專利名稱：：具有改良生物利用率的橄欖果實(shí)或葉提取物的磷脂復(fù)合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：對(duì)于油橄欖(Oleaeuropea)活性成分的研究已經(jīng)進(jìn)行了數(shù)十年，其性質(zhì)最近在實(shí)驗(yàn)和臨床研究中被證實(shí)。1已經(jīng)報(bào)道了在葉中可檢測(cè)到的主要成分橄攬苦苷是用于低血壓、冠狀擴(kuò)張和抗心率不齊作用的的化合物。在一項(xiàng)研究中2，在鹽-敏感的遺傳性高血壓大鼠模型中，證實(shí)了從油皿葉中分離的三辟類化合物的抗高血壓、利尿、抗動(dòng)脈硬化、抗氧化、和降血糖作用。皿葉提取物還包含其它協(xié)同植物化學(xué)物，包括蕓香苷和橙皮苷。它們?cè)黾用?xì)血管(血管)的強(qiáng)度和調(diào)節(jié)其通透性的能力是重要的。就橄欖油而言，一些研究已經(jīng)顯示其中包含的酚類化合物的重要作用。主要成分酪醇、毛蕊花苷和羥酪醇是體內(nèi)LDL氧化的有效抑制劑3"，所述LDL氧化與動(dòng)脈粥樣硬化斑的形成相關(guān)聯(lián)，所述動(dòng)脈粥樣硬化斑的形成被假定是促成冠心病發(fā)展的因素。已經(jīng)報(bào)道了羥酪醇單獨(dú)減少冠心病和動(dòng)脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)5-6，在體外是疏酸銅誘導(dǎo)的LDL氧化的強(qiáng)力和劑量依賴型抑制劑。這些結(jié)果也在動(dòng)物模型中獲得。7已經(jīng)證明了毛蕊花苷具有對(duì)于超氧陰離子和羥自由基的強(qiáng)力凈化作用，8-9并且也作用為抗氧化劑抑制小鼠肝微粒體、大鼠肝線粒體的過(guò)氧化作用、自由基誘導(dǎo)的紅細(xì)胞的emolysis;在許多其它實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭酗@示了其抗氧化潛力。近期的研究證明了初榨橄欖油酚成分(例如羥酪醇和其裂環(huán)烯醚萜類化合物衍生物和代謝物)——即具有正二酚(ortho-diphenolic)結(jié)構(gòu)的化合物——行使強(qiáng)的抗氧化以及其它生物學(xué)相關(guān)作用。1(M1雖然大多數(shù)這些結(jié)果已經(jīng)在體外系統(tǒng)中獲得，12—13也聚集了橄欖油酚類的生物學(xué)活性的證據(jù)。14_15羥酪醇(HT)明顯是最有活性的橄欖酚，已經(jīng)顯示其在人中是劑量依賴性被吸收的，但是根據(jù)其配制達(dá)到不同的程度。例如與作為特級(jí)初榨橄欖油的天然成分施用后的生物利用率相比，摻入酸乳酪中降低了其生物利用率。因此，非常希望找到具有改良的生物利用率的新的橄欖果實(shí)或葉提取物的衍生物。在EP209038、EP275005、EP283713、EP1035859和EP1140115中已經(jīng)公開了具有天然、合成或半合成磷脂的植物提取物或其純化的成分的復(fù)合化合物(complexcompound)。提及的復(fù)合物改良了提取物或純化的成分的血漿生物利用率，這是由于它們的親脂性。EP275005說(shuō)明了在非質(zhì)子溶劑中進(jìn)行復(fù)合物的形成。EP1140115—般性地提及了在多種溶劑中乙醇可以用于制備所提及的復(fù)合物，但是未提供使用乙醇作為溶劑的制備實(shí)例。此外，公開的復(fù)合物是原花色素A2的磷脂復(fù)合物，其在化學(xué)結(jié)構(gòu)上極大地不同于本發(fā)明的橄欖果實(shí)或葉提取物的磷脂復(fù)合物。發(fā)明公開本發(fā)明涉及橄欖果實(shí)或葉提取物的磷脂復(fù)合物。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，與未配制的橄欖果實(shí)或葉乙醇提取物相比，本發(fā)明的磷脂復(fù)合物提供了更高的親本物質(zhì)(parentagent)的全身水平。因此，本發(fā)明涉及具有改良的生物利用率的新的橄欖果實(shí)或葉提取物的磷脂復(fù)合物。在第一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及橄欖果實(shí)或葉的含水提取物的磷脂復(fù)合物；在第二個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及橄欖果實(shí)或葉的乙醇或水-乙醇提取物的磷脂復(fù)合物。根據(jù)本發(fā)明，可以使用植物或合成來(lái)源的磷脂，特別優(yōu)選是豆(soy)磷脂，例如磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺。根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)將磷脂添加到溶解在質(zhì)子溶劑中的橄欖果實(shí)或葉提取物來(lái)制備復(fù)合物，更特別是將磷脂添加到橄欖果實(shí)或葉的提取物的乙醇溶液中(在回流下并且具有攪拌)。將得到的懸液在減少的壓力下濃縮至剩余物(residue),然后將所述剩余物干燥。磷脂對(duì)橄欖果實(shí)或葉提取物的比例范圍從10至1w/w，更優(yōu)選的摩爾比為5:1w/w。本發(fā)明還涉及包含作為活性成分的一種根據(jù)本發(fā)明的橄欖果實(shí)或葉提取物的磷脂復(fù)合物(與適當(dāng)?shù)乃幬镙d體混合)的藥物組合物。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的橄欖果實(shí)或葉提取物的磷脂復(fù)合物的用途，用于制備具有化學(xué)預(yù)防、抗氧化和心血管疾病預(yù)防作用的藥物。下列實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明了本發(fā)明。實(shí)施例橄欖果實(shí)或葉提取物的制備如下制備用于實(shí)施例3和4中的橄欖果實(shí)提取物。將新鮮的油橄欖(e"卬/mefl丄.)果實(shí)(橄欖)碾碎、揉捏并且離心以移除油和部分的植物水。然后將獲得的材料(橄欖渣)用含水乙醇(乙醇:水6:4)在60。C提取，耗盡的果渣被排出。將提取物過(guò)濾、匯聚并且濃縮以除去乙醇，并且通過(guò)離心除去水不溶性雜質(zhì)。在減少的壓力下將澄清的溶液蒸發(fā)以獲得干的橄欖果實(shí)純化的提取物(通過(guò)Folin-Ciocalteau測(cè)定的總酚含量9.5%w/w)。將這一提取物在吸附樹脂上進(jìn)一步純化以獲得30%w/w(Folin-Ciocalteau測(cè)定)的總酚含量，然后將所述提取物用于實(shí)施例1和2中。用于實(shí)施例5中的提取物的制備與用于實(shí)施例3和4中的提取物的制備類似，唯一的不同是用純水提取橄欖渣。不同的是，實(shí)施例6和7中使用的葉提取物通過(guò)用含水乙醇(乙醇水9:1)在70。C提取油橄欖葉制備。將提取物過(guò)濾、匯聚并且濃縮以除去乙醇，通過(guò)離心將水不溶性雜質(zhì)移除并且排出。在減少的壓力下將澄清的溶液干燥以獲得干的橄欖葉純化的提取物(HPLC測(cè)定的多酚含量20.8%w/w)，其被用于實(shí)施例6中?？蓪⑦@一提取物在吸附樹脂上進(jìn)一步純化以獲得41.6%w/w(HPLC測(cè)定)的總酚含量，然后用于實(shí)施例7。實(shí)施例1-橄欖果實(shí)純化的乙醇提取物的磷脂復(fù)合物的制備在機(jī)械攪拌下，將豆磷脂(150g)緩慢添加到回流乙醇(1.61)中。將懸液回流l小時(shí)(伴隨攪拌)，然后添加保持在60。C的100ml含水醇(乙醇-水7.5:2.5)中的50g橄攬果實(shí)純化的提取物(通過(guò)Folin-Ciocalteau測(cè)定的總酚30%w/w;HPLC測(cè)定毛蕊花苷7.38%w/w)的溶液。在完成添加后，將混合物在攪拌下回流1小時(shí)，然后過(guò)濾。通過(guò)蒸餾將得到的溶液濃縮至70%w/w干燥剩余物，然后在真空下在40。C干燥68小時(shí)。獲得158g的產(chǎn)物，所述產(chǎn)物具有8.86%w/w總酚含量(通過(guò)Folin-Ciocalteau測(cè)定)和2.24%w/w毛蕊花苷含量(HPLC測(cè)定)。有機(jī)溶劑中產(chǎn)物的溶解度顯著不同于起始提取物。事實(shí)上，盡管起始的純化的提取物在二氯甲烷、氯仿和丙酮中是不可溶的，并且在乙醇中僅部分可溶，復(fù)合的提取物在二氯甲烷和氯仿中是可溶的并且在丙酮和乙醇中是不可溶的。，H，"C和"P-NMR鐠證實(shí)了復(fù)合物形成。來(lái)自"P-NMR分析的最重要的數(shù)據(jù)在表1中報(bào)道。未復(fù)合的磷脂在CDCl3"P-NMR譜中在80.3具有尖銳信號(hào)，如表l中條目l和3所顯示的。相反，復(fù)合的磷脂在80.7(參見A值)時(shí)具有更加寬的多的信號(hào)，如相同表中條目2所顯示的。在CDCl3中，〗H和"C核與"P具有相同的行為。質(zhì)子和碳譜顯示在附件中。表1.31P-NMR(121.380MHz,CDC13，30。C)數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實(shí)施例2-橄欖果實(shí)純化的乙醇提取物的磷脂酰膽堿復(fù)合物的制備將100g的磷脂酰膽堿溶解在1.61的乙醇中。將混合物在機(jī)械攪拌下回流，然后逐滴加入到溶液中，所述溶液是將50g的橄欖果實(shí)純化的提取物(通過(guò)Folin-Ciocalteau測(cè)定的總酚30%w/w，HPLC測(cè)定毛蕊花苷7.38%w/w)溶解在保持在60。C的100ml含水醇(乙醇-水7.5:2.5)中獲得的。在添加完成后，將混合物在攪拌下回流l小時(shí)，然后濃縮至70%w/w干燥剩余物，并且最終在真空下在40°C干燥68小時(shí)。獲得150g的產(chǎn)物，所述產(chǎn)物具有10%w/w總酚含量(通過(guò)Folin-CiocalteauUV測(cè)定)和2.46%w/w毛蕊花苷含量(通過(guò)HPLC測(cè)定)。該產(chǎn)物的NMR譜與在實(shí)施例1中獲得的那些類似。實(shí)施例3-橄枧果實(shí)乙醇總提取物的磷脂復(fù)合物的制備在機(jī)械攪拌下，將150g磷脂緩慢添加到1.6l回流乙醇中。添加完成后，將懸液回流l小時(shí)(伴隨攪拌)。逐滴添加保持在60。C的100ml含水醇(乙醇-水7.5:2,5)中的50g橄欖果實(shí)純化的提取物(通過(guò)Folin-Ciocalteau測(cè)定的總酚含量9.5%w/w)的溶液。在完成添加后，將混合物在攪拌下回流1小時(shí)，然后過(guò)濾。將得到的溶液濃縮至70%w/w干燥剩余物，然后在真空下在40'C干燥68小時(shí)。獲得167g的橄欖果實(shí)總提取物的豆磷脂復(fù)合物，所述復(fù)合物具有2.7%w/w總酚含量(通過(guò)Folin-CiocalteauUV測(cè)定)。產(chǎn)物的NMR譜與在實(shí)施例1中獲得的那些類似。實(shí)施例4-橄欖果實(shí)乙醇總提取物的磷脂酰膽堿復(fù)合物的制備在機(jī)械攪拌下，將100g磷脂酰膽堿溶解在700ml的乙醇中，并且將混合物回流。逐滴添加保持在60。C的100ml含水醇(乙醇-7JC7.5:2.5)中的50g橄欖果實(shí)純化的提取物(通過(guò)Folin-Ciocalteau測(cè)定的總酚含量9.5。/。w/w)的溶液。在完成添加后，將混合物在攪拌下回流l小時(shí)，然后將溶液通過(guò)在大氣壓下蒸餾濃縮至70%w/w干燥剩余物，然后在真空下在4(TC干燥68小時(shí)。獲得175g的產(chǎn)物，所述產(chǎn)物具有4.1%w/w總酚含量(通過(guò)Folin-CiocalteauUV測(cè)定)。產(chǎn)物的NMR語(yǔ)與在實(shí)施例1中獲得的那些類似。實(shí)施例5-橄欖果實(shí)含水總提取物的磷脂復(fù)合物的制備將100g磷脂溶解在乙醇(1250ml)中并且回流(伴隨著機(jī)械攪拌)。將50g的橄欖果實(shí)含水總提取物(通過(guò)Folin-Ciocalteau測(cè)定的總酚含量6.8%w/w)緩慢添加到混合物中。在完成添加后，將混合物在攪拌下回流l小時(shí)，然后過(guò)濾。將得到的溶液濃縮至70%w/w千燥剩余物，然后在真空下在4(TC干燥68小時(shí)。獲得139g的產(chǎn)物，所述產(chǎn)物具有2.3%w/w總酚含量(通過(guò)Folin-CiocalteauUV測(cè)定)。產(chǎn)物的NMR諳與在實(shí)施例1中獲得的那些類似。實(shí)施例6-橄欖葉乙醇總提取物的磷脂酰膽堿復(fù)合物的制備將100g的橄欖葉總水醇提取物(HPLC測(cè)定的多酚含量20.8%w/w)溶解在2570ml乙醇中的128g的磷脂酰膽堿的溶液中。將得到的溶液回流l小時(shí)，然后在減少的壓力下濃縮至具有70。/。w/v干燥剩余物的懸液。將產(chǎn)物最終在真空下在40。C千燥24小時(shí)以產(chǎn)生218g的淺棕色產(chǎn)物(HPLC測(cè)定的多酚9.3%w/w)。產(chǎn)物的NMR譜與實(shí)施例1中獲得的那些類似。實(shí)施例7-橄欖葉純化的乙醇提取物的磷脂酰膽堿復(fù)合物的制備將100g的橄欖葉純化的水醇提取物(HPLC測(cè)定的多酚41.6%w/w)溶解在2570ml乙醇中的115g的磷脂酰膽堿的溶液中。將得到的溶液回流1小時(shí)，然后在減少的壓力下濃縮至具有70。/。w/v干燥剩余物的懸液。將產(chǎn)物最終在真空下在40。C干燥24小時(shí)以產(chǎn)生196g的淺棕色產(chǎn)物(HPLC測(cè)定的多酚18.8%w/w)。產(chǎn)物的NMRi脊與實(shí)施例1中獲得的那些類似。實(shí)驗(yàn)部分進(jìn)行測(cè)試以比較本發(fā)明的磷脂復(fù)合物的生物利用率與未復(fù)合的橄欖果實(shí)或葉的乙醇提取物的生物利用率。在將未復(fù)合形式的以及與磷脂一起的復(fù)合形式的高度標(biāo)準(zhǔn)化的橄欖果實(shí)提取物施用給志愿者后，通過(guò)在24小時(shí)時(shí)間內(nèi)評(píng)價(jià)尿排出的總HT和其最具代表性的代謝物(即高香蘭醇(HVAlc))，來(lái)評(píng)估隨時(shí)間和劑量范圍的酚的生物利用率。此外，評(píng)估了處理對(duì)于尿異前列烷排出的影響，所述異前列烷是通過(guò)高不飽和脂肪酸花生四烯酸的非酶促氧化形成的全身性脂質(zhì)過(guò)氧化作用的可接受的標(biāo)記。將六名健康男性志愿者分成兩組，每組3人。第一組用本發(fā)明的復(fù)合物施用，從現(xiàn)在開始將其稱為OLEASELECTTMPhytosome。第二組用未復(fù)合形式的高度標(biāo)準(zhǔn)化的橄欖果實(shí)提取物施用，從現(xiàn)在開始將其稱為OLEASELECTTM。對(duì)所有受試者進(jìn)行無(wú)橄欖油的膳食3天("洗凈"期間)，然后分別給予OLEASELECTTMPhytosome⑧或OLEASELECTTM，第一次一個(gè)膠嚢，第二次兩個(gè)膠嚢，以及第三次四個(gè)膠嚢，每次施用間隔一周。處理前一天和處理后一天收集24小時(shí)的尿。測(cè)量尿體積并且將等分試樣儲(chǔ)存在-80。C。在處理前后評(píng)估HT和其代謝物高香蘭醇(HAVIc)的尿濃度。將樣品提取并且與葡糖醛酸糖苷酶一起溫育，并且用HPLC結(jié)合質(zhì)譜分析法來(lái)分析。8通過(guò)免疫測(cè)定確定Fr異前列烷的尿濃度。9將每個(gè)值相對(duì)于肌酸酐(MetraCreatinineAssayKit,奎都公司(Quidel))的濃度標(biāo)準(zhǔn)化，并且表示為pg/mg肌酸酐。就統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性而言，用對(duì)成對(duì)數(shù)據(jù)的雙尾"學(xué)生"t檢驗(yàn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。用OLEASELECTTMPhytosome⑧處理的組顯示了HT和HVAlc的百分比范圍在5.2和7.9之間。這一結(jié)果表明口服生物利用率的強(qiáng)增加。也觀察到異前列烷排出的劑量-相關(guān)性減少。用OLEASELECTTM單獨(dú)處理的組顯示出HT和HVAlc的百分比范圍在1和2.3之間，即更低的多的口服生物利用率。參考文獻(xiàn)1.L丄Somova，等人，/0/E幼wo/Viflf附84，299-305(2003).2.L.I.Somova，等人，/6>/SomA4A'cflwK"er/wa/^爿s^70，14-17(2003).3.F.Visioli,等人，J幼efY^c/efYm、117，25-32(1995).4.F.Visioli,C.Galli，to..55，1965-1971(1994).5.A,Bonanome,等人，JWm'仍c/c77tiwm6固's12:529-533(1986).6.P.Grignaffini，等人，丄awc^343，1296-1297.7.M.Salami,等人，尸/^尸附flc/^/./仏31275-279(1995).8.W.Panfen，等人，/i/oc/^附戶/^nw"co/51，687-691(1996).9.O.Benavente-Garcia，等人，/Af^/5(3)曙125-135(2002).10.VisioliF，等人，C7rc"/fl"》".2000;102:2169-2171.11.BrenesM，等人，/爿^r/c"FoodC7ie附.1999;47:3535-40.12.VisioliF，爿^^/^sc/^^s&,1995;117:25-32.13.FitoM,2000;35:633-8,14.Miro-C雄sE，C7/"CA亂2003;49:945-952.15.Miro-CasasE,v4wa/5/oi^亂2001;294:63-72.16.VisioliF,/7V"&.2003;133:2612-2615.權(quán)利要求1.橄欖果實(shí)或葉提取物的磷脂復(fù)合物。2.根據(jù)權(quán)利要求l的磷脂復(fù)合物，其中提取物是含水提取物。3.根據(jù)權(quán)利要求1的磷脂復(fù)合物，其中提取物是乙醇或水-乙醇提取物。4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的復(fù)合物，其中磷脂是豆磷脂。5.權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的復(fù)合物，其中磷脂對(duì)橄欖果實(shí)或葉提取物的比在10至1w/w的范圍內(nèi)。6.權(quán)利要求5的復(fù)合化合物，其中磷脂對(duì)橄欖果實(shí)或葉提取物的比是從5至1w/w。7.制備權(quán)利要求l-6中的復(fù)合化合物的方法，其中將橄欖果實(shí)或葉的提取物與磷脂在醇溶劑中反應(yīng)，然后將復(fù)合化合物通過(guò)濃縮和干燥來(lái)分離。8.權(quán)利要求7的方法，其中醇溶劑是乙醇。9.包含作為活性成分的權(quán)利要求1至6所述的復(fù)合物的藥物組合物，所述復(fù)合物與適當(dāng)?shù)乃幬镙d體混合。10.權(quán)利要求1至6的復(fù)合物用于制備藥物的用途，所述藥物具有化學(xué)預(yù)防、抗氧化和心血管疾病預(yù)防的作用。全文摘要本發(fā)明涉及具有改良的生物利用率的新的橄欖果實(shí)或葉提取物的磷脂復(fù)合物，或者具有改良的生物利用率的包含其的組合物。文檔編號(hào)A61K47/48GK101420967SQ200780013056公開日2009年4月29日申請(qǐng)日期2007年4月6日優(yōu)先權(quán)日2006年4月13日發(fā)明者A·焦里,F·弗蘭切斯基申請(qǐng)人:因德納有限公司