豬細小病毒液相芯片檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明提供屬疫病檢驗檢疫領(lǐng)域，具體涉及一種豬細小病毒液相芯片檢測試劑 盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬細小病毒病是豬的主要繁殖障礙性疾病之一，由豬細小病毒（porcine parvovirus，PPV)感染所引起。該病的主要特征是受感染的母豬，尤其是初產(chǎn)母豬、血清學(xué) 陰性經(jīng)產(chǎn)母豬發(fā)生流產(chǎn)、不暈、產(chǎn)死胎、畸形胎、木乃伊胎以及弱仔等。公豬在PPV的傳播中 也起著重要作用，已有很多報道從自然感染的公豬精液中分離出PPV，精液也可能在體外受 到污染，例如被含有病毒的糞便污染。Lucas(1974)等將病毒通過包皮注射給公豬，5d后在 該受試公豬的睪丸中分離到了病毒。Thacher等（1985)應(yīng)用HI對公豬的PPV血清抗體檢 測表明，隨著公豬年齡的增加，其血清學(xué)陽性率顯著增加。該病廣泛分布、全世界流行，在很 多感染豬場呈地方性流行，造成了長期、重大的經(jīng)濟損失，嚴重阻礙了世界養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā) 展。
[0003] 豬細小病毒感染可依據(jù)臨床癥狀和流行病學(xué)做出初步診斷。一般認為，如果僅妊 娠母豬發(fā)生流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎、胎兒發(fā)育異常，同時有證據(jù)表明是傳染性疾病時，則 應(yīng)考慮到PPV感染的可能，但進一步確診必須進行實驗室診斷。因此，開發(fā)一種特異性強、 靈敏度高、簡單易行、適合批量操作的新型檢測方法將具有重要的現(xiàn)實意義。
[0004] 液相芯片，也稱微球體懸浮芯片（SuspensionArray，liquidchip)，是基于xMAP (flexibleMulti-AnalyteProfiling)技術(shù)的新型生物芯片技術(shù)平臺。該技術(shù)是20世紀 90年代中期發(fā)展起來的，被喻為后基因組時代的芯片技術(shù)，是集流式技術(shù)、熒光微球、激光、 數(shù)字信號處理和傳統(tǒng)化學(xué)技術(shù)為一體的新型生物分子高通量檢測技術(shù)，它是在不同熒光編 碼的微球上進行抗原-抗體、酶-底物、配體-受體的結(jié)合反應(yīng)，通過紅、綠兩束激光分別檢 測微球編碼和報告熒光從而達到定性和定量檢測之目的。該技術(shù)的優(yōu)勢在于檢測通量大、 速度快、靈敏度高、操作靈活、樣本用量少、檢測范圍廣、特異性強、準確性高、重復(fù)性好、費 用低。
[0005] 鑒于豬細小病毒的危害和現(xiàn)存檢測該病毒方法尚存的一些弊端，本發(fā)明利用免疫 學(xué)技術(shù)和液相芯片技術(shù)相結(jié)合，研制用于檢測豬細小病毒的液相芯片檢測試劑盒。簡言之， 采用單抗制備技術(shù)制備了豬細小病毒單克隆抗體，并與羧基化21號微球偶聯(lián)，獲得捕獲 單抗-微球；采用多抗制備技術(shù)制備了兔源豬細小病毒多克隆抗體，經(jīng)生物素化獲得了檢 測多抗；采用重組DNA技術(shù)制備了豬細小病毒結(jié)構(gòu)蛋白截短體VP2312與非結(jié)構(gòu)蛋白截短體 NS1217的混合三聯(lián)重組蛋白，即VP2 312-NS1217-VP2312，作為檢測標準品。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種豬細小病毒液相芯片檢測試劑盒。
[0007] -種重組蛋白基因，它的堿基序列如序列表SEQIDN0. 7所示。
[0008] 一種重組蛋白，它是如序列表SEQIDNO. 7所不的基因表達的蛋白。
[0009] 一種質(zhì)粒pET28a-VP2312-NSl217-VP2312，它是用下述的方法制得： 1) 提取豬細小病毒總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此為模板； 2) 用引物： 上游：5'GGATCCATGAGTGAAAATGTGGAACAA3' 下游：5'GAATTCTTGTGTGTGTGCATCGTCTTGT3' 擴增基因VP2312; 3) 用引物： 上游：5'GAATTCATGGCAGCGGGAAACA3' 下游：5'AAGCTTCTGTTGCCTGGTCCCAT3' 擴增基因NS1217; 4) 上游：5'AAGCTTATGAGTGAAAATGTGGAAC3' 下游：5'CTCGAGTTGTGTGTGTGCATCGTCTTGT3' 擴增基因VP2312; 5) 步驟 2)、3)、4)PCR產(chǎn)物，依次用BamHI和EcoRI、EcoRI和HindIII、HindIII和Xhol 酶切，連接到同一pET28a載體上。
[0010] 一種重組蛋白在制備豬細小病毒檢測試劑盒中的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明提供了豬細小病毒液相芯片檢測試劑盒，它是以重組蛋白VP2312-NS1217-VP2312做為抗原標準品，工作濃度為2. 5yg/mL，對豬藍耳病病毒、豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病 毒、豬瘟病毒、豬凝血性脊髓灰質(zhì)炎病毒、豬腦心肌炎病毒、豬流行性乙型腦炎病毒無交叉 反應(yīng)，對豬細小病病毒最低檢出限為0. 1TCID5(i。
[0012] 附圖表說明 附圖1融合細胞染色體鑒定結(jié)果； 附圖2細胞融合； 附圖3豬細小病毒單克隆抗體亞型鑒定結(jié)果； 附圖4純化多克隆抗體的檢測結(jié)果； 附圖5單抗偶聯(lián)微球的最佳工作濃度； 附圖6試劑盒靈敏度檢測結(jié)果； 附圖7試劑盒特異性檢測結(jié)果； 附圖8試劑盒穩(wěn)定性檢測結(jié)果。
【具體實施方式】
[0013] 實施例1豬細小病毒單克隆抗體的制備 (1)PPV的培養(yǎng)與免疫原的制備 PK-15細胞常規(guī)復(fù)蘇培養(yǎng)，待細胞長至培養(yǎng)瓶底部的80%時采用吸附接毒法按10%量接 種病毒，37°C吸附lh，傾去剩余病毒液，加入維持液，于37°C、5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，在倒 置顯微鏡下逐日觀察細胞病變（CPE)，出現(xiàn)約80%的拉網(wǎng)，空泡、聚縮等細胞病變后即可收 獲病毒。收毒時將細胞培養(yǎng)瓶快速置_70°C和37°C反復(fù)凍融三次，于4°C，5000r/min離心 30min，收集上清液。
[0014] 上清中緩慢加入PEG至上清的體積的10%，4°C攪拌過夜。然后4°C10000r/min，離 心40min，沉淀以少量的TE緩沖液溶解。用TE緩沖液配成30%、40%、50%，60%四種濃度的蔗 糖溶液，加入離心管中，制備蔗糖不連續(xù)梯度，將經(jīng)PGE濃縮沉淀溶解在TE緩沖液的病毒液 加入離心管的最上層，大約3mL/管，4°C，1000r/min離心4小時，分段收集樣品，當30%-40% 蔗糖濃度時出現(xiàn)的明顯白色帶即為目的病毒， 取純化病毒經(jīng)超聲波粉碎儀裂解，稀釋20倍后，用U2010紫外分光光度計于260nm與 280nm下測定吸光度，計算其蛋白濃度，用PBS稀釋至15〇Mg/ml與等量的弗氏完全佐劑或弗 氏不完全佐劑混合制成乳劑，置4°C放置3d，若呈乳白色不分層，即可作為免疫原。
[0015] (2)小鼠免疫及血清效價檢測 選擇4-6周齡雌性Balb/c小鼠5只，用上述制備的弗氏完全佐劑疫苗進行首免，二免、 三免均采用弗氏不完全佐劑制備的免疫原進行免疫注射，最后一次免疫于融合前3天進行 加強，具體免疫程序見表1。
【主權(quán)項】
1. 一種重組蛋白基因，它的堿基序列如序列表SEQ ID NO. 7所示。
2.-種重組蛋白，它是如序列表SEQ ID NO. 7所示的基因表達的蛋白。
3. -種質(zhì)粒pET28a-VP2 312-NS1217- VP2312，它是用下述的方法制得； 1) 提取豬細小病毒總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此為模板； 2) 用引物： 上游：5' GGATCCATGAGTGAAAATGTGGAACAA 3' 下游：5' GAATTCTTGTGTGTGTGCATCGTCTTGT 3' 擴增基因VP2312; 3)用引物： 上游：5' GAATTCATGGCAGCGGGAAACA 3' 下游：5' AAGCTTCTGTTGCCTGGTCCCAT 3' 擴增基因NSl217; 4) 用引物： 上游：5' AAGCTTATGAGTGAAAATGTGGAAC 3' 下游：5' CTCGAGTTGTGTGTGTGCATCGTCTTGT 3' 擴增基因VP2312; 5)步驟2)、3)、4)PCR產(chǎn)物，依次用BamHI和EcoRI、EcoRI和HindIII、HindIII和XhoI 酶切，連接到同一 pET28a載體上。
4. 一種重組蛋白在制備豬細小病毒檢測試劑盒中的應(yīng)用。
5.豬細小病毒液相芯片檢測試劑盒，它的抗原標準品為序列表SEQ ID NO. 7所示的基 因表達的蛋白。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的豬細小病毒液相芯片檢測試劑盒，其特征在于：所述的抗原 標準品的工作濃度為2. 5 y g/mL。
【專利摘要】本發(fā)明公開了豬細小病毒液相芯片檢測試劑盒，它是以重組蛋白VP2312-NS1217-VP2312做為抗原標準品，工作濃度為2.5μg/mL，對豬藍耳病病毒、豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒、豬瘟病毒、豬凝血性脊髓灰質(zhì)炎病毒、豬腦心肌炎病毒、豬流行性乙型腦炎病毒無交叉反應(yīng)，對豬細小病病毒最低檢出限為0.1TCID50。
【IPC分類】C07K14-015, C12N15-35, G01N33-569, C12N15-66, C12N15-63, G01N33-68
【公開號】CN104745604
【申請?zhí)枴緾N201510140003
【發(fā)明人】孟日增, 劉金華, 蘆春梅, 宋嶼竹, 吳連鵬, 劉洋, 石建平, 李玲
【申請人】中華人民共和國吉林出入境檢驗檢疫局
【公開日】2015年7月1日
【申請日】2015年3月27日