降低牛、羊精液中畸形精子比率和死精子比率的方法
【專利摘要】一種降低牛、羊精液中畸形精子比率和死精子比率的方法，用NaHCO3、Hepes、MgCl2、NaLactate、KCl、Glucose、NaCl、Na2HPO4、NaPyruvate和0.3%BSA配置Staining?Talp稀釋液，將StainingTalp稀釋液預(yù)熱至37℃后置于容器內(nèi)。將活力區(qū)間為40%-60%的新鮮精液注入到StainingTalp稀釋液底部，37℃溫浴，正常活精子向上游動(dòng)后處在稀釋液上層，吸取上層并3000rpm/min離心收集精子。本發(fā)明的有益效果是：通過(guò)上游法處理后的牛、羊精液，畸形精子和死精子比率顯著降低，可以提高X/Y精子分離效率、提高精子活力、提高受精受胎率。
【專利說(shuō)明】降低牛、羊精液中畸形精子比率和死精子比率的方法
[0001]【技術(shù)領(lǐng)域】
本發(fā)明屬于動(dòng)物繁殖【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種降低牛、羊精液中畸形精子比率和死精子比率的方法。
[0002]【背景技術(shù)】
哺乳動(dòng)物精液畸形率較高時(shí)和活力較低時(shí)會(huì)導(dǎo)致其受胎率低下，例如:我國(guó)制定了“牛冷凍精液國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)”，標(biāo)準(zhǔn)中明確規(guī)定新鮮精液精子活力> 65%，精子畸形率< 15% ;冷凍精液解凍后精子活力> 35%，精子畸形率< 18%。目前人類精子廣泛采用密度梯度離心法、過(guò)濾柱法等去除低活力精子，應(yīng)用于人工授精后取得一定效果，但存在以下問(wèn)題:1、試劑盒價(jià)格昂貴，成本相對(duì)較高；2、反復(fù)離心操作可能會(huì)給精子造成物理?yè)p傷，精液冷凍后質(zhì)量有所下降；3、試劑盒殘留物難以徹底去除，是否對(duì)受胎后續(xù)有影響尚需試驗(yàn)證實(shí)。為了降低畸形精子比率、提高精子活力，進(jìn)而提高其受胎率，研究開(kāi)發(fā)了降低精液畸形率和死精率的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種降低牛、羊精液中畸形精子比率和死精子比率的方法，是通過(guò)上游法，利用活精子具有較強(qiáng)游動(dòng)能力的特點(diǎn)，與死精子、活力低的精子、未成熟的精子、畸形精子、白細(xì)胞等物質(zhì)分離，降低牛、羊精液中畸形精子和死精子比率，從而提高精子活力，達(dá)到受精受胎的目的。
[0004]本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:一種降低牛、羊精液中畸形精子比率和死精子比率的方法，其特征在于:它包括如下步驟:` (一)、StainingTalp稀釋液的配置:
NaHCO3IOmmoI/L，
Hepes40mmol/L,
MgCl20.4mmol/L,
NaLactate25mmol/L,
KCl3mmol/L,
Glucose5mmol/L,
NaCl95mmol/L,
Na2HPO40.3mmol/L,
NaPyruvate2mmol/L,
0.3%BSA3g/L ；
以上成分依次溶解入超純水中，最終體積定容至IL ；
(二)、StainingTalp稀釋液的保存:
Staining Talp稀釋液保存在4°C，保存期限為兩周；
(三)、上游法處理新鮮精液:
(I)提前37°C預(yù)熱容器，再將4ml Staining Talp稀釋液預(yù)熱至37°C后，置于容器內(nèi)；(2)選取活力區(qū)間為40%-60%的新鮮精液，取Iml注入容器內(nèi)StainingTalp稀釋液的底部，37 °C溫浴30分鐘；
(3)吸出頂部4ml精液，將吸出的4ml精液3000rpm/min離心5分鐘，棄掉3ml上清液，保留底部Iml精液；
(四)、精液各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè):
(1)精子活力檢測(cè):
預(yù)先把載玻片和蓋玻片放在37°C加熱板上預(yù)熱10分鐘，用移液器離心管從步驟(三)
(3)的底部Iml精液中取15μ1樣品，滴在準(zhǔn)備好的載玻片上，壓片后置于顯微鏡下鏡檢，選擇壓片均勻的樣品區(qū)域觀察，一個(gè)壓片取5個(gè)視野，中間I個(gè)，四周各取I個(gè)，分別計(jì)數(shù)活精子數(shù)和死精子數(shù)，并計(jì)算活力；
精子活力=活精子數(shù)/活精子數(shù)與死精子數(shù)的和；
(2)畸形率檢測(cè):
Α、從步驟(三)(3)的底部Iml精液中取一滴精液滴于載玻片一端,用另一邊緣光滑的載玻片與有樣品的載玻片成35°夾角,將樣品均勻地涂抹于載玻片上，自然風(fēng)干約5 min,每樣品制作2個(gè)抹片；
B、在已風(fēng)干的抹片上滴上1.0 mL~2.0 mL0.05%福爾馬林，pH值為6.5-7.5，固定15min后用清水緩緩沖去福爾馬林，吹干或自然風(fēng)干；
C、將固定好后的抹片反扣在帶有平槽的有機(jī)玻璃面上，把姬姆薩染液滴于槽和抹片之間，讓其充滿平槽并使抹片接觸染液，染色1.5 h后用清水緩緩沖去染液，晾干待檢；
D、鏡檢:將步驟C中晾干待檢的抹片置于400倍~600倍顯微鏡下觀察，每個(gè)抹片觀察200個(gè)以上的精子，分左、右二個(gè)區(qū)，取2片的平均值，2片的變異系數(shù)不得大于20%，若超過(guò)應(yīng)重新制片；
畸形率=畸形精子數(shù)/總精子數(shù)；
(3)精子總數(shù):
從步驟(三)(3)的底部Iml精液中取精液50ul，用950ul的0.05%福爾馬林溶液將精液稀釋20倍，再進(jìn)行20倍稀釋，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，在顯微鏡調(diào)至自然光下，計(jì)數(shù)精子濃度。
[0005]本發(fā)明的有益效果是:通過(guò)上游法，利用活精子具有較強(qiáng)游動(dòng)能力的特點(diǎn)，與死精子、活力低的精子、未成熟的精子、畸形精子、白細(xì)胞等物質(zhì)分離，降低牛、羊精液中畸形精子和死精子比率，從而提高精子活力，達(dá)到受精受胎的目的。
[0006]【具體實(shí)施方式】:
下面結(jié)合實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明，這里所述實(shí)施例的方案，不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域的專業(yè)人員按照本發(fā)明的精神可以對(duì)其進(jìn)行改進(jìn)和變化，所述的這些改進(jìn)和變化都應(yīng)視為在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)，本發(fā)明的范圍和實(shí)質(zhì)由權(quán)利要求來(lái)限定。
[0007]實(shí)施例中:Hoechst33342熒光染料購(gòu)買于SIGMA公司，貨號(hào)為B2261，姬姆薩染液購(gòu)買于SIGMA公司，貨號(hào)為GS500-500ML, Allura Red AC購(gòu)買于SIGMA公司，貨號(hào)為458848-100G,其它沒(méi)有特別指出的試劑均為市售產(chǎn)品。
[0008]本發(fā)明中出現(xiàn)的英文縮寫字母的解釋如下:
NaHCO3-碳酸氫鈉，Hepes- 4_輕乙基哌嗪乙磺酸；MgCl2-氯化鎂，NaLactate-乳酸鈉，KCl-氯化鉀，Glucose-葡萄糖，NaCl-氯化鈉，Na2HPO4-磷酸氫二鈉，NaPyruvate-丙酮酸鈉，egg-yolk稀釋液-卵黃磷酸酸鹽稀釋液，BSA-牛血清白蛋白。
[0009]其中:egg-yolk稀釋液的配置:
NaHCO3IOmmoI/L，
Hepes40mmol/L,
MgCl20.4mmol/L,
NaLactate25mmol/L,
KCl3mmol/L,
Glucose5mmol/L,
NaCl95mmol/L,
Na2HPO40.3mmol/L,
NaPyruvate2mmol/L,
0、3%BSA3g/L,
Allura Red AC9.14g/L,
Egg yolk40ml/L
以上成分依次溶解入超純水中，最終體積定容至IL。
[0010]實(shí)施例1:一種降低牛精液中畸形精子比率和死精子比率的方法，它包括如下步驟:
1、StainingTalp稀釋液的配置:
NaHCO3IOmmoI/L，
Hepes40mmol/L,
MgCl20.4mmol/L,
NaLactate25mmol/L,
KCl3mmol/L,
Glucose5mmol/L,
NaCl95mmol/L,
Na2HPO40.3mmol/L,
NaPyruvate2mmol/L,
0.3%BSA3g/L ；
以上成分依次溶解入超純水中，最終體積定容至IL ；
2、StainingTalp稀釋液的保存:
Staining Talp稀釋液保存在4°C，保存期限為兩周；
3、上游法處理牛新鮮精液:
實(shí)驗(yàn)精液來(lái)源于內(nèi)蒙古賽科星繁育生物技術(shù)股份有限公司種公牛，代號(hào)為15507212，采用假陰道法進(jìn)行采精；
(1)提前37°C預(yù)熱容器，再將4ml Staining Talp稀釋液預(yù)熱至37°C后，置于容器內(nèi)；
(2)選取活力區(qū)間為40%-60%，即死精率60%-40%的新鮮牛精液，取Iml注入容器內(nèi)Staining Talp稀釋液的底部，37°C溫浴30分鐘；
(3)吸出頂部4ml精液，即上游法處理后精液，將吸出的4ml精液3000rpm/min離心5分鐘，棄掉上清液，保留底部Iml ；
4、牛精子活力檢測(cè):
(1)取15μ1牛新鮮精液滴在準(zhǔn)備好的載玻片上，壓片后置于顯微鏡下鏡檢，取5個(gè)視
野，中間I個(gè)，四周各取I個(gè)，觀察5個(gè)視野后，各視野精子數(shù):
【權(quán)利要求】
1.一種降低牛、羊精液中畸形精子比率和死精子比率的方法，其特征在于:它包括如下步驟: (一)、Staining Talp稀釋液的配置: NaHCO3IOmmoI/L，
Hepes40mmol/L, MgCl20.4mmol/L, NaLactate25mmol/L, KCl3mmol/L, Glucose5mmol/L, NaCl95mmol/L, Na2HPO40.3mmol/L, NaPyruvate2mmol/L, .0.3%BSA3g/L ； 以上成分依次溶解入超純水中，最終體積定容至IL ； (二)、StainingTalp稀釋液的保存:
Staining Talp稀釋液保存在4°C，保存期限為兩周； (三)、上游法處理新鮮精液: (1)提前37°C預(yù)熱容器，再將4mlStaining Talp稀釋液預(yù)熱至37°C后，置于容器內(nèi)； (2)選取活力區(qū)間為40%-60%的新鮮精液，取Iml注入容器內(nèi)Staining Talp稀釋液的底部，37 °C溫浴30分鐘； (3)吸出頂部4ml精液，將吸出的4ml精液3000rpm/min離心5分鐘，棄掉3ml上清液，保留底部Iml精液； (四)、精液各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè): (1)精子活力檢測(cè): 預(yù)先把載玻片和蓋玻片放在37°C加熱板上預(yù)熱10分鐘，用移液器離心管從步驟(三)(3)的底部Iml精液中取15μ1樣品，滴在準(zhǔn)備好的載玻片上，壓片后置于顯微鏡下鏡檢，選擇壓片均勻的樣品區(qū)域觀察，一個(gè)壓片取5個(gè)視野，中間I個(gè)，四周各取I個(gè)，分別計(jì)數(shù)活精子數(shù)和死精子數(shù)，并計(jì)算活力； 精子活力=活精子數(shù)/活精子數(shù)與死精子數(shù)的和； (2)畸形率檢測(cè): Α、從步驟(三)(3)的底部Iml精液中取一滴精液滴于載玻片一端,用另一邊緣光滑的載玻片與有樣品的載玻片成35°夾角,將樣品均勻地涂抹于載玻片上，自然風(fēng)干約5 min,每樣品制作2個(gè)抹片； B、在已風(fēng)干的抹片上滴上1.0 mL~2.0 mL0.05%福爾馬林，pH值為6.5-7.5，固定15min后用清水緩緩沖去福爾馬林，吹干或自然風(fēng)干； C、將固定好后的抹片反扣在帶有平槽的有機(jī)玻璃面上，把姬姆薩染液滴于槽和抹片之間，讓其充滿平槽并使抹片接觸染液，染色1.5 h后用清水緩緩沖去染液，晾干待檢； D、鏡檢:將步驟C中晾干待檢的抹片置于400倍~600倍顯微鏡下觀察，每個(gè)抹片觀察.200個(gè)以上的精子，分左、右二個(gè)區(qū)，取2片的平均值，2片的變異系數(shù)不得大于20%，若超過(guò)應(yīng)重新制片； 畸形率=畸形精子數(shù)/總精子數(shù)； (3)精子總數(shù):從步驟(三)(3)的底部Iml精液中取精液50ul，用950ul的0.05%福爾馬林溶液將精液稀釋20 倍，再進(jìn)行20倍稀釋，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，在顯微鏡調(diào)至自然光下，計(jì)數(shù)精子濃度。
【文檔編號(hào)】C12N5/076GK103710303SQ201310737256
【公開(kāi)日】2014年4月9日 申請(qǐng)日期:2013年12月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月30日
【發(fā)明者】丁瑞, 周文忠, 韓紅梅, 李喜和, 胡樹(shù)香 申請(qǐng)人:內(nèi)蒙古賽科星繁育生物技術(shù)股份有限公司