專利名稱：一種早老性癡呆大鼠動(dòng)物模型的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)療評(píng)價(jià)、檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說(shuō)它是一種早老性癡呆大鼠動(dòng)物模型的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
AD是一種常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病，其主要癥狀表現(xiàn)為記憶力減退，認(rèn)知能力低下和思維遲鈍，且進(jìn)行性加重，最后生活不能自理而死亡，病程一般5～20年。隨著社會(huì)老齡化進(jìn)程的加快，AD的發(fā)病率和發(fā)病人數(shù)急劇上升，已成為威脅老齡特別是高齡人口身心健康的嚴(yán)重疾病，并帶來(lái)了嚴(yán)重的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)和家庭問(wèn)題。
AD病人主要腦病理改變是大量NFTs、大量老年斑、突觸和神經(jīng)元丟失，與之相對(duì)映的兩大分子標(biāo)志物是β-淀粉樣蛋白和tau蛋白(Dennis J.Selkoe，2000；J.Gtz，2001；Kawabata S，1991)。目前國(guó)外學(xué)者已采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，在小鼠成功地復(fù)制出β-淀粉樣沉積引起的老年斑病變，使得未來(lái)AD治療將減少β淀粉樣蛋白沉積作為藥物干預(yù)的目標(biāo)成為可能，盡管如此，但在臨床上并不能從根本上治療AD。
AD的另一主要腦病理改變NFTs是AD患者神經(jīng)元變性的基礎(chǔ)，其數(shù)量與AD臨床癡呆程度正相關(guān)(Featy MB，1996)。因此，對(duì)NFTs干預(yù)顯得尤為重要。蛋白tau屬于一種微管相關(guān)蛋白，主要參與調(diào)與微管組裝、運(yùn)輸和空間結(jié)構(gòu)(Mandelkow EM，1995)，而NFTs的主要成分是異常、過(guò)度磷酸化的tau蛋白聚集形成的雙螺旋絲。適度磷酸化的tau可與微管結(jié)合，促進(jìn)微管組裝并維持其穩(wěn)定性，從而保證細(xì)胞骨架的完整性及軸漿運(yùn)輸?shù)恼＿M(jìn)行，異常過(guò)度磷酸化的tau則失去上述功能(Grundke-Iqbal I，1986；Iqbal K，1986；王建枝，1999)。國(guó)內(nèi)外學(xué)者普遍公認(rèn)，骨架蛋白tau的異常、過(guò)度磷酸化是NFTs形成的關(guān)鍵步驟。過(guò)度磷酸化tau蛋白的聚集不僅以纏結(jié)的形式存在，它也是神經(jīng)氈纖絲和老年斑中的營(yíng)養(yǎng)不良突起的主要成分。有關(guān)神經(jīng)元細(xì)胞骨架蛋白發(fā)生過(guò)度磷酸化的機(jī)制十分復(fù)雜，目前研究認(rèn)為蛋白激酶(催化磷酸化反應(yīng)，如GSK-3，Cdk5和MAPK等)與磷酸酯酶(催化去磷酸化反應(yīng)，如PP1，PP-2A，PP-2B等)的相對(duì)活性失衡，是造成骨架蛋白磷酸化的主要原因。因此，國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過(guò)以蛋白激酶或/和磷酸酯酶為靶點(diǎn)，在體誘導(dǎo)tau蛋白的異常、過(guò)度磷酸化而建立諸多的AD樣動(dòng)物模型，從不同的角度探討在此過(guò)程中的細(xì)胞病理改變、與動(dòng)物學(xué)習(xí)、記憶的聯(lián)系，其中有代表的動(dòng)物模型有三類，一類是崗田酸(Okadaic acid，OA)慢性損害模型，OA，一種磷酸酯酶抑制劑，通過(guò)微滲透泵輸送到側(cè)腦室，持續(xù)六周后，大鼠腦的紋狀體、海馬和皮質(zhì)等部位出現(xiàn)高磷酸化tau蛋白免疫陽(yáng)性神經(jīng)元，并伴有工作記憶和參考記憶的損害(Arent T，1995)；第二類是轉(zhuǎn)染tau蛋白激酶基因的大鼠模型，該模型能高表達(dá)過(guò)度磷酸化的tau蛋白(野生型或人類tau蛋白的突變異構(gòu)體)，可重復(fù)間歇饑餓刺激和對(duì)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑作用的藥物如atreptozotocin、tolbutamide、LY294002、wortmannin、PD98059等實(shí)驗(yàn)，但無(wú)行為學(xué)記憶障礙(JP2000253774)；第三類是通過(guò)大鼠側(cè)腦室或海馬注射蛋白激酶激動(dòng)劑或抑制劑，尤其是利用聯(lián)合用藥誘導(dǎo)蛋白tau過(guò)度磷酸化的動(dòng)物模型(LIU Shi-jie，2002)。但也存在著難以克服的缺陷，諸如昂貴的成本、對(duì)動(dòng)物的損傷性以及作用周期短或局限等(見(jiàn)表一)。
目前作為AD的常用模型有1.損傷性動(dòng)物模型，即依據(jù)膽堿能理論，通過(guò)有機(jī)藥物、生物多肽或物理方法，誘導(dǎo)老年性癡呆動(dòng)物模型。例如利用前腦膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)損傷建立模型，Kudo等利用白喉毒素結(jié)合的NGF對(duì)小鼠雙側(cè)皮質(zhì)注射，小鼠出現(xiàn)被動(dòng)學(xué)習(xí)及記憶功能減退，或利用興奮性毒素鵝膏覃氨酸對(duì)大鼠基底核單側(cè)注射，損毀膽堿能神經(jīng)元，大鼠表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶能力下降，大腦皮層和海馬ChAT活性降低；2.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，自從1991年美國(guó)3個(gè)實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r(shí)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)誘發(fā)鼠淀粉樣病變獲得成功，用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型研究AD得到了很大的發(fā)展，其明顯的優(yōu)點(diǎn)是模擬了AD樣神經(jīng)病理學(xué)特征，包括細(xì)胞外Aβ的沉積，營(yíng)養(yǎng)不良性神經(jīng)炎，神經(jīng)膠質(zhì)增生；3.自然衰老的動(dòng)物模型，自然衰老認(rèn)知障礙動(dòng)物模型神經(jīng)系統(tǒng)的改變是自然發(fā)生的，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在經(jīng)過(guò)行為學(xué)測(cè)試的3月-7年齡兔的小腦和海馬的某些腦區(qū)，存在著顯著的神經(jīng)元丟失和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生，但遺憾的是，即使在超過(guò)7年齡兔的端腦神經(jīng)元中未發(fā)現(xiàn)或很少發(fā)現(xiàn)Aβ的沉積或神經(jīng)原纖維纏結(jié)的形成。
上述各種常用動(dòng)物模型都是模擬AD某些方面的改變，其中以損傷膽堿能神經(jīng)元模型研究得最多，但它也只是部分模擬AD行為記憶方面的改變，腦內(nèi)未出現(xiàn)AD樣病理變化。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型為近年來(lái)的主要研究進(jìn)展，但家族性AD通常是由多基因異常引起，而目前的轉(zhuǎn)基因模型大多是移植了一個(gè)、或最多兩個(gè)基因或基因片段，尚不能真實(shí)地反映AD的病理改變，同時(shí)在行為實(shí)驗(yàn)方面也需改善，而且流行病學(xué)調(diào)查資料表明80％以上的AD患者不涉及基因變異(BraakH，1997)。故轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用受到限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種早老性癡呆大鼠動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，復(fù)制出AD樣大鼠海馬和皮質(zhì)β-淀粉樣蛋白增多、骨架蛋白Tau異常過(guò)度磷酸化、NFTs樣病理變化、蛋白激酶與磷酸酯酶的相對(duì)活性失衡和學(xué)習(xí)、記憶障礙的動(dòng)物模型。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的具體技術(shù)方案是一種早老性癡呆大鼠動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，是將大鼠置于持續(xù)光強(qiáng)度為10～1000Lux的光照環(huán)境中，光照環(huán)境中的時(shí)間為1～10周。
在上述技術(shù)方案中，所述光照環(huán)境中的時(shí)間為3～8周。
在上述技術(shù)方案中，所述光照環(huán)境中的時(shí)間為5～6周。
在上述技術(shù)方案中，大鼠持續(xù)光照的方式為7:00～19:00自然光，19:00～7:00燈光；光強(qiáng)度10～1000Lux；期間動(dòng)物可以自由攝食飲水，室溫為20～25℃。
在上述技術(shù)方案中，大鼠持續(xù)光照的方式為7:00～19:00自然光，19:00～7:00燈光；光強(qiáng)度150Lux；期間動(dòng)物可以自由攝食飲水，室溫為20～25℃。
對(duì)本發(fā)明方法構(gòu)建的動(dòng)物模型提出進(jìn)行(1)Morris水迷宮訓(xùn)練及測(cè)試目的通過(guò)訓(xùn)練及測(cè)試來(lái)判斷造模前后以及與對(duì)照組大鼠學(xué)習(xí)、記憶能力的變化。
實(shí)驗(yàn)所采用Morris水迷宮測(cè)試系統(tǒng)主要包括大鼠行為學(xué)測(cè)試系統(tǒng)、圖象采集系統(tǒng)及微機(jī)數(shù)據(jù)處理分析系統(tǒng)。測(cè)試用圓形水池直徑120cm，高60cm；圓柱形有機(jī)玻璃平臺(tái)直徑10cm，高40cm。大鼠在訓(xùn)練前2小時(shí)移入水迷宮室，并用染發(fā)劑將頭頸部涂黑，涂染面積不小于3×3cm2，以與背景形成反差。水池中水面高約45cm，室溫及水溫均保持在26±2℃，水以奶粉攪渾；平臺(tái)用雙層白色紗布覆蓋扎緊后任意放置于某一象限的中心位置，并沒(méi)于水面下約2cm。整個(gè)背景均為乳白色，以避免老鼠用視覺(jué)搜尋平臺(tái)。用于指導(dǎo)大鼠游泳找到平臺(tái)的紅色或蘭色標(biāo)記物分別置于平臺(tái)所在象限邊緣1m左右。
訓(xùn)練時(shí)將大鼠從任一象限1/2弧度處頭面向池壁輕放于水中，其游泳圖象經(jīng)水面上方1.5m處的攝象機(jī)拍攝并連接于路徑追蹤系統(tǒng)采集，最后通過(guò)微機(jī)分析，可提供潛伏期(即大鼠從入水點(diǎn)起到找到平臺(tái)所用的時(shí)間)、路徑、搜索策略等指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)選用潛伏期作為衡量大鼠學(xué)習(xí)記憶和測(cè)試成績(jī)的指標(biāo)。每只大鼠每天在4個(gè)象限共訓(xùn)練4次，每次游泳時(shí)限為60s，即在60s內(nèi)未找到平臺(tái)者系統(tǒng)自動(dòng)停止記錄，潛伏期記為60s，由測(cè)試者引導(dǎo)其上臺(tái)，休息30s后進(jìn)行下一次訓(xùn)練。
(2)分子病理學(xué)檢測(cè)目的通過(guò)免疫印跡和免疫組化來(lái)反映造模前后以及與對(duì)照組大鼠皮質(zhì)和海馬骨架蛋白的分子病理學(xué)變化。
①免疫印跡法頸椎脫臼斷頭處死雄性Wistar大鼠，迅速取出大腦腦組織置于0-4℃ 0.05M Tris緩沖鹽溶液(TB，PH7.0)內(nèi)，快速分離雙側(cè)海馬，制成10的蛋白勻漿，在1000rmp離心5分鐘，取上清，測(cè)定蛋白含量后備用。
②免疫組化法用4％多聚甲醛磷酸緩沖鹽溶液(PB)進(jìn)行心臟灌注固定腦組織，待取出腦組織后再在上述固定液中后固定6h，即可作振蕩切片。免疫組化采用ABC法，二氨基聯(lián)苯氨(diaminobezidin，DAB)顯色。
(3)糖原合成激酶(Glycogen synthase kinase-3，GSK-3)酶活性測(cè)定目的通過(guò)同位素標(biāo)記法來(lái)檢測(cè)造模前后以及對(duì)照組大鼠海馬GSK-3的活性改變。
大鼠海馬蛋白勻漿的糖原合成激酶(Glycogen synthasekinase-3，GSK-3)酶活性主要是依靠磷光體GS肽II作為底物進(jìn)行測(cè)定(Pei et al.，1997；Tsujio et al.，2000)，具體方法如下在反應(yīng)管中先一定體積的緩沖液(其組成為30mM Tris，pH7.4，10mMMgCl2，10mM NaF，1mM Na3VO4，2mM EGTA，and 10mMβ-mercaptoethanol)，再分別加入7.5μg大鼠海馬蛋白勻漿、250μM底物肽和200μMγ-32P-ATP(1,500cpm/pmol ATP)，終體積為25μl，在30℃條件下孵育30min，用25μl of 300mM鄰磷酸終止反應(yīng)，然后從中取出25μl在液態(tài)閃爍記數(shù)分析儀進(jìn)行檢測(cè)。
(4)磷酸酯酶(PP-1，PP-2A，PP-2B)酶活性測(cè)定i.反應(yīng)底物的制備在40mM Tris-HCl緩沖液中(pH8.5，20mM β-ME，0.2mM CaCl2，15mM MgCl2)，分別加入0.5mM[32P]ATP、10μg/ml磷酸化酶激酶和磷酸化酶b，在30℃條件下孵育10min.，將磷酸化酶b轉(zhuǎn)化為32P標(biāo)記的磷酸化酶a，其中游離的ATP通過(guò)Sephadex G-50柱去除。
ii.PP-1，PP-2A酶活性測(cè)定在20μl反應(yīng)體系(50mM Tris，pH7.0，10mM BME，0.1mM EDTA，7.5mM caffeine，0.06mg/ml組織提取物)中，加入7.5ng/μl[32P]phosphorylase-a開(kāi)始反應(yīng)，在30℃條件下孵育30min.，然后加入等體積的終止液(4mM coldATP+20％ TCA)終止反應(yīng)。利用上行紙色譜法(5％ TCA+0.2M NaCl)分離游離的32P和反應(yīng)底物。通過(guò)液態(tài)閃爍記數(shù)分析儀進(jìn)行檢測(cè)其放射量。
(5)統(tǒng)計(jì)分析全部數(shù)據(jù)均采用X±SD表示，利用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
(6)模型構(gòu)建評(píng)估根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作，結(jié)果顯示延長(zhǎng)大鼠生活環(huán)境中光照時(shí)間，大鼠出現(xiàn)明顯行為學(xué)障礙，即水迷宮測(cè)試潛伏期明顯延長(zhǎng)，并伴有神經(jīng)內(nèi)分泌激素的紊亂如體內(nèi)血液中褪黑素含量的下降等；與對(duì)照組相比，模型組大鼠海馬和皮質(zhì)中β-淀粉樣肽Aβ42、Aβ40的含量明顯增多。酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，模型組大鼠海馬和皮質(zhì)蛋白激酶活性的升高、磷酸酯酶活性的下降。免疫組化和免疫印跡結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，模型組大鼠tau蛋白Ser198/Ser199/Ser202(識(shí)別非磷酸化位點(diǎn))和Ser396/404、Ser214、Ser262等識(shí)別磷酸化的位點(diǎn)磷酸化明顯增強(qiáng)，而骨架蛋白Tau的這些特殊位點(diǎn)的磷酸化程度與動(dòng)物的學(xué)習(xí)、記憶障礙正相關(guān)，即Tau蛋白過(guò)度磷酸化程度越高，大鼠學(xué)習(xí)記憶能力越差。病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示大鼠腦組織神經(jīng)原纖維增粗，密度加大，出現(xiàn)部分交聯(lián)，呈現(xiàn)神經(jīng)原纖維纏結(jié)的初始特征(圖1、圖2)。上述結(jié)果說(shuō)明模型構(gòu)建成功。
本發(fā)明提出的動(dòng)物模型的構(gòu)建，同時(shí)適用于各種動(dòng)物諸如豬、牛、猴、鼠等，都可以在體直接復(fù)制出AD樣海馬和皮質(zhì)β-淀粉樣蛋白增多、骨架蛋白異常過(guò)度磷酸化、神經(jīng)原纖維纏結(jié)樣病理變化和學(xué)習(xí)、記憶障礙。
本發(fā)明特點(diǎn)主要是通過(guò)延長(zhǎng)大鼠生活環(huán)境中日照時(shí)間，不僅出現(xiàn)AD樣異常、β-淀粉樣蛋白增多、過(guò)度磷酸化tau蛋白的免疫陽(yáng)性神經(jīng)元，而且在大鼠腦組織病理學(xué)檢測(cè)中觀察到神經(jīng)原纖維增粗，密度加大，出現(xiàn)部分交聯(lián)，呈現(xiàn)神經(jīng)原纖維纏結(jié)的初始特征(圖1、圖2)，并伴有學(xué)習(xí)和記憶障礙、蛋白激酶活性的升高、磷酸酯酶活性的下降以及神經(jīng)內(nèi)分泌激素的紊亂如體內(nèi)血液中褪黑素含量的下降，且無(wú)損傷性，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，所需費(fèi)用十分低廉，模型復(fù)制成功率高，重現(xiàn)性好，適用于研究在AD發(fā)病早期或過(guò)程中可能的機(jī)制以及其之間的內(nèi)在聯(lián)系，具體內(nèi)容包括β-淀粉樣蛋白增多及聚集、骨架蛋白Tau AD樣異常過(guò)度磷酸化、神經(jīng)原纖維纏結(jié)樣病理變化、蛋白激酶與磷酸酯酶的相對(duì)活性失衡及行為異常等，并可以用于篩選相應(yīng)的治療AD藥物，與上述相關(guān)動(dòng)物模型的比較見(jiàn)下表。
表一 幾種早老性癡呆大鼠模型的比較



圖1為正常組大鼠(12h∶12h)腦組織神經(jīng)原纖維；圖2為模型組大鼠(24h∶0h)腦組織神經(jīng)原纖維。
具體實(shí)施例方式
下面通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。
結(jié)合附圖可知病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示模型組大鼠腦組織神經(jīng)原纖維增粗，密度加大，出現(xiàn)部分交聯(lián)，呈現(xiàn)神經(jīng)原纖維纏結(jié)的初始特征。
實(shí)例光照大鼠構(gòu)建AD樣大鼠動(dòng)物模型(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組雄性Wistar大鼠(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，SPF級(jí)，體重50～70克，30只。分兩組，每組15只①正常組，常規(guī)環(huán)境飼養(yǎng)(12h∶12h)，即7:00～19:00自然光，19:00～7:00無(wú)光；②模型組，大鼠持續(xù)光照方式(24h∶0h)7:00～19:00自然光，19:00～7:00燈光；光強(qiáng)度150Lux；時(shí)間6周，期間動(dòng)物可以自由攝食飲水，室溫為20～25℃。
(2)主要試劑丙烯酰胺(Arc)，N，N-亞甲基雙丙烯酰(bis)，四甲基乙二胺(TEMED)，十二烷基磺酸鈉(SDS)，甘氨酸(Glycine)，牛血清白蛋白(BSA)，三羥甲基氨基甲烷(Tris)，礬酸鈉(Na3VO4)，β-磷酸甘油(β-PG)，氟化鈉(NaF)，磷酸化酶b，均為Sigma產(chǎn)品；過(guò)硫酸銨(AP)及考馬斯亮藍(lán)蛋白顯色液從Pierce(美國(guó))公司購(gòu)買；預(yù)染的高分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)從Gibco公司購(gòu)買。
(3)主要儀器①WDT-V型腦立體定位儀(西安西北光電儀器廠)②STT-III型三維手動(dòng)推進(jìn)器(西安西北光電儀器廠)③垂直型電泳槽和濕式電轉(zhuǎn)膜槽(Hoefer，USA)④電泳儀(DF-C型，東方特力科貿(mào)中心)⑤轉(zhuǎn)膜儀(BIO-RAD，北京市六一儀器廠)⑥臺(tái)式高速離心機(jī)(Sigma，德國(guó))⑦酶標(biāo)儀(DG-3022型)⑧圖象分析系統(tǒng)(Image pro-plus kodak，USA)⑨衡溫雜交孵育箱(Biometra)(4)Morris水迷宮訓(xùn)練及測(cè)試實(shí)驗(yàn)所采用Morris水迷宮測(cè)試系統(tǒng)主要包括大鼠行為學(xué)測(cè)試系統(tǒng)、圖象采集系統(tǒng)及微機(jī)數(shù)據(jù)處理分析系統(tǒng)。測(cè)試用圓形水池直徑120cm，高60cm；圓柱形有機(jī)玻璃平臺(tái)直徑10cm，高40cm。大鼠在訓(xùn)練前2小時(shí)移入水迷宮室，并用染發(fā)劑將頭頸部涂黑，涂染面積不小于3×3cm2，以與背景形成反差。水池中水面高約45cm，室溫及水溫均保持在26±2℃，水以奶粉攪渾；平臺(tái)用雙層白色紗布覆蓋扎緊后任意放置于某一象限的中心位置，并沒(méi)于水面下約2cm。整個(gè)背景均為乳白色，以避免老鼠用視覺(jué)搜尋平臺(tái)。用于指導(dǎo)大鼠游泳找到平臺(tái)的紅色或蘭色標(biāo)記物分別置于平臺(tái)所在象限邊緣1m左右。
訓(xùn)練時(shí)將大鼠從任一象限1/2弧度處頭面向池壁輕放于水中，其游泳圖象經(jīng)水面上方1.5m處的攝象機(jī)拍攝并連接于路徑追蹤系統(tǒng)采集，最后通過(guò)微機(jī)分析，可提供潛伏期(即大鼠從入水點(diǎn)起到找到平臺(tái)所用的時(shí)間)、路徑、搜索策略等指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)選用潛伏期作為衡量大鼠學(xué)習(xí)記憶和測(cè)試成績(jī)的指標(biāo)。每只大鼠每天在4個(gè)象限共訓(xùn)練4次，每次游泳時(shí)限為60s，即在60s內(nèi)未找到平臺(tái)者系統(tǒng)自動(dòng)停止記錄，潛伏期記為60s，由測(cè)試者引導(dǎo)其上臺(tái)，休息30s后進(jìn)行下一次訓(xùn)練。
(5)分子病理學(xué)檢測(cè)目的通過(guò)免疫印跡和免疫組化來(lái)反映造模前后以及與對(duì)照組大鼠海馬骨架蛋白的分子病理學(xué)變化。
①免疫印跡法頸椎脫臼斷頭處死雄性Wistar大鼠，迅速取出大腦腦組織置于0-4℃ 0.05M Tris緩沖鹽溶液(TB，PH7.0)內(nèi)，快速分離雙側(cè)海馬，制成10的蛋白勻漿，在1000rmp離心5分鐘，取上清，測(cè)定蛋白含量后備用。
②免疫組化法用4多聚甲醛磷酸緩沖鹽溶液(PB)進(jìn)行心臟灌注固定腦組織，待取出腦組織后再在上述固定液中后固定6h，即可作振蕩切片。免疫組化采用ABC法，二氨基聯(lián)苯氨(diaminobezidin，DAB)顯色。
(6)糖原合成激酶(Glycogen synthase kinase-3，GSK-3)酶活性測(cè)定目的通過(guò)同位素標(biāo)記法來(lái)檢測(cè)造模前后以及對(duì)照組大鼠海馬GSK-3的活性改變。
大鼠海馬蛋白勻漿的糖原合成激酶(Glycogen synthasekinase-3，GSK-3)酶活性主要是依靠磷光體GS肽II作為底物進(jìn)行測(cè)定(Pei et al.，1997；Tsujio et al.，2000)，具體方法如下在反應(yīng)管中先一定體積的緩沖液(其組成為30mM Tris，pH7.4，10mMMgCl2，10mM NaF，1mM Na3VO4，2mM EGTA，and 10mMβ-mercaptoethanol)，再分別加入7.5μg大鼠海馬蛋白勻漿、250μM底物肽和200μMγ-32P-ATP(1,500cpm/pmol ATP)，終體積為25μl，在30℃條件下孵育30min，用25μl of 300mM鄰磷酸終止反應(yīng)，然后從中取出25μl在液態(tài)閃爍記數(shù)分析儀進(jìn)行檢測(cè)。
(7)磷酸酯酶(PP-1，PP-2A)酶活性測(cè)定i.反應(yīng)底物的制備在40mM Tris-HCl緩沖液中(pH8.5，20mM β-ME，0.2mM CaCl2，15mM MgCl2)，分別加入0.5mM[32P]ATP、10μg/ml磷酸化酶激酶和磷酸化酶b，在30℃條件下孵育10min.，將磷酸化酶b轉(zhuǎn)化為32P標(biāo)記的磷酸化酶a，其中游離的ATP通過(guò)Sephadex G-50柱去除。
ii.PP-1，PP-2A酶活性測(cè)定在20μl反應(yīng)體系(50mM Tris，pH7.0，10mM BME，0.1mM EDTA，7.5mM caffeine，0.06mg/ml組織提取物)中，加入7.5ng/μl[32P]phosphorylase-a開(kāi)始反應(yīng)，在30℃條件下孵育30min.，然后加入等體積的終止液(4mM coldATP+20％TCA)終止反應(yīng)。利用上行紙色譜法(5％TCA+0.2M NaCl)分離游離的32P和反應(yīng)底物。通過(guò)液態(tài)閃爍記數(shù)分析儀進(jìn)行檢測(cè)其放射量。
(8)統(tǒng)計(jì)分析全部數(shù)據(jù)均采用X±SD表示，利用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
(9)模型構(gòu)建評(píng)估根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作，結(jié)果顯示延長(zhǎng)大鼠生活環(huán)境中光照時(shí)間，大鼠出現(xiàn)明顯行為學(xué)障礙，即水迷宮測(cè)試潛伏期明顯延長(zhǎng)，并伴有神經(jīng)內(nèi)分泌激素的紊亂如體內(nèi)血液中褪黑素含量的下降等；與對(duì)照組相比，模型組大鼠海馬和皮質(zhì)中β-淀粉樣肽Aβ42、Aβ40的含量明顯增多。酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，模型組大鼠海馬和皮質(zhì)蛋白激酶活性的升高、磷酸酯酶活性的下降。免疫組化和免疫印跡結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，模型組大鼠tau蛋白Ser198/Ser199/Ser202(識(shí)別非磷酸化位點(diǎn))和Ser396/404、Ser214、Ser262等識(shí)別磷酸化的位點(diǎn)磷酸化明顯增強(qiáng)，而骨架蛋白Tau的這些特殊位點(diǎn)的磷酸化程度與動(dòng)物的學(xué)習(xí)、記憶障礙正相關(guān)，即Tau蛋白過(guò)度磷酸化程度越高，大鼠學(xué)習(xí)記憶能力越差。病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示大鼠腦組織神經(jīng)原纖維增粗，密度加大，出現(xiàn)部分交聯(lián)，呈現(xiàn)神經(jīng)原纖維纏結(jié)的初始特征(圖1、圖2)。上述結(jié)果說(shuō)明模型構(gòu)建成功。
權(quán)利要求
1.一種早老性癡呆大鼠動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，其特征在于將大鼠置于持續(xù)光強(qiáng)度為10～1000Lux的光照環(huán)境中，光照環(huán)境中的時(shí)間為1～10周。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種早老性癡呆大鼠動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，其特征在于所述光照環(huán)境中的時(shí)間為3～8周。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種早老性癡呆大鼠動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，其特征在于所述光照環(huán)境中的時(shí)間為5～6周。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種早老性癡呆大鼠動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，其特征在于大鼠持續(xù)光照的方式為7:00～19:00自然光，19:00～7:00燈光；光強(qiáng)度10～1000Lux；期間動(dòng)物可以自由攝食飲水，室溫為20～25℃。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種早老性癡呆大鼠動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，其特征在于大鼠持續(xù)光照的方式為7:00～19:00自然光，19:00～7:00燈光；光強(qiáng)度150Lux；期間動(dòng)物可以自由攝食飲水，室溫為20～25℃。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)療評(píng)價(jià)、檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種早老性癡呆大鼠動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，通過(guò)將大鼠置于持續(xù)光強(qiáng)度為10～1000Lux的光照環(huán)境中，光照環(huán)境中的時(shí)間為1～10周。該類模型可用于研究在AD發(fā)病早期或過(guò)程中可能的機(jī)制以及其之間的內(nèi)在聯(lián)系，具體內(nèi)容包括β－淀粉樣蛋白增多及聚集、骨架蛋白Tau AD樣異常過(guò)度磷酸化、神經(jīng)原纖維纏結(jié)樣病理變化、蛋白激酶與磷酸酯酶的相對(duì)活性失衡及行為異常等，并可以用于篩選治療早老性癡呆(Alzheimer’sdisease，AD)藥物、評(píng)價(jià)治療早老性癡呆方法以及研究早老性癡呆發(fā)病機(jī)制的非損傷性大鼠動(dòng)物模型的構(gòu)建方法。
文檔編號(hào)G09B23/00GK1558383SQ2003101114
公開(kāi)日2004年12月29日 申請(qǐng)日期2003年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月27日
發(fā)明者凌智群, 王建枝 申請(qǐng)人:華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院