專利名稱：：一種大鼠慢性后肢缺血模型的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種慢性后肢缺血動物模型的制備方法，屬于醫(yī)學生物
技術(shù)領(lǐng)域：
和實驗動物學領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：據(jù)國外的資料統(tǒng)計，在美國每年有超過15萬人因為下肢的嚴重缺血而不能行介入或者手術(shù)治療，隨著動脈硬化的不斷進展，下肢缺血不斷加重。最后患者只能選擇截肢。近幾年隨著再生醫(yī)學的不斷發(fā)展，不斷有新的治療性血管新生手段出現(xiàn)如將各種生長因子導入缺血部位，以達到血管新生(angiogenesis)或者血管生成(arteriogenesis)的目的。動物試驗發(fā)現(xiàn)如骨髓干細胞，細胞因子(VEGF,bBGF等)都可以有效的促進血管生成或者血管新生以改善下肢血供，為臨床治療無流出道，嚴重的慢性下肢缺血患者提供了新的治療思路，但是以上的治療手段應用到臨床后效果卻難以領(lǐng)人滿意，當然，原因是多方面的，但不可否認的是，其中一個重要的原因是目前在研究治療性血管新生手段和機制時，所利用的動物模型都是急性下肢缺血模型，不能全方面的反應慢性下肢缺血后機體的各種病理生理變化特點。目前國內(nèi)外研究肢體缺血所用動物模型都是基于急性缺血，制備方法主要是通過結(jié)扎股動脈，髂外動脈，或者剝脫股深動脈的方法造成下肢的急性缺血，在急性缺血的后期一般是被認為是慢性缺血過程。文獻報道在發(fā)生急性缺血后，局部產(chǎn)生的剪切力；炎性反應；內(nèi)皮主細胞的局部浸入，以上三大機制都在短時間內(nèi)參與血管新生和生成。但是在臨床上我們面臨的往往是在動脈硬化的基礎(chǔ)上造成下肢的慢性缺血，長期的慢性缺血使下肢肌肉通過改變代謝方式以及肌纖維的構(gòu)型來適應對缺血的改變，從而避免了如急性下肢缺血所造成的壞死，炎性反應，而不是通過局部血管急性代償后改善下肢血運的。綜上所述，急性下肢缺血與臨床慢性下肢缺血有諸多方面存在差異，目前應用的急性后肢缺血動物模型并不適合研究的需要。我們知道動物模型對研究疾病的發(fā)生發(fā)展及治療有著重要意義，準確的動物模型應該具有穩(wěn)定可靠,重復性強,制備簡單等特點。肢體缺血模型在國內(nèi)外應用極為廣泛，但是有關(guān)肢體缺血模型的專門研究卻一向少見。即使在相關(guān)的文獻中對該模型的敘述也甚少。就目前的參考文獻來看，缺血狀態(tài)有暫時缺血和慢性缺血之分。前者多用于缺血預處理和缺血再灌注的研究之中，其制作方式有兩種一是外用止血帶止血器或繃帶等環(huán)扎于肢體根部,過一段時間后再放開，以此達到暫時缺血的目的；另一種是分離局部的供血動脈，或用動脈夾暫時夾閉血流。急性缺血是肢體缺血模型的主流，應用最為廣泛其制作方法大體上以結(jié)扎并切除后肢的供血動脈主干或其分支為主。但是在大多數(shù)的動物模型制作過程中，如果結(jié)扎并切斷某一支供血動脈的近端,通常引起遠端肢體缺血壞死的情況并不多見據(jù)報道犬的下肢缺血模型需要結(jié)扎14支動脈，包括盆腔動脈,髂總動脈股總動脈和它們的分支。經(jīng)過6周以后,這些犬的患肢能恢復到大致正常的血流水平。切斷兔的髂總動脈形成的肢體缺血只能維持17天,30天以后,兔不表現(xiàn)出嚴重的后肢缺血。也有研究者采用其它方式制作肢體缺血模型如邊杰芳等在制作犬后肢缺血模型時,在股動脈壁切一小口，向遠端插入螺旋狀金屬絲一根,縫合一針固定金屬絲,然后縫合動脈切口使金屬絲留在股動脈內(nèi)。GaleL.Tang于大鼠股動脈根部加上ameroidconstrictor(—種可吸水收縮的材料)后,使股動脈外徑逐漸縮窄從而達到制備慢性下肢缺血模型的目的。但此類模型也存在諸如下肢缺血時間維持時間短；物理性縮窄血管外徑于臨床病變相差甚遠；缺血時間不易控制等缺點,所以其制作出的缺血模型其具體效果仍待驗證。目前國內(nèi)外尚無其他慢性下肢缺血模型的報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的第技術(shù)問題是提供一種慢性后肢缺血動物模型的制備方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案一種慢性后肢缺血動物模型的制備方法，在實驗動物的股動脈中插入線栓材料至膝關(guān)節(jié)附近，縫合切口；造成動脈管腔狹窄并產(chǎn)生異物反應，使管腔內(nèi)逐漸產(chǎn)生內(nèi)膜增生，逐漸造成下肢血流的減少，建立慢性后肢缺血動物模型。所述在實驗動物的股動脈中插入線栓材料至膝關(guān)節(jié)附近的方法是縱行切開下肢正中的皮膚，從腹股溝至膝關(guān)節(jié)處；在腹股溝根部分離股動脈和股靜脈；于腹股溝韌帶下越0.5cm分別處阻斷股動脈股動脈近遠端，并結(jié)扎股淺動脈及其他分支，切開股動脈，直視下插入線栓材料線至股動脈膝關(guān)節(jié)處；術(shù)畢開放股動脈見無活動性出血后，縫合切口。所述實驗動物為鼠、兔、犬、羊或豬。所述實驗動物為Lewis大鼠。所述線栓材料為4-0prolene線、毛發(fā)或羊腸線，優(yōu)選4-0prolene線。4-0prolene線是目前比較合適的線拴法材料，組織相容性好，操作方便。線拴之動脈病理改變與動脈硬化相近。本發(fā)明通過在Lewis大鼠股動脈中插入4-0prolene線至膝關(guān)節(jié)附近，造成動脈管腔狹窄并產(chǎn)生異物反應，使管腔內(nèi)逐漸產(chǎn)生內(nèi)膜增生，逐漸造成下肢血流的減少以建立大鼠慢性后肢缺血模型。通過觀察臨床表現(xiàn)，無創(chuàng)血流血壓測定，血管造影，組織學檢查，免疫組織化學等手段評價與急性下肢缺血模型進行全面的對比。從缺血表現(xiàn)、組織學改變、血流的動態(tài)演變、缺血組織肌肉內(nèi)微環(huán)境細胞因子的變化方面與急性下肢缺血模型進行對比研究(一)臨床觀察結(jié)果分析我們分別對大鼠進行急性和慢性下肢缺血的制備，并對其進行為期42天的臨床觀察結(jié)果顯示急性下肢缺血模型組動物有8只大鼠表現(xiàn)出下肢缺血的臨床表現(xiàn)如術(shù)后下肢立即出現(xiàn)紫紺，觀察期間出現(xiàn)跛行，蒼白等現(xiàn)象。另1只大鼠行左側(cè)髂動脈切除+左股動脈切除術(shù)后，后肢短時間內(nèi)出現(xiàn)壞死，動物死亡。此現(xiàn)象表明，急性缺血模型的病理狀況同慢性確有不同，而且實驗動物必須經(jīng)歷缺血適應后才能進入所謂的慢性缺血狀態(tài)，綜上所述表明急性后肢缺血模型同臨床患者表現(xiàn)的不相容性；而慢性下肢缺血模型有4只出現(xiàn)下肢缺血臨床表現(xiàn)，沒有出現(xiàn)下肢壞死和動物死亡。但是在觀察后期又后肢肌肉的萎縮現(xiàn)象，這與臨床所見相類似。因此，有理由相信我們的動物模型可以更真實反映慢性缺血的病理生理改變。(二)鼠后肢血流和血壓動態(tài)演變觀察結(jié)果分析本試驗采用國內(nèi)外普遍采用的激光多普勒血流儀和激光多普勒血流成像儀通過對后肢血流和血壓在術(shù)后不同時間點測定，分析和比較不同模型缺血后肢的血流和血壓變化趨勢。在試驗過程中我們采用LDF儀和探頭；固定相同的測定部位，在相對恒定的室溫下進行操作，結(jié)合固定光線電纜的方法以最大限度減少試驗誤差。l.激光多普勒血流分析通過測量患肢的微循環(huán)變化顯示慢性下肢缺血模型出現(xiàn)下肢缺血狀態(tài)慢、時間晚。但是血流下降的速度卻快于急性缺血模型，而且后肢缺血狀態(tài)維持時間長(在術(shù)后第42天，仍為健側(cè)的70%;急性在術(shù)后42天，缺血狀態(tài)基本恢復)。原因考慮為在股動脈插入4-0prolene線后，在短期內(nèi)造成了血管內(nèi)物理性狹窄，此時下肢血流仍未終斷，按照血流動力學研究結(jié)果，管腔直徑狹窄〉50%或面積狹窄〉75%，可發(fā)生明顯的血流動力學改變，臨床標定為需要外科介入的缺血狀態(tài)。以上的結(jié)果與經(jīng)激光多普勒成像儀分析在術(shù)后1周的結(jié)果一致。隨著血管腔內(nèi)產(chǎn)生異物反應后，內(nèi)膜開始增生，隨后造成管腔急劇狹窄，最終閉塞后下肢呈持續(xù)的缺血狀人2.激光多普勒血壓分析術(shù)后對患肢和健側(cè)肢體不同時間點連續(xù)血壓測定結(jié)果顯示慢性下肢缺血模型早于急性下肢缺血模型在術(shù)后1周血壓下降到最低點隨后血壓逐漸恢復。結(jié)合血管造影結(jié)果，慢性缺血模型在術(shù)后7天股部側(cè)支血管未見明顯開放，而急性后肢缺血模型在術(shù)后7天，便有大量的側(cè)支循環(huán)開放，這也造成了急性后肢缺血模型與慢性后肢缺血模型在股部血壓變化趨勢的不同，原因分析為一方面，在正常生理情況下，動脈通暢，側(cè)支血管遠端和近端的基本上沒有壓力梯度。當動脈的血流堵塞時，側(cè)支血管的近端的壓力上升，遠端因無血流，而壓力急劇下降，側(cè)支血管形成了明顯的壓力梯度，造成血流剪切力急劇上升。以上使多數(shù)的側(cè)支循環(huán)血管可以在短時間內(nèi)開放，以代償急劇的缺血狀態(tài)，而慢性缺血模型由于是下肢動脈的不完全阻斷，所產(chǎn)生的血管剪切力要小于急性下肢缺血模型，沒有明顯的血流剪切力的上升，故側(cè)支循環(huán)開放不完全。結(jié)果造成了下肢缺血狀態(tài)在不同模型之間的不同。另一方面，由于嚙齒類動物本身后肢血管的特點，以及實驗動物并不存在動脈硬化，糖尿病等病變，因此大鼠后肢側(cè)支循環(huán)建立速度相當快，表現(xiàn)為急性缺血后，肌肉組織少見大片壞死，側(cè)支血管在短時間內(nèi)開放。(三)大鼠后肢肌肉組織學分析目前學者認為在急性缺血的后期可是慢性缺血的過程，故根據(jù)以上進行了大量的血管新生的實驗研究如骨髓干細胞移植等，我們通過在模型制備成功后，在不同時間點進行肌肉組織取材，進行常規(guī)H.E染色及V1D因子、a-actin免疫組織化學染色。對缺血肌肉組織的結(jié)構(gòu)，組織形態(tài)，及毛細血管密度和小動脈密度進行了全面的比較分析，其中VID因子為內(nèi)皮細胞膜特異性表達，主要用于對毛細血管的密度的研究，a-actin主要是用于針對小動脈密度的研究，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)慢性下肢缺血模型一方面很好的保存了下肢肌肉結(jié)構(gòu)的完整性，但是也可發(fā)現(xiàn)肌肉纖維點狀壞死，無大片肌肉壞死的現(xiàn)象。在觀察的后期可以發(fā)現(xiàn)較明顯的肌纖維萎縮。另一方面，炎性細胞的浸潤在慢性下肢缺血后肢肌肉表現(xiàn)得較為明顯，尤其在慢性下肢缺血模型術(shù)后7天的腓腸肌內(nèi)。慢性下肢缺血模型在術(shù)后第7天，毛細血管密度明顯少于急性下肢缺血模型，小動脈的開放也明顯少于急性缺血模型，在術(shù)后14天，慢性后肢缺血模型患肢毛細血管密度明顯高于急性缺血模型，這點可以通過血管造影得到證實。本實驗出現(xiàn)以上的結(jié)果原因分析為前期的血流動力學研究可以看到慢性缺血模型雖然出現(xiàn)血流、血壓下降晚于慢性缺血模型，但是缺血，缺氧持續(xù)時間長，血流的逐漸較少造成了患肢長時間處于持續(xù)的低灌缺氧狀態(tài)，缺血，缺氧又通過HIF-1信號傳導系統(tǒng)即細胞的缺氧，抑制HIF-la轉(zhuǎn)錄因子，導致許多致使各種炎性細胞趨化因子分泌的增加，組織學表現(xiàn)為炎性細胞的浸潤。炎性細胞中如單核細胞和巨噬細胞都是各種細胞因子如VEGF,MCP-1等的重要來源,以上的細胞因子具有較強的趨化內(nèi)皮細胞，調(diào)節(jié)血管新生的作用。由于大量的細胞因子的分泌使得慢性后肢缺血模型肌肉內(nèi)毛細血管數(shù)量的上升，但在缺血的早期，急性后肢缺血模型由于血管內(nèi)剪切力的急劇上升使得小動脈在短時間開放，表現(xiàn)為在術(shù)后第7天，小動脈密度高于慢性后肢缺血模型。需要指出的是，慢性后肢缺血模型在術(shù)后側(cè)支無論是側(cè)支循環(huán)的開放還是毛細血管的新生都慢于急性后肢缺血模型，此特點同臨床病人急性缺血側(cè)支建立較少，而慢性缺血建立較多的臨床表現(xiàn)相矛盾。糾其原因可能是嚙齒類動物原始血管發(fā)達或者側(cè)枝血管存在但未開放的原因，如果在在人類急性缺血可直接造成肢體壞死，并不會出現(xiàn)慢性缺血狀態(tài)。(四)線拴材料的選擇在本實驗的預實驗部分，我們曾采用O號普通絲線，羊腸線作為材料結(jié)果并不滿意普通絲線因為硬度和韌性不夠一方面插入比較困難，另一反方面即使插入血管內(nèi)，絲線很快與血管壁粘連，無法向遠端輸送。羊腸線是以生物材料為原料的線制品，雖然硬度和韌性可以順利的插入血管中，但是預實驗發(fā)現(xiàn)，很快與血管壁發(fā)生炎性反應，在術(shù)后一周左右血管完全閉塞。人類的毛發(fā)過于細無法對血管的血液動力學造成影響，而Prolene線具有很好的硬度和韌性使實驗操作方便，組織相容性較好，在血管內(nèi)首先造成了物理性的管腔狹窄，在此基礎(chǔ)上prolene線通過異物反應刺激內(nèi)膜強烈的增生，進一步使管腔逐漸的狹窄，以上和動脈硬化斑塊發(fā)展得形態(tài)學比較相似。在一定程度上可以模仿人類動脈硬化造成下肢慢性缺血的過程。(五)急性下肢缺血模型與慢性下肢缺血模型后肢VEGF，F(xiàn)lk-l，Ang-2，F(xiàn)lk-l及SDF-1mRNA不同及分析血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)及其家族成員能特異性地促進內(nèi)皮細胞分裂、增殖及遷移,在新生血管形成過程中起重要作用。促血管生成素(angioprotien，Ang)是目前發(fā)現(xiàn)的唯一含有受體激動劑和受體抑制劑的血管生長因子家族，是一類與血管形成有關(guān)的蛋白質(zhì)分子，包括促血管生成素l(ang—l)、促血管生成素2(ang—2)、促血管生成素3(ang—3)及促血管生成素4(ang—4)，主要通過與內(nèi)皮細胞特異性酪氨酸酶受體Tie—2結(jié)合發(fā)揮作用12],其中Ang—2在胎兒肝血管、成人卵巢、胎盤和子宮等組織中有表達。血管內(nèi)皮生長因子(vEGF)、成纖維生長因子FGF)和缺氧可以增加Ang—2的表達?；|(zhì)細胞衍生因子(stromalcell-derivedfactor-1a，SDF-1a)是趨化作用細胞因子(chemotaxis)CXC亞族的一員，能促進內(nèi)皮細胞增殖遷移，并能促進內(nèi)皮細胞表達血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，從而促進血管發(fā)生，表明SDF-1a參與了微血管內(nèi)皮細胞形成新生血管的過程，并具有對骨髓干細胞有強烈的趨化作用。我們利用Real-timePCR分別檢測急性后肢缺血模型及慢性后肢缺血模型術(shù)后2周，健側(cè)和患側(cè)的股四頭肌和腓腸肌VEGF，Ang-2及SDFmRNA的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)慢性下肢缺血模型在術(shù)后2周，患肢肌肉中尤其是腓腸肌內(nèi)上述細胞因子呈高表達狀態(tài)。進一步證實在慢性缺血狀態(tài)下，肌肉組織的缺血缺氧可以誘導大量促血管新生血管因子的分泌，同時也加重了局部炎性細胞的浸潤這與慢性下肢組織學檢測結(jié)果相符。細胞因子在慢性后肢缺血模型腓腸肌內(nèi)的高表達，提示線拴法制備的缺血模型腓腸肌缺血狀態(tài)要比股四頭肌嚴重，以上的結(jié)果分析，可能同大鼠股部肌肉可以從盆腔或骶正中動脈獲得一部分血流補償有關(guān)，而由于股淺動脈、胭動脈閉塞主要影響小腿肌肉，以上血管的病變直接反映為小腿肌肉的明顯缺血，這與人類動脈硬化閉塞癥，糖尿病足患者的病變部位相近。但是以上各細胞因子在急性缺血模型中并未明顯呈高表達狀態(tài)，同理論不符合。但綜合整體動物缺血狀態(tài)看，由于急性缺血模型的側(cè)支開放明顯好于慢性缺血，因此可能并沒有產(chǎn)生直接誘導炎性因子產(chǎn)生的機制。本發(fā)明的優(yōu)點是通過線栓股動脈的方法可以成功地制備下肢缺血模型，手術(shù)原理簡單，動物術(shù)后成活率高，缺血穩(wěn)定性好。通過與急性下肢缺血模型相比，慢性下肢缺血模型缺血時間長，更好地保存了下肢肌肉組織結(jié)構(gòu)，且患肢缺血狀態(tài)存在部位差異。血管腔內(nèi)膜改變與人類動脈硬化斑塊相近，更接近臨床上患者的表現(xiàn)。慢性下肢缺血模型在后肢缺血狀態(tài)分布存在顯著的差異腓腸肌缺血狀態(tài)最為嚴重，與人類動脈硬化閉塞癥及糖尿病足患者的病變部位一致，更適合療效的觀察。線拴法制備的慢性下肢缺血模型在造模術(shù)后2周比較適合進行干預實驗研究。下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明作進一步說明，并非對發(fā)明的限定，依照本領(lǐng)域公知的現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的實施方式并不限于此，因此凡依照本公開內(nèi)容所作出的本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護范圍。圖1為動物缺血模型激光多普勒血流灌注成像圖1A為急性術(shù)后一周；圖1B為慢性術(shù)后一周。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在術(shù)后早期急性后肢缺血模型患肢血流顯著減少而慢性后肢缺血模型血流呈減少趨勢。圖2A為慢性下肢缺血動物模型的血流分析；圖2B為急性下肢缺血動物模型的血流分析；圖2C為慢性下肢缺血動物模型的血壓分析；圖2D為急性下肢缺血動物模型的血壓分析。具體實施方式實施例1:建模實驗一.實驗動物及分組1.SPF級Lewis大鼠，雄性，體重250300g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，許可證號為SCXK(京)2007-0001。共24只。飼養(yǎng)條件室溫2325。C，置大鼠不銹鋼籠具中飼養(yǎng)，每籠5只，自由攝水攝食。2.20只實驗動物采用隨機分組的方法分為兩組，急性下肢缺血組和慢性下肢缺血組，每組10只。另3只進行線拴物選擇試驗，1只行左髂動脈切除+股動脈切除術(shù)。二.模型制作1.急性下肢缺血模型水合氯醛溶液4ul/kg腹腔注射麻醉，仰臥固定，左下肢常規(guī)備皮消毒，縱行切開左下肢正中的皮膚，從腹股溝至膝關(guān)節(jié)處。于腹股溝下銳性分離出股動脈，范圍從腹股溝韌帶直至膝關(guān)節(jié)。分別結(jié)扎股動脈于股部的所有分支。將股動脈于腹股溝韌帶下切斷，雙重結(jié)扎近端，隨后向遠端銳性剝離至膝關(guān)節(jié)血管分叉處，并結(jié)扎胭動脈及腓動脈，術(shù)畢，縫合切口。2.慢性下肢缺血模型的制備及線拴物的選擇麻醉方法同上，左下肢常規(guī)備皮消毒，縱行切開左下肢正中的皮膚，從腹股溝至膝關(guān)節(jié)處。在腹股溝根部分離股動脈和股靜脈。于腹股溝韌帶下越0.5cm分別處阻斷股動脈股動脈近遠端，并結(jié)扎股淺動脈及其他分支，切開股動脈，直視下插入線狀物線至股動脈膝關(guān)節(jié)處。術(shù)畢開放股動脈見無活動性出血后，縫合切口。血管線拴物的選擇為了在有限的范圍內(nèi)，選擇合適的線拴物，觀察血管腔對其的反應，我們分別選用4-0prolene線，羊腸線，人類的毛發(fā)進行模型的制備，并于術(shù)后第14天取所栓塞血管進行常規(guī)H.E染色。實施例2.實驗動物下肢缺血狀態(tài)研究一.觀察指標和方法1.一般狀態(tài)觀察-實施例l術(shù)后動物常規(guī)進食進水，5只一籠飼養(yǎng)。觀察動物活動情況及患肢血運，動物于分別于術(shù)后第3,7,14，21,28,42天進行缺血狀態(tài)評估，評估指標(0=正常，1+=患肢蒼白，2+=血壓計分，3+=壞死或者間歇性的跛行)2.激光多普勒血流成像及激光多普勒激光血流儀(瑞典百靈威醫(yī)療儀器中國公司)檢測每組動物分別取2只(11=2)在術(shù)后一周行激光多普勒血流成像檢查。并于術(shù)后第3，7，14，28，42天，每組取2只(n=2)常規(guī)麻醉后，行激光多普勒后肢血流儀檢測。實驗步驟Lewis大鼠常規(guī)行腹腔內(nèi)注射水合氯醛麻醉。動物取仰臥位，雙上肢固定，雙下肢自由體位。保持室溫28攝氏度相對恒定后，于Lewis大鼠的足底前腳掌部位，放置激光多普勒探頭。連續(xù)測量并記錄下肢血流曲線，待血流值穩(wěn)定后持續(xù)測量3分鐘，記錄雙側(cè)血流基礎(chǔ)值。對兩組手術(shù)側(cè)與非手術(shù)側(cè)肢體基礎(chǔ)血流灌注值(perfusionunitPU)的比值進行比較研究。3.激光多普勒下肢股部血壓測定于術(shù)后第3，7，14，28，42天，每組取2只(n=2)常規(guī)麻醉后，行激光多普勒下肢血壓測定。實驗步驟Lewis大鼠常規(guī)行腹腔內(nèi)注射水合氯醛麻醉。動物取仰臥位，雙上肢固定，雙下肢自由體位，分別于雙下肢股根部外加寬1.2cm袖帶同時足底放置激光普勒探頭。袖帶加壓至200mmhg后，逐漸減壓，此時看到對應血流測量曲線開始下降。持續(xù)減壓同時記錄血流變化情況，以血流開始恢復的起點所對應的血壓值為該側(cè)肢體收縮壓，連續(xù)測量三次取平均值為患側(cè)和健側(cè)血壓值，對兩組手術(shù)側(cè)與非手術(shù)側(cè)血壓的比值進行比較研究。4.下肢血管造影實驗動物于術(shù)后第3天，第7天，第14天，第28天，42天，每組分別取兩只(11=2)，進行經(jīng)腹腔雙下肢血管造影術(shù)。實驗步驟經(jīng)腹腔水合氯醛注射麻醉后開腹，剪開后腹膜，銳性分離腎下腹主動脈，下腔靜脈，近端阻斷腹主動脈。于血管留置針于阻斷以遠腎下腹主動脈穿刺，見活動性回血后，注射肝素生理鹽水10ml。動物取仰臥位，雙下肢固定于伸直位。調(diào)整造影機管球于雙下肢范圍。連續(xù)以2ml/s的速率注射造影劑(泛影葡胺)共3-5ml，同時對雙下肢連續(xù)拍照，用數(shù)字減影的方法處理造影結(jié)果。結(jié)果分析以腹主動脈分叉處顯影后1.5s時攝片為依據(jù)，計算通過股骨中點垂直線的血管數(shù)目，表示側(cè)枝血管開放的程度。(兩位獨立的觀察者對垂直通過股骨中點的側(cè)枝血管進行計數(shù))5.組織學檢查(OHE染色造影術(shù)畢，采用加大麻醉劑量的方法處死大鼠。分別取大鼠雙下肢股四頭肌，腓腸肌中段固定部位及固定體積肌肉組織，切取線栓之股動脈，以上經(jīng)甲醛固定后用石蠟包埋，做成10um厚的切片，每張切片用蘇木精及伊紅染色。取材后，10%中性緩沖福爾馬林固定24—48h;取出固定后的組織，自來水充分浸泡，經(jīng)70%、80%、90%、95%、100。/o酒精各2h，以脫去組織塊里的水分。脫水后的組織塊經(jīng)二甲苯浸透透明，放到融化的石蠟中，使蠟浸入組織并把二甲苯替換出來；浸蠟后進行包埋。切片厚度4um。蘇木精—伊紅染色法切片入二甲苯2次，每次5—10min，以脫去石蠟。入濃度遞減的酒精，每步約5min。加入蒸餾水，加入Harris蘇木精染液染色1.5min，用自來水洗去多余的染液，加入1%的鹽酸酒精分色。至細胞核著色較深，其他結(jié)構(gòu)無色時為宜。自來水藍化，蒸餾水洗。加入1%伊紅染液染色8min。經(jīng)濃度遞增的酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。(2)VID因子免疫組織化學染色(試劑盒購于武漢博士德gon公司)急性缺血組和慢性缺血組動物分別于術(shù)后7天(n=2)，14天(11=2),造影術(shù)后經(jīng)大量水合氯醛腹腔注射處死。切取雙側(cè)下肢肌肉組織，福爾馬林固定后行vra因子免疫組織化學染色。光鏡下輔以Lecia顯微圖像分析系統(tǒng)(單位視野內(nèi)棕色顆粒數(shù))。以單位視野內(nèi)陽性細胞數(shù)/肌纖維數(shù),表示毛細血管密度。切片常規(guī)脫蠟至水。PBS沖洗，3minX3次。3%過氧化氫消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，室溫孵育10min。蒸餾水洗，PBS沖洗，3minX3次。熱抗原修復'PBS沖洗，3minX3次。滴加適當稀釋的一抗，(VonWillibrandFactor,1:200)，4。C過夜。PBS沖洗，3minX3次。滴加山羊抗兔IgG抗體一服P多聚體，室溫孵育40min。PBS沖洗，5minX4次。DAB顯色。蒸餾水沖洗，(蘇木精復染)，切片常規(guī)脫水，二甲苯透明，樹膠封片。(3)a-actin免疫組織化學染色急性缺血組和慢性缺血組動物分別于術(shù)后7天(n=2),造影術(shù)后經(jīng)大量水合氯醛腹腔注射處死。切取雙側(cè)下肢肌肉組織，福爾馬林固定后行ot-actin免疫組織化學染色光鏡下輔以Lecia顯微圖像分析系統(tǒng)(單位視野內(nèi)棕色顆粒數(shù))。以單位視野內(nèi)陽性細胞數(shù)/肌纖維數(shù),表示小動脈密度。切片常規(guī)脫蠟至水。PBS沖洗，3minX3次。3%過氧化氫消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，室溫孵育10min。蒸餾水洗，PBS沖洗，3minX3次。熱抗原修復，PBS沖洗，3minX3次。滴加適當稀釋的一抗，(a-actinl:1500)，4。C過夜。PBS沖洗，3minX3次。滴加山羊抗兔IgG抗體一HRP多聚體，室溫孵育40min。PBS沖洗，5minX4次。DAB顯色。蒸餾水沖洗，(蘇木精復染)，切片常規(guī)脫水，二甲苯透明，樹膠封片。6.不同部位肌肉組織realtime-PCR檢測:(l)引物序列的合成所采用引物序列均來自文獻，由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成。表l:大鼠肌肉內(nèi)細胞因子的檢測，檢測基因引物序列及特點。大鼠基因弓l物序歹lJ(5'to3')Tm長度上游TGCACCCACGACAGAAGGGGAVEGF60°C492bp下幼字TCACCGCCTTGGCTTGTCACA上游AAAGAGTACAAAGAGGGCTTCAng-260。C415bp下游TCCAGTAGTACCACTTGATAC上游TCCTTGCCGAGAGTCACTCASDF-160。C下游CCCCTGACACTGAACTGGAAAp-Actin上游AGCCATGTACGTAGCCAT60°C228bp下游AGCCATGTACGTAGCCAT(2)組織Trizol提取總RNA細胞離心后，棄上清液。加1000ulTrizol，反復抽打，劇烈震蕩。置于室溫5分鐘。取200ul氯仿(三氯甲烷)，震蕩混勻，靜置3分鐘。然后13000r/min4'C離心15min。吸取上層水相到相應的新EP管中(注意不要觸到中間的蛋白層)，然后，加入大約同等體積的異丙醇，混勻，室溫下靜置10min。13000r/min4'C離心10min。倒去上清，再去甩一下，再吸干凈里面里面的液體后，加入lml的75%乙醇；上下顛倒幾次，13000r/min4°C離心5min。倒去上清，再去甩一下，再吸干凈里面里面的液體后，加入lml的75%乙醇；上下顛倒幾次，13000r/min4°C離心5min。倒掉上清液，甩一下，吸干凈里面的液體，根據(jù)沉淀大小用DEPC水溶解。(3)RNA檢測A.濃度和純度的測定取lul細胞總RNA，加入0.1%DEPC處理水3ml。以0.1%DEPC處理水作空白對照，在紫外可見分光光度計分別讀取260nm、280nm及230nm波長下的光密度值(OD值)，每次變動波長測定時均應重新調(diào)整零點。分別計算A260nm/A280nm,A260nm/A230nm的比值。根據(jù)公式計算總RNA濃度總RNA濃度(ug/ul)=A260nm讀值x40x稀釋倍數(shù)/1000B.總RNA完整性檢測(甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳法)配制1%甲醛變性瓊脂糖凝膠。按以下順序在0.5mlEppendorf管中加樣4,5ul總RNA(約20-30ug)、2.0ul5XMOPS、3.5ul甲醛、10.0ul甲酰胺共20.0ul，混勻離心。65。C水浴15分鐘，冰浴。取上述混合液10.0ul，加入6xRNA加樣緩沖液2ul，混勻后加樣于1%甲醛變性瓊脂糖凝膠加樣孔中。在1%甲醛變性瓊脂糖凝膠上進行水平電泳，電壓5V/cm，電泳時間40分鐘。在可見紫外光檢測儀254nm紫外光透視下，對結(jié)果直接進行觀察。(4)cDNA的合成A.反轉(zhuǎn)錄在無菌管中加入以下樣品-總RNAl-10ul(lng-2ng)OligoDt2ulDntp4ul加無核酸酶污染水至16ulB.7(TC加熱5分鐘，短暫離心后置于冰上；混合以下樣品上述產(chǎn)物16ul(總RNA、OligoDt、Dntp、無核酸酶污染水)IOXRT反應緩沖液2ulRNase抑制劑lulM-MuLv反轉(zhuǎn)錄酶lul總體積20ulC.42。C溫育l小時；95°C5分鐘使酶失活；用SMA3000定量儀測其濃度，并稀釋到50-100ng/ul之間，有利于PCR反應進行:(5)RealtimePCR10XBuffer1uld證(10mM)0.25ulprimer2ulTaq酶0.1ulSYBRGreenI0.5ul模板cDNA1ulddH205.15ul總體積10ulB.反應程序預變性95°C2min30個循環(huán)變性94°C，lOsec退火60°C±10°C，lOsec延伸68°C/72°C，30sec讀板溶解曲線5095°C終止反應降溫4°C，°o(6)數(shù)據(jù)處理計算Folds=2-AACtAACt二(Ct1-Ct2)-(Ct3-Ct4)Ctl:處理樣品待測基因的CtCt2:處理樣品看家基因的CtCt3:對照樣品待測基因的CtCt4:對照樣品看家基因的Ct如果Folds大于2是高表達，如果小于0.5是低表達。二.統(tǒng)計學分析采用SPSSll.5統(tǒng)計軟件對實驗結(jié)果進行分析，各組計量資料以均數(shù)士標準差(f土S)表示，組間比較采用方差分析或兩獨立樣本均數(shù)的t檢驗，各組間率的比較采用X2檢驗。檢驗顯著性取01=0.05，P〈0.05有顯著性差異。三.實驗結(jié)果1.下肢缺血臨床觀察(1)急性下肢缺血組急性下肢缺血模型在術(shù)后3只即出現(xiàn)下肢足部蒼白(n=3),在為期48天的觀察期間出現(xiàn)下肢的跛行(n=2)，紫紺(n=2)，蒼白(n^3)，肌肉的萎縮(n-l).在術(shù)后兩周內(nèi)均分為2+，在48天均分為l+，另外我們對一只Lewis大鼠行左髂動脈切除術(shù)+左下肢股動脈切除術(shù),術(shù)后第日即出現(xiàn)下肢的缺血壞死,三天后造影時死亡。(如表2)(2)慢性下肢缺血模型組慢性下肢缺血模型在術(shù)后多表現(xiàn)為一過性患肢紫紺，隨后在數(shù)分鐘內(nèi)可自行緩解。在觀察期間內(nèi)僅有1只(11=1)表現(xiàn)為下肢跛行，但是少數(shù)有肌肉的萎縮的現(xiàn)象(r^2)，但未發(fā)現(xiàn)有下肢壞死和潰瘍的出現(xiàn)，這與相關(guān)的參考文獻相近。(如表2)表2:急性下肢缺血與慢性下肢缺血模型臨床觀察表<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>*為行左側(cè)髂動脈切除+左股動脈切除術(shù).激光多普勒血流灌注成像儀檢查結(jié)果我們在術(shù)后第7天，對急性組模型和慢性組模型分別進行了激光多普勒后肢血流灌注成像儀檢查，發(fā)現(xiàn)急性缺血模型在術(shù)后一周中患側(cè)后肢血流相對于慢性缺血模型，血流明顯的減少，而慢性后肢缺血模型后肢血流呈部分減少。(圖1A和圖1B)3.激光多普勒后肢血流檢測結(jié)果(1)急性缺血模型大鼠后肢血流檢測結(jié)果患肢的血流在術(shù)一周后即出現(xiàn)血流的下降，在術(shù)后第四周到最低點為正常側(cè)肢體的40%，在術(shù)后6周恢復到對側(cè)(正常肢體)的90%以上。(圖2B)。(2)慢性下肢缺血模型大鼠后肢血流檢測結(jié)果患肢血流的下降速度慢于急性下肢缺血模型,并出現(xiàn)一段時間的平臺期。但是血流在術(shù)后第二周出現(xiàn)最低點為正常側(cè)肢體血流的50%，然后患肢的血流逐漸恢復，再術(shù)后第6周恢復到對側(cè)(正常肢體)的80%，低于急性缺血組。(圖2A)。4.激光多普勒后肢血壓檢測結(jié)果(1)急性后肢缺血模型在術(shù)后第二天血壓明顯下降，第二周血壓下降到最低點，后逐漸恢復，到術(shù)后第6周基本恢復正常。(圖2D)(2)慢性后肢缺血模型術(shù)后第一周到達血壓最低后，相對于急性缺血組恢復時間較長，在術(shù)后第6周還是呈現(xiàn)缺血狀態(tài)。(圖2C)5.動物模型血管造影檢查結(jié)果(1)在急性缺血模型組血管造影結(jié)果顯示缺血側(cè)遠端無血管顯影，患肢在術(shù)后第7天，股部即出現(xiàn)側(cè)支循環(huán)開放，表現(xiàn)為患側(cè)小血管數(shù)量多于健側(cè)。在術(shù)后第6周達到高峰，患側(cè)血管數(shù)量顯著高于健側(cè)。在術(shù)后第8周兩側(cè)側(cè)支血管數(shù)量基本相同。行左側(cè)髂動脈+股動脈切除術(shù)動物血管造影顯示患肢無血管顯影亦未見側(cè)支循環(huán)建(2)慢性缺血模型組血管造影顯示在術(shù)后7天，所栓塞的血管基本顯影，但是存在部分的充盈缺損，在術(shù)后第14天，仍有部分血管顯影，造影劑顏色變淡，遠端顯影不佳。側(cè)支循環(huán)血管數(shù)經(jīng)統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)在術(shù)后第7天未見明顯的側(cè)支開放，第14天側(cè)支血管增加，但股動脈變細。而在術(shù)后42天，手術(shù)側(cè)肢體側(cè)支血管數(shù)仍低于健側(cè)。6.缺血模型肌肉組織H.E染色結(jié)果(1)急性后肢缺血模型Lewis大鼠下肢肌肉部分組織學HE染色發(fā)現(xiàn)大部分肌肉組織未發(fā)現(xiàn)明顯的壞死表現(xiàn)。少數(shù)(n=4)表現(xiàn)為術(shù)后早期缺血肉部分出現(xiàn)分點狀壞死，表現(xiàn)為胞漿均勻一致，到了中期出現(xiàn)肌肉結(jié)構(gòu)的破壞，期間大量炎性細胞浸潤，后期下肢的肌肉出現(xiàn)萎縮，表現(xiàn)為肌間隙明顯的增加。(2)慢性后肢缺模型經(jīng)過H.E染色發(fā)現(xiàn)Lewis大鼠缺血部位肌肉組織結(jié)構(gòu)保存完好，沒有發(fā)現(xiàn)肌肉壞死，但有部分大鼠后肢肌肉尤其是腓腸肌內(nèi)可見明顯的炎性細胞的浸潤，后期部分肌肉組織中出現(xiàn)慢性萎縮性改變(n=2)，表現(xiàn)為肌束間隙增加，但未發(fā)現(xiàn)明顯的纖維化改變。(3)對插入4-0prolene線和羊腸線，毛發(fā)的血管HE染色發(fā)現(xiàn)4-0prolene線血管的組織學結(jié)構(gòu)保存完好，在術(shù)后2周即出現(xiàn)了血管內(nèi)膜的增生，并未見血栓的形成。到了后期由于血管內(nèi)膜的大量增生，幾乎造成了血管完全的閉塞。毛發(fā)在管腔內(nèi)插入毛發(fā)亦可造成一定的內(nèi)膜增生，但血管壁全程出現(xiàn)大量的炎性細胞浸潤，未對管腔造成明顯的物理性狹窄。羊腸線為管腔內(nèi)插入羊腸線血管壁可見大量的炎性細胞浸潤未發(fā)現(xiàn)內(nèi)膜的增生，內(nèi)膜出現(xiàn)破壞，管腔幾乎被羊腸線占據(jù)。7.缺血肌肉vm因子免疫組化染色結(jié)果我們對下肢缺血模型的動物分別于術(shù)后7天、14天。健側(cè)和患側(cè)下肢肌肉分別進行琊因子免疫組化染色結(jié)果顯示陽性結(jié)果定位于血管的內(nèi)皮細胞，毛細血管染色陽性為深棕色點狀分布于肌纖維間，有的呈明顯的管狀結(jié)構(gòu)。(1)急性缺血與慢性缺血Vffl因子陽性細胞數(shù)比較結(jié)果在急性缺血早期，VID因子陽性細胞數(shù)在缺血組織明顯的減少。慢性下肢缺血模型，患肢肌肉在術(shù)后早期，患肢肌肉內(nèi)硼因子陽性細胞數(shù)未見明顯下降。(2)急性缺血與慢性缺血毛細血管/肌纖維比值(毛細血管密度)在缺血模型制備成功后7天，慢性缺血模型患肢毛細血管密度明顯小于急性缺血模型患肢，在術(shù)后14天，慢性后肢缺血模型患肢毛細血管密度明顯高于急性缺血模型。(表3)表3:急性缺血與慢性缺血在術(shù)后早期毛細血管密度比較組別1w2w10.252±0.0161.093±0.10320.188±0.0090.665±0.10430.426±0.0980.315±0.03640.294±0.0180.237±0.0331:急健；2:急患；3:慢健；4:慢患急健一慢健尸=0.034;急健一慢患戶=0.006;急健lw—2w:t=-13.931，戶=0.004急患lw—2w:t=-7.936，P=0.015其余各組無差別。8.缺血肌肉a-actin免疫組化染色結(jié)果急性缺血組和慢性缺血組動物分別于術(shù)后7天，福爾馬林固定后行a-actin免疫組織化學染色，結(jié)果顯示陽性結(jié)果定位于小動脈的平滑肌細胞的胞漿內(nèi)；小動脈染色為深棕色呈管狀結(jié)構(gòu)，分布于肌間隙。(1)急性后肢缺血模型與慢性后肢缺血模型a-actin陽性細胞數(shù)比較結(jié)果在急性缺血早期(術(shù)后7天)，急性缺血組織內(nèi)a-actin陽性細胞數(shù)明顯高于健側(cè)肌肉，慢性缺血模型顯示不同部位a-actin陽性數(shù)量差別不明顯，但明顯少于急性后肢缺血模型。(如圖8-1)(2)急性后肢缺血模型與慢性后肢缺血模型肌肉小動脈/肌纖維比值(小動脈密度)染色結(jié)果慢性后肢缺血模型股四頭肌在術(shù)后第7天小動脈密度顯著小于急性后肢缺血模型股四頭肌(表4);慢性后肢缺血模型在同一側(cè)肢體內(nèi)，腓腸肌內(nèi)小動脈密度卻明顯高于股四頭肌。(表5)表4:急性和慢性小動脈密度數(shù)據(jù)(n=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>LSD檢驗與急健組相比，/M).000;與慢健組相比，/M).007;與慢患組相比，/M).000;與慢患組相比，/M).000。分組表5:慢性后肢缺血模型后肢不同部位小動脈密度數(shù)據(jù)(n=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>LSD檢驗與健股組相比，^0.011;與健腓組相比，/M).017;與患腓組相比，/M).006:9.缺血肌肉VEGF，Ang-2，SDF-1，F(xiàn)lk-lmRNART-PCR結(jié)果本試驗采用急性缺血模型健側(cè)肢體的肌肉內(nèi)a-actin內(nèi)參照對照基因，其它部位肌肉組織中目的基因表達與其比值(fold)值作為結(jié)果Folds大于2是高表達，如果小于O.5是低表達。(1)急性后肢缺血模型與健側(cè)肌肉組織相比較，急性后肢缺血模型患肢肌肉內(nèi)在術(shù)后第14天，VEGF，SDF-1，ANG-2和FLK-1mRNA的表達無顯著增加。(2)慢性后肢缺血模型與健側(cè)肌肉組織相比，慢性缺血模型在患側(cè)VEGF，SDF-l,ANG-2，和FLK-lmRNA在腓腸肌內(nèi)明顯呈高表達狀態(tài)，而在患側(cè)股四頭肌內(nèi)卻呈低表達。序列表<110>首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院<120>—種大鼠慢性后肢缺血模型的制備方法〈130〉<160>8〈170〉Patentlnversion3.5〈210〉1〈211〉21<212〉DNA<213〉人工合成VEGF上游引物〈■>1tgcacccacgacagaagggga<210〉2<211〉21〈212>醒〈213>人工合成VEGF下游引物<400>2tcaccgccttggcttgtcaca<210>3<211〉21〈212〉腿〈213>人工合成Ang-2上游引物<400>3aaagagtacaaagagggcttc21<210>4〈211〉21〈212〉DNA〈213〉人工合成Ang-2下游引物<400〉4tccagtagtaccacttgatac21<210〉5〈211〉20〈212〉DNA<213>人工合成SDF-1上游引物〈400〉5tccttgccgagagtcactca20〈210〉6<211>21〈212〉DNA<213〉人工合成SDF-1下游引物<400〉6cccctgacactgaactggaaa2〈210〉7〈211〉18〈212〉DNA〈213〉人工合成13-Actin上游引物〈400〉7agccatgtacgtagccat18<210〉8〈211〉18〈212〉DNA〈213〉人工合成e-Actin下游引物<400>8agccatgtacgtagccat18權(quán)利要求1.一種大鼠慢性后肢缺血模型的制備方法，其特征在于在實驗動物的股動脈中插入線栓材料至膝關(guān)節(jié)附近，縫合切口；造成動脈管腔狹窄并產(chǎn)生異物反應，使管腔內(nèi)逐漸產(chǎn)生內(nèi)膜增生，逐漸造成下肢血流的減少，建立慢性后肢缺血動物模型。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大鼠慢性后肢缺血模型的制備方法，其特征在于所述在實驗動物的股動脈中插入線栓材料至膝關(guān)節(jié)附近的方法是縱行切開下肢正中的皮膚，從腹股溝至膝關(guān)節(jié)處；在腹股溝根部分離股動脈和股靜脈；于腹股溝韌帶下越0.5cm分別處阻斷股動脈股動脈近遠端，并結(jié)扎股淺動脈及其他分支，切開股動脈，直視下插入線栓材料線至股動脈膝關(guān)節(jié)處；術(shù)畢開放股動脈見無活動性出血后，縫合切口。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種大鼠慢性后肢缺血模型的制備方法，其特征在于所述實驗動物還可以為兔、犬、羊或豬。4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種大鼠慢性后肢缺血模型的制備方法，其特征在于所述實驗動物為Lewis大鼠。5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種大鼠慢性后肢缺血模型的制備方法，其特征在于所述線栓材料為4-0prolene線、毛發(fā)或羊腸線。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種大鼠慢性后肢缺血模型的制備方法，其特征在于所述線栓材料為4-0prolene線。全文摘要本發(fā)明涉及一種慢性后肢缺血動物模型的制備方法，屬于醫(yī)學生物
技術(shù)領(lǐng)域：
和實驗動物學領(lǐng)域。一種慢性后肢缺血動物模型的制備方法，在實驗動物的股動脈中插入線栓材料至膝關(guān)節(jié)附近，縫合切口；造成動脈管腔狹窄并產(chǎn)生異物反應，使管腔內(nèi)逐漸產(chǎn)生內(nèi)膜增生，逐漸造成下肢血流的減少，建立慢性后肢缺血動物模型。本發(fā)明的優(yōu)點是手術(shù)原理簡單，動物術(shù)后成活率高，缺血穩(wěn)定性好。慢性下肢缺血模型缺血時間長，更好地保存了下肢肌肉組織結(jié)構(gòu)，且患肢缺血狀態(tài)存在部位差異。血管腔內(nèi)膜改變與人類動脈硬化斑塊相近，更接近臨床上患者的表現(xiàn)。線拴法制備的慢性下肢缺血模型在造模術(shù)后2周比較適合進行干預實驗研究。文檔編號A61B19/00GK101390779SQ20081022438公開日2009年3月25日申請日期2008年10月23日優(yōu)先權(quán)日2008年10月23日發(fā)明者鑄佟,俞恒錫,建張,李建新,楊盛家,汪忠鎬,濤羅,兵陳申請人:首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院