專利名稱：：熱蘊(yùn)血瘀證大鼠模型的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及大鼠模型的建立方法，尤其涉及熱蘊(yùn)血瘀證大鼠模型的建立方法及其鑒定，屬于中醫(yī)血瘀證基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：心腦血管疾病至今仍然是嚴(yán)重危害我國中老年人健康的復(fù)雜性重大疾病，也是世界醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的難題。血瘀證是中醫(yī)臨床中的常見基本證候，是冠心病、糖尿病、高血壓病和腦血管疾病發(fā)病的病理生理基礎(chǔ)。以血瘀證為切入點進(jìn)行證候?qū)嵸|(zhì)研究，具有深厚的理論基礎(chǔ)和豐富的臨床實踐。一方面，血瘀證的共同癥狀及體征在不同程度上都和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中心腦血管疾病的臨床血液流變學(xué)表現(xiàn)相關(guān)。另一方面，血瘀證和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)疾病研究中都存在著整體的思想。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，人是一個有機(jī)聯(lián)系著的統(tǒng)一整體。在組織結(jié)構(gòu)上，人體的各個臟腑器官都是整體的一個部分，在生命活動中必然受到整體的調(diào)控與制約，并且各個臟腑之間也通過經(jīng)絡(luò)、氣血等，相互聯(lián)通、相互影響。另一方面，維持人體基本機(jī)能活動的物質(zhì)，如精、氣、血、津液等分布運(yùn)行于全身各臟腑組織之間，互根互用、協(xié)調(diào)制約地完成著人的各種生理功能活動。西醫(yī)上也存在著整體觀念，進(jìn)入20世紀(jì)后，神經(jīng)說、體液說和塞里的"應(yīng)激學(xué)說"等都或顯或隱地體現(xiàn)著或支持著整體觀。進(jìn)入本世紀(jì)以來，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)在繼續(xù)精致地進(jìn)行"拆零"的同時，已經(jīng)萌發(fā)出一種新的傾向日趨強(qiáng)調(diào)須注重生命過程中廣泛存在著的種種聯(lián)系包括結(jié)構(gòu)上、功能上、代謝上、神經(jīng)方面、體液方面、免疫方面，乃致心身之間和內(nèi)在機(jī)能與外界環(huán)境之間的聯(lián)系等等。綜上所述，現(xiàn)代心腦血管疾病與血瘀證存在著病與證、客觀指標(biāo)與身體癥征以及整體結(jié)構(gòu)功能上的交叉。那么，兩者之間的對應(yīng)關(guān)系如何、兩者內(nèi)部是如何組合而發(fā)揮作用、受什么因素的調(diào)節(jié)而發(fā)展演變，現(xiàn)在還不清楚。為了揭示宏觀與微觀的內(nèi)在聯(lián)系、疾病的發(fā)展演變規(guī)律，建立實驗動物模型是首要的，是進(jìn)行實驗研究的基礎(chǔ)。中醫(yī)學(xué)把血瘀證看作是由四診信息表達(dá)的人體血行不暢或淤血內(nèi)阻所導(dǎo)致的病理生理整體反應(yīng)狀態(tài)，即凡離經(jīng)之血不能及時排出和消散,停留于體內(nèi)，或血行不暢,壅遏于經(jīng)脈,或淤積于臟腑組織器官，均稱為瘀血。由瘀血內(nèi)阻而引起的病變即為血瘀證，或稱瘀血證。熱蘊(yùn)血瘀證則是從病因角度上講的一種血瘀證，是由邪熱深入營血分，熱盛為毒，耗陰傷液，灼傷血絡(luò)，這些過程均可導(dǎo)致血瘀。因此提供一種以熱蘊(yùn)血瘀證為起點，建立熱蘊(yùn)血瘀證動物模型，以期揭示其本質(zhì)聯(lián)系，就成為該
技術(shù)領(lǐng)域：
急需要解決的技術(shù)難題。在現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)中，已知脂多糖(LPS)具有廣泛的生物活性，包括免疫、致炎、補(bǔ)體激活和熱原活性等，應(yīng)屬于中醫(yī)的熱邪、毒邪因素，故曾用來制作熱蘊(yùn)血瘀證動物模型，也是本實驗的造模因素。既往熱蘊(yùn)血瘀證動物模型，20世紀(jì)90年代多使用細(xì)菌作為造模因素，家兔作為實驗用動物，單次給藥造模；近年來，有人用LPS單次腹腔注射大鼠造模，也有人用LPS與角叉菜膠聯(lián)合誘導(dǎo)熱蘊(yùn)血瘀證和血栓形成病證結(jié)合動物模型。然而，上述的熱蘊(yùn)血瘀證動物模型穩(wěn)定性差；存活時間都很短，一般不超過24小時；模擬的癥狀與實際中醫(yī)臨床表現(xiàn)仍有差距；客觀上的檢測指標(biāo)也不夠統(tǒng)一。因此，用以往報告的模型對剖析"熱蘊(yùn)血瘀證"的生物學(xué)基礎(chǔ)似乎還缺乏足夠的科學(xué)依據(jù)。所以，本發(fā)明擬采用慢性、持續(xù)腹腔注射LPS的方法，堅持從中醫(yī)學(xué)視角觀察動物出現(xiàn)的"血瘀癥"表象，結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)，進(jìn)一步探討建立更可靠的"熱蘊(yùn)血瘀證"模型，即希望能夠在模型的相對穩(wěn)定性、規(guī)范指標(biāo)、病機(jī)剖析和可重復(fù)應(yīng)用性等方面有所前進(jìn)，以更便于揭示中醫(yī)"熱蘊(yùn)血瘀證"的現(xiàn)代生物學(xué)基礎(chǔ)，為開展相關(guān)的新藥研發(fā)提供實驗依據(jù)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種具有改進(jìn)的相對穩(wěn)定性、規(guī)范指標(biāo)、病機(jī)剖析和可重復(fù)應(yīng)用性的熱蘊(yùn)血瘀證大鼠模型。本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來達(dá)到的一種熱蘊(yùn)血瘀證大鼠模型，通過下述方法誘發(fā)對大鼠進(jìn)行脂多糖(LPS)腹腔注射，其特征在于所述的對大鼠進(jìn)行脂多糖(LPS)腹腔注射是對大鼠進(jìn)行連續(xù)的的脂多糖(LPS)腹腔注射，頻次為每周兩次，即依次相隔3天或4天注射一次。一種優(yōu)選技術(shù)方案，其特征在于所述的連續(xù)的脂多糖(LPS)腹腔注射為每周兩次并且連續(xù)注射l周、2周、4周或8周。一種優(yōu)選技術(shù)方案，其特征在于所述的LPS的注射劑量為每次2.5mg/Kg。一種優(yōu)選技術(shù)方案，其特征在于所述的LPS的注射濃度為2.5mg/ml。一種優(yōu)選技術(shù)方案，其特征在于所述的大鼠為成年雄性SD大鼠。有益效果通過本發(fā)明的技術(shù)方案形成的熱蘊(yùn)血瘀證動物模型穩(wěn)定性好、存活時間長、模擬的癥狀與實際中醫(yī)臨床表現(xiàn)及客觀上的檢測指標(biāo)較為統(tǒng)一，不僅在外觀上更接近血瘀證的表象，而且可以用一些更為詳盡的生物學(xué)指標(biāo)來判斷。下面結(jié)合附圖和具體實施方式對本發(fā)明進(jìn)一步說明，但并不意味著對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。圖1是不同時間點模型組和對照組大鼠的舌象照片；圖2是不同時間點模型組大鼠與正常對照組大鼠血清IL-l濃度的比較；圖3是不同時間點模型組大鼠與正常對照組大鼠血清TNF濃度比較；圖4是不同時間點模型組大鼠與正常對照組大鼠血小板聚集率比較；圖5是不同時間點模型組大鼠與正常對照組大鼠紅細(xì)胞聚集率比較；圖6是在切變率為600(S—')時，不同時間點模型組大鼠與正常對照組大鼠紅細(xì)胞變形比較；圖7是在切變率為800(S一')時，不同時間點模型組大鼠與正常對照組大鼠紅細(xì)胞變形比較；圖8是在切變率為1000(S—、時，不同時間點模型組大鼠與正常對照組大鼠紅細(xì)胞變形比較；圖9是不同時間點模型組大鼠與正常對照組大鼠血漿粘度比較；圖IO是在切變率為IO(S—、時，不同時間點模型組大鼠與正常對照組大鼠全血粘度比較；圖11是在切變率為60(S—、時，不同時間點模型組大鼠與正常對照組大鼠全血粘度比較；圖12是在切變率為150(S—')時，不同時間點模型組大鼠與正常對照組大鼠全血粘度比較；圖13是不同時間點模型組大鼠與正常對照組大鼠血清CH0濃度比較；圖14是不同時間點模型組大鼠與正常對照組大鼠血清TG濃度比較；圖15是不同時間點模型組大鼠與正常對照組大鼠血清HDL濃度比較；圖16是不同時間點模型組大鼠與正常對照組大鼠血清LDL濃度比較；圖17是不同時間點模型組大鼠與正常對照組大鼠血液FIB濃度比較；圖18是不同時間點模型組大鼠與正常對照組大鼠血液PT比較；圖19是不同時間點模型組大鼠與正常對照組大鼠血液APTT比較；圖20是不同時間點模型組大鼠與正常對照組大鼠血液TT比較；圖21是模型組和對照組大鼠的海馬小膠質(zhì)細(xì)胞圖，A為正常對照組海馬小膠質(zhì)細(xì)胞，E為LPS作用1周后海馬小膠質(zhì)細(xì)胞，F(xiàn)為LPS作用2周后海馬小膠質(zhì)細(xì)胞，G為LPS作用4周后海馬小膠質(zhì)細(xì)胞，H為LPS作用8周后海馬小膠質(zhì)細(xì)胞。免疫組織化學(xué)染色(X10);圖22是不同時間點模型組大鼠與正常對照組大鼠腦內(nèi)0X-42陽性小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目比較；圖23是模型組和對照組大鼠的下丘腦IL-1陽性細(xì)胞圖，A為正常對照組，E為LPS作用1周后下丘腦IL-1陽性細(xì)胞，F(xiàn)為LPS作用2周后下丘腦IL-1陽性細(xì)胞，G為LPS作用4周后下丘腦IL-1陽性細(xì)胞，H為LPS作用8周后下丘腦IL-1陽性細(xì)胞。免疫組織化學(xué)染色(X10);圖24是不同時間點模型組大鼠與正常對照組大鼠腦內(nèi)IL-1陽性細(xì)胞數(shù)目比較。具體實施例方式一制作材料1實驗用動物成年雄性SD大鼠(Sprague-Dawleyrats)，體重190-210g，SPF級，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證號SCXK(京2002—0003)。2主要試劑2.5rag/mlLPS(大腸埃希菌屬055:B5，Sigma公司)二熱蘊(yùn)血瘀證模型大鼠的制作SD大鼠80只，自由飲食、進(jìn)水，按隨機(jī)數(shù)字表法將動物分為模型組(n=48)和正常對照組(n二32)，實驗組每個時間點12只，對照組每個時間點8只。注射前，稱量大鼠體重，實驗組腹腔注射LPS，劑量為2.5mg/Kg，LPS的注射濃度為2.5mg/ml;對照組腹腔注射生理鹽水2.5mg/Kg。每周注射2次，周一和周四各一次。四個實驗組及對照組分別連續(xù)注射1周、2周、4周和8周，獲得熱瘟血瘀證大鼠模型。如果每周注射2次，周一和周五各一次，連續(xù)注射1周、2周、4周或8周也可以獲得相似的結(jié)果。表l不同時間點模型的制作方法<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>三熱蘊(yùn)血瘀證模型大鼠的表征和生物學(xué)檢測(一)癥征觀察觀察不同時間點模型組和對照組大鼠的癥征表現(xiàn)，主要包括體重增加值、進(jìn)食量、活動情況、皮毛、爪甲色澤、尾部、耳廓、眼部和大便。(二)舌象采集大鼠在不同時間點處死前一天，用6%水合氯醛溶液，按O.6ml/100g體重的劑量腹腔注射麻醉。具體操作程序如下1將照相機(jī)固定在翻拍架上，調(diào)節(jié)相機(jī)高度使鏡頭離翻拍架平板距離13cm處；2兩日光燈管的兩個底座分別放在翻拍架兩側(cè)的桌面上，燈管方向朝下，一個日光燈置于相機(jī)與固定架之間，另個日光燈固定在距離其15cm距離的地方，連接電源；3將麻醉鼠仰臥位平放于翻拍臺，比色卡平放在鼠的右側(cè)(勿巻曲)，使比色卡的9、ll圖光照無反光；4用無齒鑷與鼠舌體斜30度夾角夾住舌尖0.5cm位置，向鼠左側(cè)平行于桌面輕輕拉出舌，使舌體右側(cè)緣靠近下牙左側(cè)，拉出舌頭長度以舌尖抵達(dá)鼻近心端為度；5照相機(jī)在自動模式、以5MF畫質(zhì)(右下角F鍵調(diào))，微距、去閃光燈條件下進(jìn)行照相。(三)血清炎癥因子的檢測1所用儀器外科手術(shù)器械及手術(shù)用敷料等國產(chǎn)血清生化管國產(chǎn)動脈插管自備低速離心機(jī)國產(chǎn)-80。C低溫冰箱美國ThermoForma臺式電腦國產(chǎn)Y記數(shù)器美國2主要試劑水合氯醛(中國沈陽試劑廠)，肝素鈉(上海)，0.9%生理鹽水、氯化鈉(NaCl)、白細(xì)胞介素ie放免試劑盒(解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免所)、腫瘤壞死因子放免試劑盒(解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免所)。3血清樣品的制備3.1.動物麻醉腹腔注射6y。水合氯醛6ml/Kg大鼠體重。3.2.頸總動脈的分離動物仰臥位固定在鼠板上，備皮，頸部正中切口，依次分離皮下組織、肌肉層，找到頸總動脈鞘，分離神經(jīng)，使頸總動脈游離，并穿二根棉線備用。3.3.頸總動脈切口、插管結(jié)扎頭端頸總動脈，近心端用動脈夾夾閉，用眼科剪在動脈夾和頭端結(jié)扎線之間剪一小口，將動脈插管插向心臟方向，并用棉線結(jié)扎固定。3.4.血液的采集打開動脈夾，迅速用血清生化管收集血液，室溫放置；隨后，處死動物。3.5.血清樣品的制備將血液在離心機(jī)上3500轉(zhuǎn)/分離心，取上清液，置于-80'C冰箱保存?zhèn)溆谩?用放射免疫學(xué)方法檢測IL-13和TNFa結(jié)果計算由自動Y計數(shù)器預(yù)先編制程序，直接給出有關(guān)參數(shù)，標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品濃度。(四)血液流變學(xué)的檢測l主要儀器外科手術(shù)器械及手術(shù)用敷料等國產(chǎn)血凝試驗管國產(chǎn)血漿生化管國產(chǎn)動脈插管自備低速離心機(jī)國產(chǎn)LBY-N6B全自動自清洗血流變儀北京普利生公司LBY-BX紅細(xì)胞變形儀北京普利生公司LBY-NJ4血小板聚集儀北京普利生公司C-2000血凝儀購自北京普利生公司北京普利生公司臺式電腦國產(chǎn)天平國產(chǎn)2血液流變學(xué)的檢測指標(biāo)包括2.1血粘度的檢測2.2紅細(xì)胞變形和聚集的檢測2.3血小板聚集的檢測2.4凝血功能的檢測常用凝血四項(PT:凝血酶原時間、TT:凝血酶時間、FIB:纖維蛋白原、APTT:活化部分凝血活酶時間)試劑與血漿常規(guī)加樣量項目PTTTAPTTFIB試劑200100100100血漿100200100200Ca€l2100(五)血脂的檢測包括1膽固醇的檢測2甘油三酯的檢測3高密度脂蛋白的檢測4低密度脂蛋白的檢測(六)腦內(nèi)炎性因子的檢測1主要儀器精密電子天平日本TokyopH計美國ORION電子天平MP200-181-2型恒溫磁力攪拌器HY-4調(diào)速多用振蕩器電熱恒溫干燥箱ZMD-2自動磨刀機(jī)HL-3恒流灌流儀冰凍恒冷切片機(jī)電磁爐低速離心機(jī)外科手術(shù)器械及手術(shù)用敷料等北京醫(yī)用離心機(jī)廠國產(chǎn)上海醫(yī)械模具廠上海市滬西儀器廠德國Leica中國南海中國上海司樂儀器廠中國深圳北京恒星醫(yī)療器械廠2檢測指標(biāo)包括0X-42IL-1P3OX-42陽性細(xì)胞計數(shù)和IL-IP陽性細(xì)胞計數(shù)根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜，取前囟后-1.8至前囟后-3.4的連續(xù)切片，每隔6張切片取1張，共計6張，IOX視野下，應(yīng)用QWin圖像分析軟件，海馬部位計數(shù)0X-42陽性神經(jīng)元的數(shù)目，下丘腦部位計數(shù)IL-10陽性細(xì)胞數(shù)目。(七)結(jié)果觀察及半定量分析采用SPSS11.5通用統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。結(jié)果以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)誤(X士SE)表示;各給藥時間點內(nèi)以t檢驗比較差異的顯著性。四熱蘊(yùn)血瘀證模型大鼠的表征和檢測結(jié)果(一)身體癥征給藥3小時后，模型大鼠身體蜷縮，活動減少，毛發(fā)豎起；給藥1天后，模型大鼠體重下降，活動減少，進(jìn)食下降，稀便；給藥3天后，模型大鼠體重下降，活動、進(jìn)食仍低于正常，稀便；給藥1周后，模型組大鼠與對照組相比體重增加緩慢，進(jìn)食下降，活動減少，稀便；給藥2周后，模型組大鼠與對照組相比體重仍增加緩慢，繼續(xù)表現(xiàn)進(jìn)食下降，可見毛發(fā)變黃，尾部光澤減退，便溏；給藥4周后，模型組大鼠與對照組相比活動減少，毛發(fā)明顯變黃，爪甲呈淡粉色，眼睛分泌物增多，尾部變枯燥；給藥8周后，模型組大鼠與對照組相比活動減少，皮毛枯黃，爪甲枯燥，尾部紫暗，眼睛分泌物多，多處于閉目狀，大便異常臭穢。正常對照組大鼠舌質(zhì)紅潤；l周和2周模型組大鼠舌質(zhì)稍暗，津液減少；4周(二)舌象模型組大鼠舌質(zhì)稍暗，津液減少，舌下靜脈顯現(xiàn)長度變長；8周模型組大鼠舌質(zhì)暗，干澀，舌下靜脈加長更顯著(圖l)。(三)大鼠血清IL-1P、TNF-a的變化用放射性免疫法檢測血清IL-1P、TNF-a發(fā)現(xiàn)，l周、2周、4周、8周點模型組大鼠與對照組相比無顯著性差異(圖2、圖3)。(四)大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)的變化通過血小板聚集儀的檢測發(fā)現(xiàn)，給藥8周模型組大鼠血小板聚集率(74.15±1.69)%比對照組血小板聚集率(64.36±1.23)%顯著升高，其余時間點模型組大鼠血小板聚集率與對照組相比無顯著性差異(圖4)。通過紅細(xì)胞變形儀的檢測發(fā)現(xiàn)，給藥1周、2周、4周、8周模型組大鼠紅細(xì)胞聚集率與對照組相比無顯著性差異(圖5);在切變率為600(S—')、800(S1)、1000(S—1)時，1周模型大鼠紅細(xì)胞變形指數(shù)(50.69±1.42)、(53.91±1.33)、(55.62±1.21)，分別比對照組紅細(xì)胞變形指數(shù)(41.90±4.00)、(44.62±4.10)、(46.23±4.21)顯著升高，而2周模型大鼠紅細(xì)胞變形指數(shù)(40.27土1.49)、(43.12±1.44)、(44.53±1.40)，分別比對照組紅細(xì)胞變形指數(shù)(49.02士1.07)、(51.67±1.04)、(52.92±1.ll)顯著降低，其余時間點模型大鼠紅細(xì)胞變形與對照組相比無顯著性差異(圖6，圖7，圖8)。通過血液流變儀的檢測發(fā)現(xiàn)，給藥4周、8周模型大鼠血漿粘度(0.96±0.02)、(1.12±0.09)，分別比對照組大鼠血漿粘度(0.87±0.03)、(0.89±0.03)顯著升高，其余時間點模型大鼠血漿粘度與對照組相比無顯著性差異(圖9);在切變率為10(S—、60(S—"、150(S—"時，l周模型大鼠全血粘度(8.46土0.85)、(5.82±0.60)、(4.50±0.40)，分別比對照組全血粘度(15.10±1.47)、(8.76±0.53)、(6.68±0.77)顯著降低，其余時間點模型大鼠全血粘度與對照組相比無顯著性差異(圖IO，圖ll，圖12)。(五)通過全自動生化分析儀檢測顯示8周模型大鼠血清CHO(l.96±0.09)g/L，分別比對照組血清CHO(l.69±0.08)g/L顯著升高，其余時間點模型大鼠血清CHO與對照組相比無顯著性差異(圖13);4周模型大鼠血清TG(0.95±0.05)g/L，分別比對照血清TG(0.82±0.02)g/L顯著升高，給藥1周、2周、4周、8周模型大鼠血清TG與對照組相比無顯著性差異(圖14);8周模型大鼠血清HDL(0.83±0.04)g/L比對照血清HDL(O.69±0.03)g/L顯著升高，其余時間點模型大鼠血清HDL與對照組相比無顯著性差異(圖15);4周和8周模型大鼠血清LDL(0.09±0.01)g/L、(0.17±0.02)g/L，分別比對照組血清LDL(0.07±0.01)g/L、(0.11±0.02)g/L顯著升高，其余時間點模型大鼠血清LDL與對照組相比無顯著性差異(圖16)。(六)凝血功能通過血凝儀檢測發(fā)現(xiàn)，1周模型大鼠FIB(4.09±0.14)g/L，分別比對照組FIB(3.20±0.31)g/L顯著升高，其余時間點模型大鼠FIB與對照組相比無顯著性差異(圖17);給藥1周、2周、4周、8周模型大鼠血液PT、APTT、TT模型大鼠與對照組相比均無顯著性差異(圖18、19、20)。通過免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，0X-42陽性小膠質(zhì)細(xì)胞整個腦區(qū)都有分布，尤其是海馬。通過QWIN軟件進(jìn)行海馬陽性細(xì)胞計數(shù)發(fā)現(xiàn)，l周、2周、4周和8周模型大鼠腦內(nèi)0X-42陽性的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)(234±35)、(180±19)、(364±51)、(379±39)，比對照組0X-42陽性的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)(90±14)顯著增多(圖21，圖22)。通過免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，IL-ie陽性細(xì)胞在整個腦區(qū)都有分布，尤其是下丘腦、腦室周圍、邊緣皮質(zhì)。通過QWIN軟件進(jìn)行下丘腦陽性細(xì)胞計數(shù)發(fā)現(xiàn)，2周和4周模型大鼠腦內(nèi)IL-ie陽性的細(xì)胞數(shù)(497±40)、(559±27)，比對照組IL-1P陽性的細(xì)胞數(shù)(218±117)顯著增多；l周和8周模型大鼠腦內(nèi)IL-ie陽性的細(xì)胞數(shù)與對照組IL-ie陽性的細(xì)胞數(shù)相比無顯著差異(圖23，圖24)。在持續(xù)一定時間注射LPS后，大鼠的表現(xiàn)很類似中醫(yī)血瘀證臨床癥狀。SD大鼠持續(xù)8周腹腔注射內(nèi)毒素的過程中，大鼠呈現(xiàn)持續(xù)體重增加緩慢、進(jìn)食下降和活動減少，皮毛由潤澤變枯黃，爪甲由淡粉色變枯燥，尾部光澤減退,逐漸紫暗，眼睛分泌物增多，多處于閉目狀，大便臭穢。拍攝舌象顯示,大鼠舌質(zhì)最初紅潤，隨后逐漸變暗,津液減少，舌下靜脈變長。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為"有諸內(nèi)必形諸外"，即形之于外的證候是中醫(yī)診斷疾病的核心內(nèi)容，也決定了任何中醫(yī)證候模型的認(rèn)定依據(jù)應(yīng)該以表征為主。參照1986年中國中西醫(yī)結(jié)合研究會補(bǔ)充修訂的《血瘀證診斷標(biāo)準(zhǔn)》，具有該證的人應(yīng)該有下述表現(xiàn)"a舌質(zhì)紫暗或舌體瘀斑、瘀點，舌下脈曲張瘀血；d血管異常，人體各部位的靜脈曲張，毛細(xì)血管擴(kuò)張，血管痙攣，唇及肢端紫紺，血栓形成，血管阻塞；e血不循經(jīng)而停滯及出血后引起的瘀血、黑糞、皮下瘀斑等，或血性腹水；f月經(jīng)紊亂、經(jīng)期腹痛、色黑而有血塊、少腹急結(jié)等；面部、唇、齒齦及眼周紫黑者；其他依據(jù)如肌膚甲錯(皮膚粗糙、肥厚、鱗屑增多)"。這些表現(xiàn)和本發(fā)明在大鼠慢性注射LPS后全身的表現(xiàn)基本相符。因此認(rèn)為，持續(xù)腹腔注射LPS后1周至8周階段的SD雄性大鼠已經(jīng)模擬了相當(dāng)于人"熱蘊(yùn)血瘀證"的客觀表現(xiàn)，因此,對其各種生物學(xué)指標(biāo)的動態(tài)觀察可以反映"熱蘊(yùn)血瘀證"的客觀變化。本發(fā)明動物模型客觀指標(biāo)的變化在一定程度上揭示了中醫(yī)熱蘊(yùn)血瘀證的現(xiàn)代生物學(xué)基礎(chǔ)。由LPS引發(fā)的持續(xù)內(nèi)毒素血癥，可以導(dǎo)致組織器官的缺血、缺氧、血循環(huán)障礙等方面的異常。中醫(yī)所說的"熱邪、毒邪"入侵人體后，也會繼發(fā)"熱盛為毒,營陰暗耗，絡(luò)損津傷,熱瘀交結(jié)"等中醫(yī)學(xué)所描述的病理變化，即所謂"熱蘊(yùn)血瘀證"。本實驗結(jié)果顯示，給藥l周，紅細(xì)胞變形、FIB顯著升高，全血粘度顯著降低；給藥2周，紅細(xì)胞變形性顯著降低；給藥4周，血漿粘度、TG顯著升高；給藥8周，血小板聚集率、血漿粘度、CH0、HDL、LDL顯著升高。將大鼠的這些血液和循環(huán)方面的改變結(jié)合其表征變化可以看出，處于中醫(yī)所謂"熱蘊(yùn)血瘀證"的大鼠于發(fā)病后l周內(nèi)主要是炎癥所致血液的低凝狀態(tài)伴隨血脂的先升高而后降低；1周至4周主要是血液粘度的變化及紅細(xì)胞功能的改變；4周至8周逐漸形成高脂血癥、血小板聚集增強(qiáng)及血漿粘度的升高。其中血液的低凝狀態(tài)、血脂的異常、血細(xì)胞的功能異常和血粘度的異常，綜合表現(xiàn)為末梢循環(huán)障礙、血流異常等。這是最終導(dǎo)致組織器官缺血、缺氧、變性的基礎(chǔ)。從中醫(yī)角度上看，"熱蘊(yùn)"引發(fā)人的"營陰暗耗，絡(luò)損津傷，熱瘀交結(jié)"，最終就會導(dǎo)致"血溢成瘀、臟器統(tǒng)攝失權(quán)"。由此可見，盡管人的疾病進(jìn)程與大鼠會有很大不同，但兩者表現(xiàn)仍然十分相似。有關(guān)"血瘀證"的生物學(xué)基礎(chǔ)，劉杰文等曾認(rèn)為是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)概念中各種致病因子所造成的全身或局部組織器官的缺血、缺氧、血瘀、血循環(huán)障礙、血液流變性及粘滯性異常；關(guān)現(xiàn)軍也認(rèn)為與血液流變性、血液凝固性及纖溶活性等病理障礙有密切關(guān)系；王殿俊認(rèn)為是內(nèi)毒素與血液體液成份的相互作用導(dǎo)致炎癥損傷、微循環(huán)障礙；楊進(jìn)認(rèn)為是微循環(huán)障礙，血液流變學(xué)異常，凝血功能亢進(jìn)，以及主要臟器廣泛微血栓形成。上述觀點均來自于急性病理狀態(tài)，雖然揭示了"熱蘊(yùn)血瘀證"的部分現(xiàn)代生物學(xué)基礎(chǔ)，但尚未論及其動態(tài)過程。根據(jù)本發(fā)明結(jié)果及傳統(tǒng)中醫(yī)理論，可以看到中醫(yī)"熱蘊(yùn)血瘀證"是一個動態(tài)變化的證候，其現(xiàn)代生物學(xué)基礎(chǔ)首先應(yīng)是炎癥反應(yīng)并波及血液內(nèi)各種成分變化和凝血機(jī)制變化，然后會引起微循環(huán)障礙和血液流變的異常，最終才導(dǎo)致組織器官的缺血、缺氧、血瘀和變性。這一過程初步揭示了中醫(yī)"熱蘊(yùn)血瘀證"證候的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)本質(zhì)。權(quán)利要求1.一種熱蘊(yùn)血瘀證大鼠模型，通過對大鼠進(jìn)行連續(xù)的LPS腹腔注射來誘發(fā)，其特征在于所述的連續(xù)的LPS腹腔注射為每周兩次，即依次相隔3天或4天注射一次。2、如權(quán)利要求1所述的熱蘊(yùn)血瘀證大鼠模型，其特征在于所述的連續(xù)的LPS腹腔注射為為每周兩次并且連續(xù)注射l周、2周、4周或8周。3、如權(quán)利要求1或2所述的熱蘊(yùn)血瘀證大鼠模型，其特征在于所述的LPS的注射劑量為2.5mg/Kg。4、如權(quán)利要求3所述的熱蘊(yùn)血瘀證大鼠模型，其特征在于所述的LPS的注射濃度為2.5mg/ml。5、如權(quán)利要求4所述的熱蘊(yùn)血瘀證大鼠模型，其特征在于所述的大鼠為成年雌性SD大鼠。全文摘要本發(fā)明涉及一種熱蘊(yùn)血瘀證大鼠模型，通過對大鼠進(jìn)行連續(xù)的LPS腹腔注射來誘發(fā)，其特征在于所述的連續(xù)的LPS腹腔注射為每周兩次，即依次相隔3天或4天注射一次。本發(fā)明的熱蘊(yùn)血瘀證大鼠模型，通過對大鼠進(jìn)行連續(xù)的LPS腹腔注射來誘發(fā)，建立的熱蘊(yùn)血瘀證動物模型穩(wěn)定性好、存活時間長、模擬的癥狀與實際中臨床表現(xiàn)及客觀上的檢測指標(biāo)較為統(tǒng)一，不僅在外觀上更接近血瘀證的表象，而且可以用一些更為詳盡的生物學(xué)指標(biāo)來判斷。文檔編號A01K67/027GK101366951SQ200810223589公開日2009年2月18日申請日期2008年10月8日優(yōu)先權(quán)日2008年10月8日發(fā)明者巖周,孫曉紅,徐群淵,林李,超楊,歡江,田金洲申請人:首都醫(yī)科大學(xué)