一種口服液大鼠模型及測(cè)定對(duì)模型影響的實(shí)驗(yàn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥理研宄領(lǐng)域，尤其涉及一種口服液大鼠模型及測(cè)定對(duì)模型影響的實(shí) 驗(yàn)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 心臟病是以發(fā)病率高、病死率高、致殘率高、復(fù)發(fā)率高為特點(diǎn)的疾病，是世界范圍 內(nèi)人口死亡的第三位病因和成人殘疾的首要原因。近10年來(lái)，我國(guó)隨著人口老齡化以及受 行為、社會(huì)環(huán)境因素的影響，仍有不斷上升的趨勢(shì)。
[0003] 心力衰竭又稱為心功能不全。傳統(tǒng)概念認(rèn)為由于不同病因的心血管疾病所致的心 臟損害，特別是心室肌收縮和舒張功能受損，在有適量靜脈回流情況下，心臟不能維持足夠 的排血量，導(dǎo)致周身組織灌注量減少，肺循環(huán)和（或）體循環(huán)淤血的一組臨床綜合征。新的 概念：心衰是一組多種神經(jīng)體液因子參與，促使心功能不全持續(xù)發(fā)展的臨床綜合癥，是各種 心臟病最終結(jié)局。臨床上以組織血液灌注不足以及肺循環(huán)和體循環(huán)淤血為主要特征。心衰 不是一個(gè)獨(dú)立的疾病，而是各種心臟病的嚴(yán)重階段，其發(fā)病率和死亡率極高。
[0004] 通過(guò)臨床觀察實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討口服液治療氣虛型慢性心力衰竭的療效及不良反 應(yīng)情況，并探討口服液治療慢性心力衰竭的作用機(jī)制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明實(shí)施例的目的在于提供一種口服液對(duì)大鼠模型影響的實(shí)驗(yàn)方法，旨在研宄 益氣活血祛濕利水藥口服液對(duì)不同證型慢性心力衰竭的作用。
[0006] 本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種口服液對(duì)大鼠模型影響的實(shí)驗(yàn)方法包括對(duì)大鼠耐氧模 型的影響的實(shí)驗(yàn)、對(duì)大鼠慢性心衰模型的影響的實(shí)驗(yàn)、對(duì)大鼠急性心衰模型的影響的實(shí)驗(yàn)、 對(duì)水負(fù)荷大鼠模型的影響的實(shí)驗(yàn)、急性毒性實(shí)驗(yàn)；
[0007] 所述的對(duì)大鼠耐氧模型的影響的實(shí)驗(yàn)包括對(duì)小鼠常壓耐缺氧時(shí)間的影響的實(shí)驗(yàn)、 對(duì)小鼠減壓耐缺氧時(shí)間的影響的實(shí)驗(yàn)、對(duì)小鼠耳殼微循環(huán)的影響的實(shí)驗(yàn)。
[0008] 進(jìn)一步，所述的對(duì)小鼠常壓耐缺氧時(shí)間的影響的實(shí)驗(yàn)的具體方法為：
[0009] 取18~21g小鼠60只，雌雄各半，隨機(jī)分為5組分別灌服大、中、小劑量組口服液， 芪藶強(qiáng)心膠囊混懸液和同體積的生理鹽水，灌胃量均為〇. 3ml/10g ;每天給藥1次，連續(xù)給 藥7天；于第7天灌胃給藥1小時(shí)，禁食12小時(shí)，將小鼠放入盛有IOg鈉石灰的125ml磨口 廣口瓶中，每瓶1只，瓶口涂凡士林密封，立即用秒表記錄每只小鼠從瓶口密封到死亡的時(shí) 間，以呼吸停止為小鼠死亡指標(biāo)，觀察小鼠存活時(shí)間。
[0010] 進(jìn)一步，所述的對(duì)小鼠減壓耐缺氧時(shí)間的影響的實(shí)驗(yàn)的具體方法為：
[0011] 取18~21g小鼠60只，雌雄各半，隨機(jī)分為5組，分別灌服大、中、小劑量口服液， 芪藶強(qiáng)心膠囊混懸液及同體積生理鹽水；每天給藥1次，連續(xù)給藥7天；于第7天灌胃1小 時(shí)，禁食12小時(shí)，將小鼠放入盛有IOg鈉石灰的125ml磨口廣口瓶?jī)?nèi)，連接減壓裝置，瓶口 瓶涂凡士林密封；立即用秒表記錄每只小鼠從瓶口密封到死亡時(shí)間，以呼吸停止為死亡指 標(biāo)，記錄小鼠存活時(shí)間。
[0012] 進(jìn)一步，所述的對(duì)小鼠耳殼微循環(huán)的影響的實(shí)驗(yàn)的具體方法為：
[0013] 取18~21g小鼠60只，雌雄各半，隨機(jī)分為5組，分別灌服大、中、小劑量口服液 組，芪藶強(qiáng)心膠囊混懸液及同體積生理鹽水；每天給藥1次，連續(xù)給藥10天，第10天灌胃后 Ih開(kāi)始試驗(yàn)；小鼠腹腔注射5 %的0. 06ml/10g水合氯醛進(jìn)行麻醉，將麻醉好的小鼠腹部向 下固定在小鼠觀察臺(tái)上，調(diào)節(jié)耳托高度，使耳廓平展在耳托上，在耳廓表面滴加少許香柏 油，將觀察臺(tái)置于顯微鏡的載物臺(tái)上，用全自動(dòng)圖像分析儀觀察各組小鼠耳廓細(xì)動(dòng)脈（A)、 細(xì)靜脈（V)管徑、血流速度及毛細(xì)血管開(kāi)放數(shù)，調(diào)節(jié)視野范圍，使正常小鼠耳殼微循環(huán)情況 相似；立即尾靜脈注射鹽酸腎上腺素注射液（l〇mg/kg)，2min后，分別觀察各小鼠耳廓耳廓 細(xì)動(dòng)脈（A)、細(xì)靜脈（V)管徑、血流速度及毛細(xì)血管開(kāi)放數(shù)。
[0014] 進(jìn)一步，所述的對(duì)大鼠慢性心衰模型的影響的實(shí)驗(yàn)的具體方法為：
[0015] 步驟一、分組給藥：
[0016] 取體重200_220g健康雄性大鼠造慢性心衰模型，采用腹主動(dòng)脈縮窄法建立；方法 為大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉（40mg/kg)麻醉，劍突下腹正中切口，分層打開(kāi)腹腔，在腎 動(dòng)脈水平以上鈍性游離腹主動(dòng)脈，將7號(hào)針頭平行置于腹主動(dòng)脈上，用0號(hào)手術(shù)絲線將腹 主動(dòng)脈和針頭一同結(jié)扎，然后緩慢將針頭撤出，使大鼠腹主動(dòng)脈直徑縮窄為〇.7_左右，分 層關(guān)腹；術(shù)后腹腔注射青霉素，每天1次，連續(xù)6天，預(yù)防感染；假手術(shù)組開(kāi)腹后將手術(shù)絲線 穿過(guò)腹主動(dòng)脈，不結(jié)扎，其它操作同手術(shù)組；手術(shù)后4周，取手術(shù)成功大鼠72只，隨機(jī)分為 6組，分別灌服大、中、小劑量口服液、芪藶強(qiáng)心膠囊混懸液，模型組均灌服同體積生理鹽水， 灌服標(biāo)準(zhǔn)為2ml/100g ;另取單做解剖手術(shù)、不結(jié)扎腹主動(dòng)脈，假手術(shù)4周成功的12只雄性 大鼠作為假手術(shù)組，灌服同體積生理鹽水，灌服標(biāo)準(zhǔn)為2ml/100g ;每天給藥1次，連續(xù)給藥6 周；各組大鼠均每天上午給藥、下午喂飼；
[0017] 步驟二、進(jìn)行心臟動(dòng)力學(xué)變化指標(biāo)、心臟指數(shù)、心臟形態(tài)變化、生化指標(biāo)的測(cè)定。
[0018] 進(jìn)一步，對(duì)大鼠慢性心衰模型的影響的實(shí)驗(yàn)中所述的心臟動(dòng)力學(xué)變化指標(biāo)的測(cè)定 的具體方法為：
[0019] 于最后1次灌胃后Ih后（禁食不禁水12h)，大鼠用20%烏拉坦腹腔注射麻醉，用 量為lg/kg，將大鼠固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)，分離右頸總動(dòng)脈，遠(yuǎn)端結(jié)扎，近端夾閉血管，在動(dòng)脈壁剪 一小口，插入直徑為1mm帶肝素的心導(dǎo)管，經(jīng)壓力轉(zhuǎn)換器連接多導(dǎo)生理記錄儀，緩慢推進(jìn)導(dǎo) 管，觀察示波器，當(dāng)出現(xiàn)左室波型后停止推進(jìn)，穩(wěn)定2分鐘后記錄HR、左室收縮內(nèi)壓（LVSP)、 左室舒張末壓（LVEDP)、左室內(nèi)壓最大變化速率（±dp/dtmax)。
[0020] 進(jìn)一步，對(duì)大鼠慢性心衰模型的影響的實(shí)驗(yàn)中所述的心臟指數(shù)的測(cè)定的具體方法 為：
[0021] 左室舒、縮功能測(cè)定完后，股動(dòng)脈放血處死動(dòng)物，取血分離血清測(cè)定血清LDH、BNP 和cTnl ;然后取全心稱重，再分離左心室稱重，計(jì)算全心指數(shù)和左心室指數(shù)；稱重前用吸水 紙吸去心臟內(nèi)的血液。
[0022] 進(jìn)一步，對(duì)大鼠慢性心衰模型的影響的實(shí)驗(yàn)中所述的心臟形態(tài)變化的測(cè)定的具體 方法為：
[0023] 實(shí)驗(yàn)結(jié)束，處死大鼠，取心臟，切取約0. 5cm3左心室組織，10%甲醛固定，石蠟包 埋、切片、HE染色，進(jìn)行病理組織學(xué)檢查；評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：
[0024] 0分：正常；1分：輕度心肌纖維肥大，左室增厚，心肌輕度變性；2分：中度心肌纖 維肥大，左室增厚，心肌中度變性；3分：重度心肌纖維肥大、左室厚度、心肌重度變性。
[0025] 進(jìn)一步，對(duì)大鼠慢性心衰模型的影響的實(shí)驗(yàn)中所述的生化指標(biāo)的測(cè)定包括乳酸脫 氫酶的測(cè)定、大鼠腦鈉素/腦鈉尿肽（BNP)ELISA的測(cè)定、大鼠心肌肌鈣蛋白I(cTnl)的 ELISA測(cè)定。
[0026] 進(jìn)一步，所述的對(duì)大鼠急性心衰模型的影響的實(shí)驗(yàn)的具體方法為：
[0027] 步驟一、分組給藥：
[0028] 取體重220~240g大鼠60只，雄性，隨機(jī)均分為6組，每組12只，其中1組為空 白對(duì)照組，另5組造大鼠急性心衰模型；造模型5組分別灌服大、中、小劑量口服液、芪藶強(qiáng) 心膠囊混懸液和同體積的生理鹽水，灌服標(biāo)準(zhǔn)為2ml/100g ;空白對(duì)照組灌同體積的生理鹽 水，灌服標(biāo)準(zhǔn)為2ml/100g ;每天給藥1次，連續(xù)給藥7天。于最后1次給藥后0. 5h，造模型 5組大鼠用10%水合氯醛腹腔注射，注射標(biāo)準(zhǔn)為3ml/kg，大鼠麻醉后，仰臥于手術(shù)臺(tái)并固 定，分離氣管及右側(cè)頸總動(dòng)脈，分別進(jìn)行氣管及頸總動(dòng)脈插管，氣管插管連接動(dòng)物呼吸機(jī)行 機(jī)械通氣，頸總動(dòng)脈插管連接壓力傳感器，將信號(hào)輸入微機(jī)生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)；心室導(dǎo)管插 入左心室，連接壓力傳感器，手術(shù)后穩(wěn)定IOmin后，記錄心率（HR)、動(dòng)脈收縮壓（SP)、動(dòng)脈 舒張壓（DP)、動(dòng)脈平均壓（AP)、左心室收縮壓（LVSP)、左心室終末舒張壓（LVEDP)、左心室 內(nèi)壓最大上升速率（+dp/dtmax)、左心室內(nèi)壓最大下降速率（一dp/dtmax);記錄正常大鼠 各項(xiàng)指標(biāo)后，從尾靜脈推注35%普羅帕酬，注射標(biāo)準(zhǔn)為3ml/kg，3~5min推完，注射后記錄 5、10、15、20、30、40min上述指標(biāo)的變化，取血，離心分離血清，冷凍保存，測(cè)血清肌鈣蛋白水 平；
[0029] 步驟二、進(jìn)行心臟動(dòng)力學(xué)變化的測(cè)定、心臟指數(shù)的測(cè)定、心臟形態(tài)變化的測(cè)定、 ELISA法測(cè)定大鼠心肌肌鈣蛋白I (cTnl)。
[0030] 進(jìn)一步，對(duì)大鼠急性心衰模型的影響的實(shí)驗(yàn)中所述的心臟動(dòng)力學(xué)變化的測(cè)定的具 體方法為：
[0031] 于最后1次灌胃后Ih后（禁食不禁水12h)，大鼠用20%烏拉坦腹腔注射麻醉， 注射標(biāo)準(zhǔn)為lg/kg，將大鼠固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)，分離右頸總動(dòng)脈，遠(yuǎn)端結(jié)扎，近端夾閉血管，在動(dòng) 脈壁剪一小口，插入直徑為1mm帶肝素的心導(dǎo)管，經(jīng)壓力轉(zhuǎn)換器連接多導(dǎo)生理記錄儀，緩慢 推進(jìn)導(dǎo)管，觀察示波器，當(dāng)出現(xiàn)左室波型后停止推進(jìn)，穩(wěn)定2分鐘后記錄HR、左室收縮內(nèi)壓 (LVSP)、左室舒張末壓（LVEDP)、左室內(nèi)壓最大變化速率（±dp/dtmax)。
[0032] 進(jìn)一步，對(duì)大鼠急性心衰模型的影響的實(shí)驗(yàn)中所述的心臟指數(shù)的測(cè)定的具體方法 為：
[0033] 左室舒、縮功能測(cè)定完后，股動(dòng)脈放血處死動(dòng)物，取血分離血清測(cè)定血清LDH、BNP 和cTnl ;然后取全心稱重，再分離左心室稱重，計(jì)算全心指數(shù)和左心室指數(shù)；稱重前用吸水 紙吸去心臟內(nèi)的血液。
[0034] 進(jìn)一步，對(duì)大鼠急性心衰模型的影響的實(shí)驗(yàn)中所述的心臟形態(tài)變化的測(cè)定的具體 方法為：
[0035] 實(shí)驗(yàn)結(jié)束，處死大鼠，取心臟，切取約0. 5cm3左心室組織，10%甲醛固定，石蠟包 埋、切片、HE染色，進(jìn)行病理組織學(xué)檢查；評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：
[0036] 0分：正常；1分：輕度心肌纖維肥大，左室增厚，心肌輕度變性；2分：中度心肌纖 維肥大，左室增厚，心肌中度變性；3分：重度心肌纖維肥大、左室厚度、心肌重度變性。
[0037] 進(jìn)一步，所述的對(duì)水負(fù)荷大鼠模型的影響的實(shí)驗(yàn)的具體方法為：
[0038] 取清潔級(jí)體重180~200g大鼠，wistar，雄性，實(shí)驗(yàn)前先篩選大鼠泌尿作用，大鼠 禁食不禁水12h，灌服25ml/kg的生理鹽水，2h內(nèi)收集的尿量達(dá)到所灌入量的40%以上的 大鼠可用于利尿?qū)嶒?yàn)。取篩選合格的大鼠60只，隨機(jī)分為6組，每組10只；于實(shí)驗(yàn)前1天 晚上大鼠禁食不禁水，第2天各組大鼠分別按20ml/kg的灌胃體積灌服大、中、小劑量的口 服液、呋塞米片混懸液、芪藶強(qiáng)心膠囊混懸液和同體積的蒸餾水。立即輕壓下腹部使膀胱排 空，立即將大鼠放入代謝籠，每籠一只，每隔Ih記一次尿量，共計(jì)5h，收集給藥后5h的總尿 量，測(cè)尿液中Na+、K+、Cr的濃度。
[0039] 進(jìn)一步，所述的急性毒性實(shí)驗(yàn)的具體方法為：
[0040] 取體重19~22g小鼠40只，雌雄各半，隨機(jī)分為口服液組和生理鹽水對(duì)照組；實(shí) 驗(yàn)前禁食不禁水12h，口服液組按小鼠可灌服的最大體積灌服最大可灌服濃度的口服液混 懸液，并于1日之內(nèi)連給3次，每次間隔8h;生理鹽水對(duì)照組灌服同體積的生理鹽水。然后 給動(dòng)物以正常飲食，連續(xù)觀察14天。
【附圖說(shuō)明】
[0041] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的一種口服液對(duì)大鼠模型影響的實(shí)驗(yàn)方法流程圖。
【具體實(shí)施方式】