述莢膜多糖與所述載體蛋白的結(jié)合效率相對于包含約2%的肽聚糖的莢膜多糖提高例如至少約209b的肽聚糖。在另一實施例中，所述莢膜多糖包含一定量的能夠增強(qiáng)所述疫苗的免疫原性的肽聚糖。在一實施例中，所述莢膜多糖包含至少約5%的肽聚糖。根據(jù)又一方面，本發(fā)明提供一種提高莢膜多糖與載體蛋白的結(jié)合效率的方法，其包括(i)選擇包含一定量的能夠有助于提高所述莢膜多糖與載體蛋白結(jié)合效率的肽聚糖的莢膜多糖，及(ii)使所述莢膜多糖與載體蛋白結(jié)合。在一實施例中，所述莢膜多糖包含一定量的能夠使所述莢膜多糖與所述載體蛋白的結(jié)合效率相對于包含約2%的肽聚糖的莢膜多糖提高至少約20%的肽聚糖。在另一實施例中，所述莢膜多糖包含至少約5%的肽聚糖。根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供一種增強(qiáng)疫苗的免疫原性的方法。所述方法包括(i)選擇包含一定量的有助于增強(qiáng)所述疫苗免疫原性的肽聚糖的莢膜多糖，(ii)使所述莢膜多糖與載體蛋白結(jié)合，以形成糖綴合物免疫原，及(iii)制備包含所述糖綴合物免疫原和醫(yī)藥上可接受載劑的疫苗。在一實施例中，所述莢膜多糖包含至少約5%的肽聚糖。圖1顯示金黃色葡萄球菌8型莢膜多糖的肽聚糖含量與硫醇化間的相關(guān)性。在與載體蛋白結(jié)合前，通過氨基酸分析來分析經(jīng)純化8型莢膜多糖的肽聚糖濃度。使用Ellman分析來測定經(jīng)還原的衍生化多糖的硫醇化比率。具體實施方式如所述，本發(fā)明的發(fā)明者已發(fā)現(xiàn)，存在至少最低有效量的肽聚糖(PG)可賦予包含與載體蛋白結(jié)合的莢膜多糖(CPS)的糖綴合物疫苗以優(yōu)點。本文所用"莢膜多糖"同時包括細(xì)胞壁相關(guān)的和表面多糖抗原。一方面，與CPS相關(guān)的PG的存在可通過(例如)增強(qiáng)CPS的硫醇化而提高CPS與載體蛋白的結(jié)合效率。結(jié)合效率提高可提供多種優(yōu)點，包括提高結(jié)合反應(yīng)的效率(即有更大百分比的反應(yīng)試劑變得結(jié)合)，及CPS與載體蛋白間的交聯(lián)更強(qiáng)。交聯(lián)變強(qiáng)又可提供多種優(yōu)點，包括更大的、免疫原性更強(qiáng)的且更穩(wěn)定的糖綴合物免疫原分子。另一方面，伴隨CPS存在PG可增強(qiáng)糖綴合物疫苗的免疫原性。雖然不欲受任何理論束縛，但本發(fā)明的發(fā)明者認(rèn)為，細(xì)菌多糖抗原與蛋白質(zhì)載體的結(jié)合可改變抗原，使之成為T細(xì)胞依賴性免疫原，從而增強(qiáng)疫苗效力。因此，提高CPS與載體蛋白的結(jié)合效率可增強(qiáng)疫苗的免疫原性。因此，本發(fā)明的疫苗的免疫原性要比具有更低PG含量的現(xiàn)有技術(shù)調(diào)配物的強(qiáng)。因此，本發(fā)明提供包含PG的新穎疫苗調(diào)配物以及制備和使用所述疫苗調(diào)配物的方法。成分本發(fā)明提供一種包含治療有效量的糖綴合物免疫原和用于所述免疫原的醫(yī)藥上可接受載劑的疫苗，所述糖綴合物免疫原包含至少一種CPS和載體蛋白，其中所述CPS包含至少最低有效量的PG。雖然不欲受任何理論限制，但認(rèn)為如本文所述獲得的CPS包含共價結(jié)合到所述CPS的PG分子。或者，所述CPS分子可經(jīng)由其他作用力與PG分子緊密結(jié)合。微多麟嚴(yán),)如上文所述，本文所用術(shù)語"莢膜多糖"同時包括細(xì)胞壁相關(guān)和表面多糖抗原。根據(jù)一實施例，所述CPS由葡萄球菌表達(dá)，例如金黃色葡萄球菌或表皮葡萄球菌。例示性金黃色葡萄球菌CPS包括5型莢膜多糖、8型莢膜多糖和336型莢膜多糖。例示性表皮葡萄球菌抗原包括PS-1莢膜多糖。本發(fā)明的疫苗可包含這些類型CPS中的一種或多種。根據(jù)本發(fā)明也可使用其他CPS，例如其他細(xì)菌性莢膜多糖細(xì)胞壁抗原，這些CPS可單獨使用或與其他抗原(例如上述葡萄球菌抗原)組合。調(diào)査顯示，約85-90%的金黃色葡萄球菌分離物為5型或8型CPS。接種有同時含5型和8型莢膜多糖抗原的疫苗的正常個體可抵抗85-90%的金黃色葡萄球菌菌株導(dǎo)致的感染。因此，根據(jù)本發(fā)明一實施例，所述疫苗包含5型和8型CPS二者的糖綴合物。雖然金黃色葡萄球菌5型和8型CPS的化學(xué)組成完全相同，但結(jié)構(gòu)卻不同。二者均為由N-乙?；?甘露糖醛酸(MamNAcAPp)和N-乙?；?巖藻糖胺(FucNAcp)以1:2的比率構(gòu)成的聚合物，但它們在這些糖間的糖苷鍵以及O-乙?；奈恢煤统潭确矫娌煌?。Moreau等人，Carbohydr.Res.,201(2):285-97(1990);FournierfVz對e"rM/cto&oA,138(5):561-7(1987)。二者在其重復(fù)單元中均具有FucNAcp并且均具有ManNAcAp，此可用于引入巰基。5型和8型多糖抗原的結(jié)構(gòu)己由Moreau等「乂#Ca力o/i;ydr.201:285(1990)中及由Fournier等人在h/e"./mm.45:87(1984)中闡明并且于下文顯示5型—4)-卩-D-Man/NAcA(30Ac)-(1—4)-a-L-Fuc/NAc-(1—3)-p-D-FucpNAc-(l—8型—3)-卩-D-ManpNAcA(40Ac)-(1—3)-a-L-FucpNAc-(1—3)-p-D-FucpNAc-(l—盡管結(jié)構(gòu)類似，但尚未在這兩種類型間發(fā)現(xiàn)可證明的免疫學(xué)交叉反應(yīng)性。另一可用于本發(fā)明疫苗中的金黃色葡萄球菌抗原為在美國專利第5,770,208號和第6,194,161號中闡述的336CPS。此帶負(fù)電荷的抗原包含GlcNAc和1，5-聚(磷酸核糖醇)組分并且不含O-乙酰基。一例示性336抗原特異性地與以ATCC55804存放的金黃色葡萄球菌366型的抗體結(jié)合。載有此抗原的金黃色葡萄球菌菌株幾乎占在臨床上重要的非5型或8型菌株的金黃色葡萄球菌菌株的全部。因此，本發(fā)明尤其涵蓋分別包含5型、8型和366CPS的糖綴合物的疫苗。這樣的疫苗可對抗由幾乎100%的金黃色葡萄球菌菌株導(dǎo)致的感染。有許多在臨床上具有重要性的表皮葡萄球菌菌株。用于治療或預(yù)防由表皮葡萄球菌菌株導(dǎo)致的感染的疫苗可包含一含有在美國專利第5，961，975號和第5,866,140號中揭示的l型抗原的結(jié)合物。此抗原也稱為PS-1，是可通過包含下列步驟的方法獲得的酸性多糖抗原生長使抗ATCC55254抗血清凝聚的金黃色葡萄球菌分離菌株(I型分離菌株)的細(xì)胞，自所述細(xì)胞提取多糖抗原，以產(chǎn)生多糖抗原的粗提取物，純化此粗提取物以產(chǎn)生含有至少最低有效量的肽聚糖的經(jīng)純化抗原，如下文所更詳細(xì)闡述；將所述經(jīng)純化的抗原加到分離柱上并用NaCl梯度洗脫；及使用對I型分離菌株具有特異性的抗體識別含有所述多糖抗原的洗脫組分。另一用于本發(fā)明疫苗中的葡萄球菌抗原在WO00/56357中闡述。此抗原于oc構(gòu)造中包含氨基酸和N-乙醯基化己糖胺，不含O-乙醯基且不含己糖。其特異性地與以ATCC202176儲存的葡萄球菌菌株抗體結(jié)合。對所述抗原的氨基酸分析顯示存在摩爾比率約為39:25:16:10:7的絲氨酸、丙氨酸、天冬氨酸/天冬酰胺、纈氨酸和蘇氨酸。氨基酸構(gòu)成所述抗原分子的約32重量％。賽條々細(xì)菌性莢膜多糖抗原通常是弱免疫原。因此，其通常與載體蛋白結(jié)合以增強(qiáng)其免疫原性。根據(jù)本發(fā)明的適宜載體蛋白包括破傷風(fēng)類毒素和白喉類毒素以及它們的重組產(chǎn)生的基因去毒變體、葡萄球菌外毒素或類毒素、綠膿假單胞菌(Ae"必mo"^外毒素A或其衍生物，包括綠膿假單胞菌外毒素A的重組產(chǎn)生的無毒突變菌株，如于例如Fattom等乂,/打/am/Zmm.61:1023-32(1993)中闡述，以及適合用作免疫載體的其他蛋白質(zhì)、肽和病毒樣顆粒。其他適用于本發(fā)明中的載體蛋白包括金黃色葡萄球菌外毒素，例如溶血素(a毒素)和Panton-Valentine殺白細(xì)胞素。外毒素A是來自綠膿假單胞菌的主要致病因子，參見Callahan等人,/n/e"./m/mm.43:1019-26(1984)，并且可產(chǎn)生作為本發(fā)明疫苗的副產(chǎn)物的毒素中和抗體。這樣，本文所述的包含與外毒素A結(jié)合的葡萄球菌CPS的疫苗可用于有假單胞菌及葡萄球菌感染風(fēng)險的患者。也可參見Pollack寧yl,/CZZ"./we比63:276-86(1979)，以及Cryz寧乂，iev./"/e".9(Suppl5):S644-S649(1987)。此蛋白質(zhì)的重組無毒形式(rEPA)通過在酶活性位點缺失553位處的谷氨酸獲得。Lukac等人，/打/e"./mm肌.56.'W95-站(79SS〗。此缺失使得整個蛋白質(zhì)不具有酶活性，但仍維持天然毒素的抗原性。因此，在本發(fā)明內(nèi)的疫苗可包含含有rEPA作為載體蛋白的糖綴合物。,覆麟虔嫌體根據(jù)本發(fā)明，疫苗可含有由CPS構(gòu)成的糖綴合物免疫原，所述CPS與載體蛋白結(jié)合并且含有至少最低有效量的PG。PG的"最低有效量"是能夠改進(jìn)所述疫苗的性質(zhì)的量。在一實施例中，改進(jìn)的性質(zhì)表現(xiàn)為提高的結(jié)合效率，并且所述"最低有效量"表示足以增進(jìn)CPS與載體蛋白的結(jié)合的PG量。在另一實施例中，改進(jìn)的情況表現(xiàn)為增強(qiáng)的免疫的性，并且所述短語"最低有效量"表示足以增強(qiáng)所述疫苗的免疫原性的PG量。舉例來說，所述糖綴合物免疫原可包含含有一定量的PG的CPS，所述PG的量能夠使所述CPS與所述載體蛋白的結(jié)合效率相對于包含約2%PG的CPS增加例如至少約20%(g卩，結(jié)合效率是對照CPS的1.20倍)?；蛘?，所述糖綴合物免疫原可包含含有一定量的能夠增強(qiáng)所述疫苗免疫原性的PG的CPS。當(dāng)然，所述糖綴合物免疫原可包含含有一定量的能夠同時提高結(jié)合效率和所述疫苗免疫原性的PG的CPS。本文所述短語"結(jié)合效率"涉及CPS與載體蛋白的結(jié)合。結(jié)合效率提高可表現(xiàn)為在結(jié)合過程期間變得與載體蛋白結(jié)合的CPS的百分比增大。舉例來說，根據(jù)本發(fā)明，下述結(jié)合過程使至少50免的CPS分子與載體蛋白結(jié)合?；蛘?，結(jié)合效率提高可表現(xiàn)為CPS與載體蛋白間的交聯(lián)增強(qiáng)。交聯(lián)增強(qiáng)通常產(chǎn)生更大的糖綴合物免疫原分子，其通常展示出更強(qiáng)的免疫原性。另外，交聯(lián)增強(qiáng)通常產(chǎn)生更穩(wěn)定的糖綴合物免疫原分子。給定CPS制劑的結(jié)合效率可通過業(yè)內(nèi)熟知的方法測定，包括下文所闡述以及實例中所說明的方法。本文中所用結(jié)合效率可通過測量CPS的硫醇效率測定，如下文和圖l中所說明。因此，本文中提供的PG"最低有效量"的定義包括足以提高CPS的硫醇化的PG的量。舉例來說，所述糖綴合物免疫原可包含含有一定量的PG的CPS，所述PG的量能夠使所述CPS的硫醇化效率相對于含有約2%PG的CPS提高至少約20%(即硫醇化效率是對照CPS的1.20倍)。給定疫苗的免疫原性可通過業(yè)內(nèi)熟知的方法測定，包括下文所闡述以及實例中所說明的方法。CPS的PG含量可以某些氨基酸的w/w%表示，所述w/w%可通過如下進(jìn)行的氨基酸分析(AAA)測定將lmg/mL的在水中的經(jīng)純化CPS試樣用氣相氫氯酸水解。將重構(gòu)的主要和次要氨基酸轉(zhuǎn)化成在395nm處發(fā)出強(qiáng)熒光的穩(wěn)定熒光衍生物。通過反相HPLC對重懸浮的蛋白質(zhì)水解物實施分析。借助外部和內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)定量所述氨基酸。存在于所述多糖溶液中的氨基酸源于(l)PG(Ala、Glx、Gly和Lys殘基)和(2)殘余蛋白質(zhì)(Arg、Asx、Ile、Leu、Met、Phe、Ser、Thr、Thy、Val、His禾nPro殘基)。有兩種氨基酸(Cys和Trp)未加以定量，因此未報導(dǎo)。與PG和殘余蛋白質(zhì)有關(guān)的氨基酸的濃度使用以下公式報導(dǎo)為相對于所述CPS的質(zhì)量百分比(Gln/Glu)+(Gly)+(Ala)+(Lys)=(PG)〖PG〗xioo-。/。肽聚糖[cPS〗H氨基酸)=(肽)，(肽)cpS-(PG)/(cPS)X100=%RP其中[蛋白質(zhì)]=通過AAA獲得的試樣蛋白質(zhì)濃度(mg/mL)[PG]=計算得到的試樣肽聚糖含量(mg/mL)[CPS]=已知的試樣多糖濃度(mg/mL)(肽)eps=總肽濃度%RP=殘余蛋白質(zhì)(％)在一實施例中，所述CPS包含至少約5%PG，例如至少5呢PG，包括至少約7%PG，至少約9%PG和至少約11%PG。其他有效的PG量為至少約13%PG、至少約15%PG、至少約17%PG、至少約19%PG、至少約21%PG、至少約23%PG、至少約25%PG和至少約27%PG。短語"至少約"包括在規(guī)定量的以上或以下的1%之內(nèi)的PG百分比。因此，"至少約5%"包括4-6%PG。短語"至少"包括等于或大于規(guī)定量的PG百分比。因此，"至少5%"意指5呢或更多的PG。舉例來說，本發(fā)明涵蓋一種包含糖綴合物免疫原和醫(yī)藥上可接受載劑的疫苗，所述糖綴合物免疫原包含至少一種莢膜多糖和載體蛋白，其中所述莢膜多糖以所述莢膜多糖的重量計包含至少約5%(W/W)肽聚糖，并且其中所述載體蛋白為OC溶血素、Panton-Valentine殺白細(xì)胞素、來自假單胞菌的外毒素A、破傷風(fēng)類毒素或白喉類毒素。在本發(fā)明另一實施例中，所述疫苗包含與例如重組外蛋白A(rEPA)等無毒載體蛋白結(jié)合的兩種或更多種臨床上重要CPS型(例如5型、8型和/或336金黃色葡萄球菌)的糖綴合物。在一個這樣的實施例中，至少一種所述CPS抗原包含至少最低有效量的PG,例如如上所述測定的至少5呢的PG。在另一這樣的實施例中，每一CPS抗原包含至少最低有效量的PG,例如5免的PG。在又一實施例中，整個所述糖綴合物包含最低有效量的PG，例如至少59b總的PG含量，這是以全部CPS抗原的總重計。選擇最低有效量的PG可能需要對由PG導(dǎo)致的毒性與由PG提供的提高的疫苗功效(即提高的結(jié)合效率和免疫原性)加以平衡。疫苗領(lǐng)域特有的要求是需要對毒性和功效加以平衡，并且所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員在給定環(huán)境下可通過常規(guī)實驗找出此平衡。毒性可通過上述例如將注意力集中在所報導(dǎo)的PG致病效應(yīng)上的習(xí)知技術(shù)來測定。功效同樣可根據(jù)已知的方法測定，如以下實例中所說明。因此，功效可以免疫原性即誘發(fā)抗體產(chǎn)生的能力或以提高的結(jié)合效率即增強(qiáng)CPS與載體蛋白結(jié)合的能力來度量。有效量的PG可提供臨床醫(yī)師將認(rèn)為在毒理上可耐受但仍有效的糖綴合物疫苗。舉例來說，臨床醫(yī)師可能發(fā)現(xiàn)本發(fā)明疫苗(其包含PG含量介于至少約5%至并且包括至少約27%之間、例如至少約19免的CPS)可提供提高的功效(即提高的結(jié)合效率和/或免疫性)而不展示出不可接受的毒性作用。方法本發(fā)明也提供制備本發(fā)明糖綴合物疫苗的方法和使用所述疫苗的方法。本發(fā)明具體地闡述提高CPS與載體蛋白的結(jié)合效率的方法、增強(qiáng)糖綴合物疫苗的免疫原性的方法以及治療或預(yù)防細(xì)菌感染的方法?？vCPS微毅鄉(xiāng)方敘〃被灘一方面，本發(fā)明提供一種制備包含具有至少最低有效量PG的CPS的糖綴合物疫苗的方法。所述方法包括使至少一種CPS抗原與載體蛋白結(jié)合而形成糖綴合物免疫原，其中所述CPS抗原包含至少最低有效量的PG。將治療有效量的所述糖綴合物免疫原與用于所述免疫原的醫(yī)藥上可接受的載劑一起調(diào)配以產(chǎn)生所述疫苗。在一實施例中，PG的量能夠使結(jié)合效率相對于包含2%PG的CPS提高(例如)至少約20%。在另一實施例中，PG的量能夠提高所述疫苗的免疫原性。在另一實施例中，所述CPS包含至少約5%的PG。舉例來說，本文闡述一種制備包含糖綴合物免疫原和醫(yī)藥上可接受載劑的疫苗的方法，所述糖綴合物免疫原包含至少一種CPS和載體蛋白，其中所述莢膜多糖包含量低有效量的PG，且其中所述載體蛋白是oc溶血素、Panton-Valentine殺白細(xì)胞素、來自假單胞菌的外毒素A、破傷風(fēng)類毒素或白喉類毒素。在一實施例中，以所述CPS的重量計，PG的最低有效量是至少約59fcPG。另一方面，本發(fā)明提供一種增強(qiáng)疫苗的免疫原性的方法。所述方法包括，選擇具有最低有效量PG的CPS以有助于增強(qiáng)所述疫苗的免疫原性，及使所述CPS與載體蛋白結(jié)合以形成糖綴合物免疫原。將治療有效量的所述糖綴合物免疫原與用于所述免疫原的醫(yī)藥上可接受的載劑一起調(diào)配以產(chǎn)生所述疫苗。在一實施例中，所述CPS包含至少約5免的PG。在另一方面，本發(fā)明提供一種提高CPS與載體蛋白的結(jié)合效率的方法。所述方法包括，選擇具有最低有效量PG的CPS以有助于提高結(jié)合效率，及使所述CPS與載體蛋白結(jié)合。在一實施例中，PG的量能夠使結(jié)合效率相對于包含2%PG的CPS提高例如至少約20%。在另一實施例中，所述CPS包含至少約5免PG。適用于這些方法中的經(jīng)純化CPS(包含PG)可通過以下獲得，例如，處理細(xì)菌以釋放CPS，然后純化所述CPS。此方法可包括所述細(xì)菌的酶消化(使用，例如溶葡萄球菌素、RNAse和/或DNAse)和CPS的回收(使用，例如，乙醇沉淀、離心和過濾)。另外的純化步驟可包括透析(例如，以除去痕量的乙醇)、二次酶消化(使用，例如，RNAse、DNAse禾口/或蛋白酶，例如鏈霉蛋白酶E(PronaseE))和透析，進(jìn)一步回收CPS(使用，例如，乙醇沉淀、離心、透析和過濾)，及色譜方法，例如離子交換色譜和/或大小排除/凝膠過濾色譜。所得經(jīng)純化CPS的PG含量可在例如酶消化步驟處控制。舉例來說，調(diào)節(jié)用于自細(xì)菌釋放CPS的溶葡萄球菌素的量可影響所述CPS的PG含量，較低溶葡萄球菌素濃度通常產(chǎn)生較高PG含量。在一實施例中，所述溶葡萄球菌素濃度在約100pg至約1000)ig溶葡萄球菌素/克細(xì)胞團(tuán)之間(約等于約7至約64單位/克細(xì)胞團(tuán))。在另一實施例中，使用約225pg溶葡萄球菌素/克細(xì)胞團(tuán)(大致為約16單位/克細(xì)胞團(tuán))。在可選第二溶葡萄球菌素步驟中可使用類似的溶葡萄球菌素量。在一實施例中，將細(xì)菌培養(yǎng)物發(fā)酵并離心，以獲得細(xì)胞團(tuán)。將溶葡萄球菌素以例如約16單位溶葡萄球菌素/克細(xì)胞的濃度添加，以達(dá)成上述方法的第一酶消化步驟。在另一實施例中，在純化過程期間再一次添加溶葡萄球菌素。舉例來說，在所述第一回收步驟(乙醇沉淀)后可添加約16單位的溶葡萄球菌素/克細(xì)胞團(tuán)。這些溶葡萄球菌素量僅是舉例說明并且可根據(jù)目標(biāo)PG含量加以調(diào)節(jié)。如上所述，增加溶葡萄球菌素濃度通常將產(chǎn)生較低的PG含量，而降低溶葡萄球菌素濃度通常將產(chǎn)生較高PG含量。PG含量也可通過調(diào)節(jié)溶葡萄球菌素酶消化的溫度控制，其中37。C為最優(yōu)溫度，在20至3(TC間的較低溫度可導(dǎo)致酶消化延長。因此，在較低溫度下進(jìn)行溶葡萄球菌素酶消化可產(chǎn)生具有更高PG含量的調(diào)配物。所產(chǎn)生的經(jīng)純化CPS的PG含量也可通過調(diào)節(jié)在所述(可選)第二酶消化步驟中使用的蛋白酶的量來控制，或通過在所述步驟中不使用蛋白酶來控制。舉例來說，通?？筛鶕?jù)美國專利第6,194,161號、Fattom等人于Vaccine13:1288-93(1995)中和Fa加m等人于/M/e"./mmim.58:2367-74(1990)中所述方法自細(xì)菌分離并純化CPS。然而，為了達(dá)成具有至少最低有效量PG的CPS，在酶處理步驟期間使用比這些出版物中闡述的要低的溶葡萄球菌素濃度，例如約7至約64單位/克細(xì)胞團(tuán)。另外，根據(jù)本發(fā)明，可將這些出版物中揭示的鏈霉蛋白酶(蛋白酶)步驟加以修改或略去，以達(dá)成具有至少最低有效量的肽聚糖的CPS。可使用二維NMR對經(jīng)純化的CPS(例如來自金黃色葡萄球菌5型和8型血清型的CPS)加以分析來評測PG含量。舉例來說，NMR譜分析可指示存在丙氨酸、谷氨酰胺/谷氨酸和賴氨酸，它們是主要的PG氨基酸組分。同樣，脫-0-乙酰基化5型和8型CPS的NMR譜可證明存在兩個未經(jīng)取代的羥甲基，這與在PG中存在(3-GlcNAc和(3-MurNAc殘基一致。選擇具有至少最低有效量PG的CPS用于本發(fā)明的方法中。所述經(jīng)純化CPS的PG含量可使用如上文所述的AAA測定。在分離并純化CPS后，使包含至少最低有效量的PG與載體蛋白結(jié)合。在一實施例中，通過業(yè)內(nèi)熟知的方法使所述載體蛋白衍生化以利于結(jié)合。所述CPS抗原也可通過業(yè)內(nèi)熟知的方法衍生化，以利于結(jié)合。舉例來說，可用ADH、胱胺或PDPH來使所述CPS抗原上的經(jīng)活化羧酸根基衍生化，然后可使所述CPS抗原與所述載體蛋白結(jié)合，所述結(jié)合通過以下兩種方式達(dá)成部分酰胺化的抗原與載體蛋白上的羧酸根基之間由碳化二亞胺介導(dǎo)的反應(yīng)，或者硫醇化CPS抗原與SPDP衍生的載體蛋白的二硫化物交換?？墒褂娩寤杌蛩姆鹚醠-氰基-4-二甲基氨基吡啶錄來活化所述抗原上的羥基，然后可使用六碳雙官能間隔劑己二酸二酰肼(ADH)對所述抗原進(jìn)行衍生化(根據(jù)業(yè)內(nèi)習(xí)知的技術(shù)，按照Kohn等人F五5^饑154:209:210(1993)的方法)。在一實施例中，所述CPS的衍生化通過包含硫醇化的方法達(dá)成。這樣的方法可通過用二氨基二硫化物(胱胺)酰胺化CPS實現(xiàn)。此反應(yīng)之所以稱為"硫醇化"是因為它引入二硫化物鍵。所述載體蛋白的酰胺化可使用活化的羧基終端連接劑N-琥珀酰亞胺基3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯并行實施。當(dāng)將通過用二硫蘇糖醇(DTT)還原經(jīng)硫醇化CPS產(chǎn)生的游離硫醇添加到SPDP衍生的載體蛋白以替換所述吡啶硫醇并經(jīng)由所述連接劑在所述CPS與所述載體蛋白間形成二硫化物鍵時，達(dá)成結(jié)合。通常，所產(chǎn)生的糖綴合物通過過濾回收。所述載體蛋白的SPDP衍生化與所述CPS的硫醇化的比率可經(jīng)優(yōu)化，以便保留所述載體蛋白和所述CPS上的抗原決定子，并產(chǎn)生更穩(wěn)定和/或更具有免疫原性的結(jié)合物。也可控制并優(yōu)化游離硫醇的量，以便所選的取代密度可使經(jīng)硫醇化CPS的交聯(lián)降到最低并有利于CPS-蛋白質(zhì)結(jié)合。舉例來說，可以1:1的各反應(yīng)試劑比率進(jìn)行初始衍生化反應(yīng)。所得產(chǎn)物的抗原性可通過用所述產(chǎn)物免疫接種動物并通過常規(guī)方法測定免疫原性反應(yīng)來評價。如果需要，可使用不同的比率的反應(yīng)試劑來進(jìn)行另外的衍生化反應(yīng)，以優(yōu)化所得產(chǎn)物的性質(zhì)。如上所述，所述經(jīng)衍生化的CPS抗原可通過l-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDAC)連接到任何適宜載體蛋白，例如白喉類毒素(DTd)、來自綠膿假單胞菌的重組外蛋白A(rEPA)、破傷風(fēng)類毒素(丁丁(1)、06溶血素、？&111011-Valentine殺白細(xì)胞素(PVL)或另一適宜的載體蛋白。所得的結(jié)合物可通過大小排除色譜法與未結(jié)合的CPS抗原分離。不論使用哪種方法來使所述CPS抗原與所述載體蛋白結(jié)合，所述CPS抗原與所述載體蛋白的共價連接均會顯著增強(qiáng)所述CPS抗原的免疫原性。這已通過在小鼠中在第一次和第二次疫苗強(qiáng)化后以誘發(fā)的抗所述抗原的抗體水平增加形式觀察到。因此，使用本發(fā)明的具有至少最低有效量PG的CPS可提高所述CPS與所述載體蛋白的結(jié)合效率并且可增強(qiáng)所述疫苗的免疫原性?？墒褂肊llman分析來評價通過硫醇效率測量的結(jié)合效率，即通過測量剩余的游離巰基來測定經(jīng)還原的衍生化CPS的硫醇化比率。舉例來說，可通過使經(jīng)還原的衍生化CPS試樣或?qū)φ张c5，5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)在室溫下反應(yīng)5分鐘來定量游離巰基。此反應(yīng)產(chǎn)生混合的二硫化物和2-硝基-5-硫代苯甲酸(TNB)。TNB的濃度可通過在412nm處的吸光率和13,600的摩爾消光系數(shù)來定量。結(jié)果可以每一多糖(PS)三糖重復(fù)單元的游離巰基的摩爾比率形式報導(dǎo)。如圖1中所示，包含約5%PG的CPS具有是包含約2%PG的CPS的至少約1.20倍的硫醇化效率。因此，包含約5%的PG的CPS相對于包含2%PG的CPS展示出25%的增加的結(jié)合效率。本發(fā)明的疫苗通常包含用于所述糖綴合物免疫原的醫(yī)藥上可接受的載劑。醫(yī)藥上可接受的載劑是可用作所述糖綴合物的媒劑的材料，因為所述材料在疫苗施用的背景中為惰性或另外在醫(yī)學(xué)上可接受，并且與活性劑相容。除適宜的賦形劑外，醫(yī)藥上可接受的載劑可含有習(xí)用的疫苗添加劑，如稀釋劑、佐劑和其他免疫刺激劑、抗氧化劑、防腐劑和增溶劑。舉例來說，可添加聚山梨醇酯80以使聚集降至最低并且起穩(wěn)定劑作用，并且可添加緩沖劑來進(jìn)行pH控制。本文所述的疫苗調(diào)配物允許相對容易地并且在不影響組成下添加佐劑。另外，本發(fā)明的疫苗可經(jīng)調(diào)配以便包括"儲積"組分來增加抗原性材料在施與位點的保持。舉例來說，除佐劑(如果使用)夕卜，可添加硫酸葡聚糖或礦物油來提供此儲積效應(yīng)。所述疫苗調(diào)配物的免疫原性可通過活體外調(diào)理吞噬分析評價。舉例來說，由5型和8型rEPA結(jié)合物產(chǎn)生的5型和8型特異性抗體的免疫原性可如下使用白細(xì)胞(HL-60前髓細(xì)胞性白血病細(xì)胞系)、補(bǔ)體、單克隆或多克隆CPS特異性抗體和5型或8型細(xì)菌評價。在零時和60分鐘時，測定細(xì)菌的調(diào)整吞噬或殺死情況。檢測結(jié)合5型和8型抗原的經(jīng)誘發(fā)抗體的存在的ELISA(酶聯(lián)免疫吸附分析)與5型和8型二者的調(diào)理抗體活性間的高相關(guān)性將表明，由所述疫苗誘發(fā)的抗體起作用并且所述抗體介導(dǎo)類型特異性調(diào)理吞噬。另外或另一選擇為，可通過例如下文在實例中所述的動物分析評價免疫原性。在這樣的分析中，將在用所述疫苗免疫的動物中誘發(fā)的抗體水平與未接種疫苗動物中的抗體水平加以比較。包含糖綴合物免疫原的本發(fā)明疫苗的例示性調(diào)配物包含一或多種與載體蛋白(例如來自假單胞菌的外毒素A、破傷風(fēng)類毒素或白喉類毒素)結(jié)合的葡萄球菌CPS抗原(例如金黃色葡萄球菌5型、金黃色葡萄球菌8型、金黃色葡萄球菌336和表皮葡萄球菌PS-1)。所述CPS抗原通常包含至少約5%PG，如上文所述測定，但可包含任何能夠提高硫醇化效率和/或免疫原性而不具有不可接受毒性的PG量。舉例來說，只要所述PG量未達(dá)到不被臨床接受的毒性限度，則可使用高于10%、15%或20%的PG百分比。潛，繊潘歸揚灘本發(fā)明也提供使用本發(fā)明疫苗治療和/或預(yù)防細(xì)菌感染的方法。這樣的方法包括向有其需要的患者施用包含治療有效量的糖綴合物免疫原的疫苗，其中(i)所述糖綴合物免疫原包含至少一種莢膜多糖和載體蛋白，及(ii)所述莢膜多糖包含至少最低有效量的PG，如上所述。通常，所述疫苗也包含用于所述免疫原的醫(yī)藥上可接受載劑，如上所述。這些方法的目標(biāo)患者人群包括感染有細(xì)菌致病原(例如金黃色葡萄球菌或表皮葡萄球菌)或有感染所述細(xì)菌致病原的包括人類在內(nèi)的哺乳動物。所述疫苗可以任何期望劑型施與，包括可經(jīng)靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下施與人類的劑型。所述疫苗可以單劑量施與，或根據(jù)多次給藥方案施與。施與可通過任一數(shù)量之途徑，包括皮下、皮內(nèi)和靜脈內(nèi)。在一實施例中，使用肌內(nèi)施與。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識到，施與途徑將根據(jù)待治療的細(xì)菌感染和疫苗的成分而變化。本發(fā)明的疫苗施與時可使用或不使用佐劑。如果使用佐劑，則佐劑應(yīng)經(jīng)選擇以便避免由佐劑誘發(fā)的毒性。本發(fā)明的疫苗可另外包含P-葡聚糖或粒細(xì)胞集落刺激因子，尤其如在1999年9月14日提出申請并且在2002年3月12日頒予的美國專利第6,355,625號中所述的P-葡聚糖。本發(fā)明疫苗的治療有效量可通過業(yè)內(nèi)常見方法測定。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識到，所述量將隨疫苗的組成、具體患者的特征、所選施與途徑以及所治療細(xì)菌感染的性質(zhì)而變化。一般性指導(dǎo)原則可見，例如，國際協(xié)調(diào)會議(InternationalConferenceonHarmonisation)的出版物和Remington'sPharmaceuticalSc正nces，第27禾口28間，第484-528頁(MackPublishingCompany1990)。典型疫苗劑量介于1|ig-400pg。參照以下實例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，所提供的這些實例僅是用于舉例說明目的。本發(fā)明并不限于所述實例，而是包括自本文所提供教示可明了的所有變化形式。實例實例l:5型莢膜多糖的分離效微/靴麟W'5型CPS如下自細(xì)菌釋放通過以下自金黃色葡萄球菌純化5型CPS:將5型細(xì)胞團(tuán)重懸浮在Tris緩沖液中。以16單位/克細(xì)胞團(tuán)的終濃度添加溶葡萄球菌素。在3小時的溶葡萄球菌素消化結(jié)束時，以40pg/mL混合物的終濃度添加RNAse和DNAse，以消化核酸并降低混合物粘度。在連續(xù)攪拌下將此混合物在37。C下培養(yǎng)3小時。將所述酶混合物在23,000G下離心1小時并收集上清液。微2蘿縦、/^W敏裙為了除去消化后的核酸和其他細(xì)胞組分，將脫水醇和CaCl2添加到所述上清液中。將所述溶液在4'C下存儲6-18小時。將所述25%乙醇-沉淀離心并將粒狀沉淀去掉。此后實施另一沉淀，以收集粗CPS。添加脫水乙醇和CaCl2，并將所述溶液在4'C下存儲6-18個小時。將所述75%乙醇-沉淀離心并將上清液去掉。將粒狀沉淀重新溶解在水中并過濾。透析乙醇純化的CPS，以除去透析試管中痕量的乙醇。透析所述CPS并使用毛細(xì)管沉淀檢驗通過血清型識別測試檢測透析物和滯留物中是否存在CPS。在所述毛細(xì)管沉淀檢驗中，將細(xì)菌試樣用蔗糖溶液分解并在室溫下培養(yǎng)15分鐘，并且將一部分經(jīng)分解細(xì)胞用水稀釋并再培養(yǎng)15分鐘。將試樣離心，將上清液的一等分試樣收集到毛細(xì)管中，并且將等體積的特異性抗血清收集在第二個試管中。將所述抗血清試管的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到所述試樣試管中并在熒光下觀察。將在抗血管/試樣界面處存在沉淀記錄為陽性結(jié)果，將不存在沉淀記錄為陰性結(jié)果。過濾所測試的滯留物并低壓凍干。第二汰艨激餘漸為進(jìn)一步純化所述粗5型CPS,將所述低壓凍干材料溶于pH7.2的0.05MTris和2mMMgS04中。以16單位/克細(xì)胞團(tuán)的終濃度添加溶葡萄球菌素。當(dāng)在透析試管中時(MWIO，OOO)，以100(ig/mL的終濃度添加RNAse和DNAse。將此混合物在37t:下培養(yǎng)4小時。使用毛細(xì)管沉淀檢驗通過血清型識別測試來檢測所述經(jīng)透析的混合物中是否存在PS。第二汰z;,縦、激微游將脫水醇和CaCl2添加到來自所述透析試管的滯留物中并將所述懸浮液在4'C下存儲6-18小時并離心l小時。收集上清液并將其與脫水醇和CaCl2合并。將此懸浮液在23,000G下離心l小時。將粒狀沉淀透析過夜，以除去痕量的乙醇。使用毛細(xì)管沉淀檢驗通過血清型識別測試來檢測透析物和滯留物中是否存在CPS。將滯留物濾過0.45pm的過濾器并在4匸下存儲6-18小時。低壓凍干并存儲所述試樣，直至下一步驟。庫f爻凍經(jīng)譜使試樣經(jīng)受離子交換色譜以進(jìn)行分離。將所述試樣施加到DEAE柱，并且將柱用60mL/hr的流速沖洗5次。使用分光光度法監(jiān)測流出物的洗脫組分(00206)。大V、謬餘/凝^^游色譜將低壓凍干的CPS另外使用大小排除/凝膠過濾色譜利用分子大小純化。將所述低壓凍干材料溶于加入柱上的0.2MNaCI中并用同一緩沖液洗脫。收集各洗脫組分并在OD2Q6處監(jiān)控。收集洗脫峰，如上所述檢測血清型同一性，濾過0.45^im過濾器并低壓凍干。S4000HPLC大小排除色譜(SEC)方法是使用Biosep-SEC-S4000柱來測定金黃色葡萄球菌莢膜多糖(CPS)的分子大小的定性程序。在206nm下監(jiān)測各多糖試樣和標(biāo)記物并產(chǎn)生分布區(qū)報告。多糖試樣的分子量以分布系數(shù)(Kd)表示，其自柱標(biāo)記物體積和試樣洗脫體積、柱空體積(2000kD葡聚糖)和總柱體積(甘氨酰基-L-酪氨酸)計算。實例2:對CPSPG含量和蛋白質(zhì)及核酸污染的評價本實例闡述通過氨基酸分析(AAA)定量肽聚糖氨基酸和殘余蛋白質(zhì)氨基酸以及核酸污染的定量。辦使用氨基酸分析(AAA)來測定金黃色葡萄球菌多糖試樣中所含肽聚糖和殘余蛋白質(zhì)的濃度。多糖溶液的AAA通過以下實施，利用氣相氫氯酸水解試樣(制備成在水中的1mg/mL的經(jīng)純化多糖)。將重構(gòu)的主要和次要氨基酸轉(zhuǎn)化成在395nm處發(fā)出強(qiáng)熒光的穩(wěn)定熒光衍生物。通過反相HPLC對重懸浮的蛋白質(zhì)水解物實施分析。借助外部和內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)定量所述氨基酸。存在于所述多糖溶液中的氨基酸源于(l)肽聚糖(Ala、Glx、Gly和Lys殘基)和(2)殘余蛋白質(zhì)(Arg、Asx、Ile、Leu、Met、Phe、Ser、Thr、Thy、Val、His和Pro殘基)。有兩種氨基酸(Cys和Trp)未加以定量，因此未報導(dǎo)。與肽聚糖和殘余蛋白質(zhì)有關(guān)的氨基酸的濃度使用以下公式報導(dǎo)為相對于多糖的質(zhì)量百分比%嚴(yán)覆箭—)廚農(nóng)%肽聚糖=￡￡21x100=[CPS][PG3邁g/"mL=Glu/GIn+Gy+Ala+Lys其中[蛋白質(zhì)]=通過氨基酸分析獲得的試樣蛋白質(zhì)濃度(mg/mL)[PG]=計算的試樣肽聚糖濃度(mg/mL)[CPS]=已知的試樣多糖濃度(1mg/mL)舉例來說，包含下列的疫苗調(diào)配物[PG]mg/mL=Glu/Gln+Gly+Ala+Lys[PG]mg/mL=0.0119+0.0208+0.0132+0.0122=0.0581mg/mL[CPS]=0.96mg/mL含有6.05%PG(%PG=[PG]/[CPS]X100=0.0581/0.96X100=6.05%)。免應(yīng)余歪^^〖w/w)游^,.'%RP=(肽)cps-(PG)/(CPS)X100S(氨基酸)=(肽)cps其中(肽)eps=總肽濃度[RP]=計算的試樣殘余蛋白質(zhì)濃度(mg/mL)[PS]=已知的試樣多糖濃度(1mg/mL)舉例來說，包含下列的疫苗調(diào)配物(肽)cps=0.0647mg/mL[PG]=0.0581mg/mL[cPS]=0.96mg/mL含有0.68%RP(%[RP]=0.0647-0.0581/0.96=0.68%)淑"V力淑度殺激經(jīng)純化CPS的殘余核酸濃度可通過分光光度分析測定。將試樣在260nm處的吸光率與鯡魚精子DNA溶液的吸光率進(jìn)行比較，后者在50pg/mL下具有1.0AU的吸光率。試樣中DNA的濃度報導(dǎo)為總的5型多糖濃度的百分?jǐn)?shù)(％)。實例3:5型和8型CPS疫苗效率如上文實例中所述制備的5型和8型CPS經(jīng)測定具有以下性質(zhì):測試5型CPS批次l批次28型CPS批次l批次2分子大小(Kd)0.250.260.430.43通過氨基酸分析得出的殘余蛋白質(zhì)(％)0.0280.210.680.45殘余核酸(％)<1<1<1<1肽聚糖含量(％)13.5714.176.055.76通過ELISA對CPS的定量(pg/mL)9410380102通過ELISA測定的在小鼠中的效能(pg/mL)66.593.682.977.8通過響應(yīng)者獲得的在小鼠中的效敬io只小鼠/批)10/10*10/1010/1010/10*70%的小鼠相比對照組在抗體效價方面展示出>4乂的增加如表中所示，將5型和8型CPS純化，測定為包含至少59bPG，并且測定為在小鼠中具有免疫原性。低水平的殘余蛋白質(zhì)使計算的肽聚糖含量具有可信性，因為據(jù)證明，實質(zhì)所有的檢測到的氨基酸是由肽聚糖而不是由其他殘余蛋白質(zhì)提供的。下文更詳細(xì)闡述對小鼠中5型和8型CPS效能的評價。金黃色葡萄球菌5型和8型CPS疫苗的效能可通過小鼠免疫原性測量。所述疫苗的效能通過測量單個小鼠血清中的抗體反應(yīng)和通過鑒別在抗體反應(yīng)方面展示出顯著(例如4倍)增強(qiáng)的小鼠的比率來測定。例如，可使用以下程序?qū)?至8周齡雌性小鼠分成兩組給藥，每組10只小鼠。各組均間隔兩周接種2次。第一組接受0.25ng疫苗/用PBS/0.01免聚山梨醇酯80稀釋成100)iL的劑量。第二組小鼠為陰性對照組并且接受100的PBS/0.01免聚山梨醇酯80。在所述第一次注射前至少48小時自各組選定小鼠中收集疫苗接種前血樣。在最后一次免疫接種后一周自所有小鼠收集疫苗接種后血樣。通過離心自全血試樣分離血清試樣。通過定量ELISA定量所有血清試樣中的抗金黃色葡萄球菌5/8型多糖的抗體。將試樣施加到涂有5型或8型CPS的微量滴定板并培養(yǎng)，用沖洗溶液(0.01M磷酸鹽，0.15M氯化鈉，0.1呢v/v聚山梨醇酯20)沖洗，以除去任何未結(jié)合的鼠科動物抗體。通過隨后與結(jié)合至辣根過氧化物酶(HRP)的山羊抗鼠科動物免疫球蛋白(IgG)抗體的反應(yīng)測定仍保持與CPS結(jié)合的抗體的量。通過與3，3',5,5'-四甲基聯(lián)苯斷TMB)的終點發(fā)色反應(yīng)測定結(jié)合的HRP的水平。所述過氧化物酶活性通過終止溶液(l.OM磷酸)猝滅并通過450nm處的吸光率定量?？捎纱朔治霁@得的效能的一量度是在0.25pg劑量組中在5型和8血清抗體水平上相對于對照組中幾何平均抗體水平均顯示出4倍增加的小鼠的比率(％)。對于金黃色葡萄球菌疫苗中的每只小鼠，相比對照組的效價倍數(shù)增加是其血清抗體水平與對照組中小鼠的幾何平均抗體水平的比率?？勺源朔治霁@得的效能的另一量度是在0.025pg劑量組中觀察到的5型和8型抗體水平的幾何平均值(|ig/mL)。實例4:毒理學(xué)研究對包含5型和8型莢膜多糖的本發(fā)明疫苗進(jìn)行單劑量急性毒性研究，其中各CPS均包含至少5呢PG并且與rEPA結(jié)合，如下所述表1對疫苗和疫苗組分進(jìn)行的毒理學(xué)研究<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>向三組大鼠(每組10只)以在緩沖液中的低(2.92pg/kg)或高(29pg/kg)調(diào)配物劑量施與單劑量的疫苗。將各組中一半的動物在24小時后殺死，剩余的動物在施與測試和對照物后7天殺死。評價測試動物的死亡率、臨床體征、體重、臨床病理學(xué)(血液學(xué)和臨床化學(xué))、眼觀病理學(xué)和組織病理學(xué)。對于臨床體征、體重、臨床病理學(xué)(血液學(xué)和臨床化學(xué))、眼觀病理學(xué)和組織病理學(xué)，未觀察到治療相關(guān)效應(yīng)。研究展示，所述疫苗在最大測試劑量29pg/kg(以重量:重量計是人類劑量100pg的20倍)下不誘發(fā)毒性癥狀。微2.-賴懂,急絲毒絲,究(7尸J向11組每組10只的ICR小鼠施與單劑量的所述疫苗(25(ig5型和8型CPS)、單價5型和8型-rEPA結(jié)合物(25嗎)、rEPA(50pg)、綠膿假單胞菌外毒素A(0.1-0.5jig)或牛血清白蛋白。在施與測試物后，對測試動物進(jìn)行48小時的觀察。測量血清試樣的轉(zhuǎn)胺酶肝酶SGOT和SGPT。僅外毒素A造成死亡和升高的SGOT和SGPT水平。在施與金黃色葡萄球菌CPS-rEPA疫苗或rEPA(各材料以重量:重量計是100嗎人類劑量的約900倍)的組中未記錄到異常的臨床觀察結(jié)果、意外死亡或毒性效應(yīng)。實例5:疫苗調(diào)配物制備根據(jù)本發(fā)明的包含A金黃色葡萄球菌5型和8型CPS的糖綴合物疫苗。通常，所述疫苗調(diào)配物含有金黃色葡萄球菌5型結(jié)合物100jig金黃色葡萄球菌8型結(jié)合物100聚山梨醇酯800.1mg氯化鈉11.7mg磷酸氫二鈉2.23mg磷酸二氫鈉0.23mg注射用水1.0mL對經(jīng)純化CPS的測試證明下列分子大小0.16-0.34Kd殘余蛋白質(zhì)<1%通過OD測得的核酸含量<1%O-乙?；?gt;55%肽聚糖含量至少約5%硫醇:CPS摩爾比0.05-.1權(quán)利要求1、一種疫苗，其包含(A)治療有效量的包含至少一種莢膜多糖和載體蛋白的糖綴合物免疫原，其中所述莢膜多糖以所述莢膜多糖的重量計包含至少約5％(w/w)肽聚糖，及(B)用于所述免疫原的醫(yī)藥上可接受的載劑。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗，其中所述糖綴合物免疫原包含由葡萄球菌表達(dá)的莢膜多糖。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的疫苗，其中所述糖綴合物免疫原包含一或多種選自由金黃色葡萄球菌表達(dá)的莢膜多糖和表皮葡萄球菌表達(dá)的莢膜多糖組成的群組的莢膜多糖，其中至少一種莢膜多糖包含至少約5免(w/w)肽聚糖。4、根據(jù)權(quán)利要求2所述的疫苗，其中所述莢膜多糖選自由5型莢膜多糖、8型莢膜多糖、336莢膜多糖、PS-L莢膜多糖和其組合組成的群組，其中至少一種莢膜多糖包含至少約5%(w/w)肽聚糖。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗，其中所述載體蛋白選自由來自假單胞菌的外毒素A、破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素、oc溶血素和Panton-Valentine殺白細(xì)胞素組成的群組。6、根據(jù)權(quán)利要求4所述的疫苗，其中所述莢膜多糖包含5型莢膜多糖和8型莢膜多糖。7、根據(jù)權(quán)利要求4所述的疫苗，其包含(i)與來自假單胞菌的外毒素A載體蛋白結(jié)合的5型莢膜多糖和(ii)與來自假單胞菌的外毒素A載體蛋白結(jié)合的8型莢膜多糖。8、根據(jù)權(quán)利要求4所述的疫苗，其包含336莢膜多糖。9、根據(jù)權(quán)利要求4所述的疫苗，其包含PS-1莢膜多糖。10、根據(jù)權(quán)利要求4所述的疫苗，其中所述莢膜多糖包含336莢膜多糖和PS-1莢膜多糖。11、一種治療細(xì)菌感染的方法，其包括施與權(quán)利要求l所述的疫苗。12、一種制備疫苗的方法，所述疫苗包含包括至少一種莢膜多糖和載體蛋白的糖綴合物免疫原，所述方法包括(A)使至少一種莢膜多糖與載體蛋白結(jié)合，以形成糖綴合物免疫原，其中所述莢膜多糖以所述莢膜多糖的重量計包含至少約5%(w/w)肽聚糖，及(B)將治療有效量的所述糖綴合物免疫原與用于所述免疫原的醫(yī)藥上可接受的載劑一起調(diào)配。13、一種提高莢膜多糖與載體蛋白的結(jié)合效率的方法，其包括(i)選擇包含一定量的有助于提高所述莢膜多糖與載體蛋白結(jié)合效率的肽聚糖的莢膜多糖，及(ii)使所述莢膜多糖與載體蛋白結(jié)合。14、根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述莢膜多糖包含一定量的能夠使所述莢膜多糖與所述載體蛋白的結(jié)合效率相對于包含約2%的肽聚糖的莢膜多糖提高至少約20%的肽聚糖。15、根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述莢膜多糖以所述莢膜多糖的重量計包含至少約5%(w/w)肽聚糖。16、一種增強(qiáng)疫苗的免疫原性的方法，其包括(i)選擇包含一定量的有助于增強(qiáng)所述疫苗免疫原性的肽聚糖的莢膜多糖，(ii)使所述莢膜多糖與載體蛋白結(jié)合，以形成糖綴合物免疫原，及(iii)制備包含所述糖綴合物免疫原和醫(yī)藥上可接受載劑的疫苗。17、根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述莢膜多糖以所述莢膜多糖的重量計包含至少約5%(w/w)肽聚糖。18、一種疫苗，其包含(A)治療有效量的包含至少一種莢膜多糖和載體蛋白的糖綴合物免疫原，其中所述莢膜多糖包含一定量的能夠使所述莢膜多糖與所述載體蛋白的結(jié)合效率相對于包含約2%的肽聚糖的莢膜多糖提高至少約20%的肽聚糖，及(B)用于所述免疫原的醫(yī)藥上可接受的載劑。全文摘要本發(fā)明涉及用于治療細(xì)菌感染的疫苗，所述疫苗包含含有至少一種莢膜多糖的糖綴合物免疫原，所述至少一種莢膜多糖與載體蛋白結(jié)合，以便所述莢膜多糖含有一定量的能夠改進(jìn)所述疫苗的性質(zhì)的肽聚糖。文檔編號A61K39/39GK101132810SQ200580047719公開日2008年2月27日申請日期2005年12月2日優(yōu)先權(quán)日2004年12月14日發(fā)明者史蒂夫·富勒,埃德·豪斯克內(nèi)希特,斯科特·溫斯頓,阿里·法湯姆申請人:Nabi生物制藥公司