鹿結(jié)核分支桿菌多表位抗原間接elisa檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及結(jié)核分枝桿菌融合基因片段萬 你和融合蛋白CFP10-ESAT6-PPE68及鹿結(jié)核分支桿菌多表位抗原間接ELISA檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 結(jié)核病是人畜健康的重要威脅，由于各類診斷抗原的低敏感性和特異性及卡介苗 效果的不穩(wěn)定性，對于結(jié)核的診斷和免疫治療仍是醫(yī)學(xué)界及獸醫(yī)界的一大難題。因此，新型 診斷抗原及疫苗的研宄對預(yù)防和控制結(jié)核病具有重要意義。近年來，人們對結(jié)核桿菌培養(yǎng) 濾液進行了深入的研宄，分離出了多種分泌蛋白，包括ESAT6、CFP10、MPB70、MPB80、MPB83、 MPB64、Ag85等。其中對于ESAT6，CFP10等的研宄較為廣泛，它們是免疫記憶效應(yīng)T細(xì)胞的 主要靶抗原，也是刺激IFNC應(yīng)答的主要抗原，尤其在感染早期作用最顯著。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是目前鹿結(jié)核分支桿菌病的診斷抗原敏感性低和特異性不 強及卡介苗變態(tài)反應(yīng)診斷效果的不穩(wěn)定的問題，而提供一種結(jié)核分枝桿菌重組蛋白 CFP10-ESAT6-PPE68。
[0004] 結(jié)核分枝桿菌重組基因片段其堿基序如序列表SEQIDN0. 3 所示； 結(jié)核分枝桿菌重組蛋白CFP10-ESAT6-PPE68,它是堿基序如序列表SEQIDNO. 3所示的 基因表達的蛋白。
[0005] 本發(fā)明又一個目的是鹿結(jié)核分支桿菌多表位抗原間接ELISA檢測試劑盒。
[0006] 鹿結(jié)核分支桿菌多表位抗原間接ELISA檢測試劑盒，它的檢測抗原為堿基序如序 列表SEQIDN0. 3所示的基因表達的蛋白。
[0007] 本提供了結(jié)核分枝桿菌重組蛋白CFP10-ESAT6-PPE68,二抗作2500倍稀釋，重組 融合蛋白可與鹿結(jié)核病陽性血清作用，而與鹿副結(jié)核病、鹿病毒性腹瀉、鹿鹿傳染性胸膜肺 炎和鹿布魯氏菌病陽性血清無交叉反應(yīng)，以其為抗原制備的鹿結(jié)核分支桿菌多表位抗原間 接ELISA檢測試劑盒，檢測117份PH)變態(tài)反應(yīng)陽性鹿血清，陽性符合率為68. 7%。陰性 符合率為100%。對相同樣品用進口的R&DDeerTBIgGELISA試劑盒檢測，陽性符合率 為71. 6%。陰性符合率為100%。鹿結(jié)核分支桿菌多表位抗原間接ELISA檢測試劑盒與R&D DeerTBIgGELISA的符合率為 98. 0%〇
【附圖說明】
[0008]圖 1 為ESAT6、CFP10基因的PCR擴增；其中：M:100bpDNAMarker;1、4、5、6 :不同 條件下ESAT-6基因H37RV菌株DNA擴增結(jié)果；2 :PCR空白對照；3 :陰性對照；8 :CFP10基因 PCR擴增空白對照；9 :陰性對照；10、11、12、13:不同條件下0??10基因11371^菌株0嫩擴增 結(jié)果。
[0009] 圖2為pMD18T-ESAT6、pMD18T-CFP10重組克隆載體的酶切鑒定；其中：M:DL2000 DNAMarker;1、2、3 :pMD18T-ESAT-6 酶切鑒定結(jié)果；4、6 :pMD18T-CFP10 酶切鑒定結(jié)果；5、 7 :pMD18T-CFP10質(zhì)粒電泳結(jié)果。
[0010] 圖3為融合基因PCR及質(zhì)粒酶切鑒定；其中M:DL2000DNAMarker;1 : ESAT6-linker片段PCR擴增結(jié)果；2 :linker-PPE68 片段PCR擴增結(jié)果；3 :ESAT6-PPE68 片 段PCR擴增結(jié)果；4 :CFP10-linker片段PCR擴增結(jié)果；5 :linker-ESAT6-PPE68 片段PCR擴 增結(jié)果；6 :CFP10-ESAT6-PPE68片段擴增結(jié)果；7 :空載體酶切結(jié)果；8 :PGEX-ESAT6-PPE68 酶切鑒定結(jié)果；9 :PGEX-CFP10-EST6-PPE68酶切鑒定結(jié)果。
[0011] 圖4為重組蛋白表達產(chǎn)物SDS-PAGE檢測；其中：M:蛋白Marker;1、2 :ESAT-6未誘 導(dǎo)菌株SDS-PAGE結(jié)果；3、4 :ESAT-6蛋白誘導(dǎo)表達結(jié)果；5 :CFP10蛋白誘導(dǎo)表達SDS-PAGE 結(jié)果；6 :CFP10 未誘導(dǎo)菌株SDS-PAGE;7、8、9 :CFP10-EST6-PPE68 蛋白誘導(dǎo)表達SDS-PAGE結(jié) 果。
[0012] 圖5為重組蛋白Westernblot鑒定結(jié)果；其中：M:蛋白Marker;1 :鹿副結(jié)核病陽 性血清；2 :鹿病毒性腹瀉陽性血清；3 :鹿結(jié)核陽性血清；4 :鹿傳染性胸膜肺炎陽性血清； 5 :鹿布魯氏菌病陽性血清。
【具體實施方式】
[0013] 實施例1ESAT6、CFP10基因的克隆 參照GeneBank中牛型結(jié)核分枝桿菌M.tuberculosis的ESAT6 (288bp)及CFP10 (300bp)基因序列，設(shè)計特異性引物，上、下游游引物分別含BamHI、EcoRI酶切位點，引物均 由上海生工合成。引物序列如下： ESAT6 上游引物：5 ' -ACGGGATCCATGACAGAGCAGCAGTG-3 '（BamHI) 下游引物：5 ' -GGCGAATTCTGCGAACATCCCAGTG-3 '（EcoRI) CFP10 上游引物：5 ' -GGCGGATCCATGGCAGAGATGAAG-3，（BamHI) 下游引物：5' -ACTGGAATTCCCGTTTCTTTTCGTA-3'(EcoRI) 采用常規(guī)PCR技術(shù)，應(yīng)用上述兩個基因的引物，以牛結(jié)核桿菌基因組DNA為模板，牛型 結(jié)核分枝桿菌（M.tuberculosis)ValleeIII株DNA，由哈爾濱獸醫(yī)研宄所研宄院劉思國研 宄員惠贈。分別擴增兩條目的基因，PCR反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，分別 獲得了與目的片段大小相符的ESAT6和CFP10基因，見附圖1，其堿基序列分別為SEQID NO. 1、2〇
[0014]PCR回收產(chǎn)物與PMD18-T連接后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109,經(jīng)氨芐青霉培養(yǎng)基 篩選后，挑取陽性菌落，抽提質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定，以1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，分別得到與目的 基因（288、300bp)和載體(約2692bp)相同大小的片段，見附圖2。
[0015] 實施例2CFP10-ESAT6-PPE68基因片段PCR擴增 根據(jù)各目標(biāo)基因的序列，設(shè)計上下游重疊引物，并由上海生工合成，引物序列如下：CFP10下游重疊引物P6 : 5 ' -CGATCCACCACCTCCGCTGCCTCCTCCACCCGAACCTCCTCCGCCGAAGCCCATTTG-3 '，ESAT6-PPE68 上游重疊引物P7 :5'-GGCGGAGGAGGTTCGGGTGGAGGAGGCAGCGGAGGTGGTGGA TCGATGACAGAGCAG-3'， 下游引物P8 :5' -CCCAAGCTT-TCACCAGTCGTCCTCTTC-3'。
[0016] 在P6的5'端和P7的5'端分別加入互補的linker[ (Gly4Ser) 3]，linker的序 列如下：CGATCCACCACCTCCGCTGCCTCCTCCACCCGAACCTCCTCCGCC 采用常規(guī)重疊延伸PCR剪接技術(shù)（GeneSOEing)獲得融合基因CFP10-ESAT6-PPE68 (1695bp)，其堿基序列如SEQIDNO. 3;擴增的目的片段與表達載體pGEX連接后，轉(zhuǎn)化BL21 大腸桿菌感受態(tài)，經(jīng)氨芐青霉素篩選陽性菌后，抽提質(zhì)粒，進行酶切鑒定。重疊延伸PCR剪 接技術(shù)過程中各目的基因組合的PCR擴增和酶切鑒定結(jié)果見附圖3。
[0017] 實施例3融合基因表達產(chǎn)物及其活性檢測 將ESAT6、CFP10分別與表達載體pGEX連接，構(gòu)建重組表達載體pGEX-ESAT6和pGEX-CFPIO。將pGEX-ESAT6、pGEX-CFPIO、CFP10-ESAT6-PPE68 三種重組表達載體分別轉(zhuǎn) 化大腸桿菌感受態(tài)BL21，篩選陽性菌后，經(jīng)lmmol/LIPTG常規(guī)誘導(dǎo)表達，破碎菌體后取上 清，進行常規(guī)SDS-PAGE電泳，發(fā)現(xiàn)有重組蛋白表達，相對分子質(zhì)量分別為32KD、36000KD和 58KD，與預(yù)測大小相符，見附圖4。凝膠掃描測定ESAT-6蛋白及CFP10蛋白的表達量分別占 全菌的16. 5%和20. 6%。
[0018] 表達產(chǎn)物進行常規(guī)Westernblot分析，封閉并洗滌后將NC膜分成7條，其中一條 與150倍稀釋的鹿結(jié)核病陽性血清孵育，另6條分別與150倍稀釋的鹿副結(jié)核病、鹿病毒 性腹瀉、鹿傳染性胸膜肺炎胸膜肺炎和鹿布魯氏菌病陽性血清孵育。二抗作2500倍稀釋， 顯色后結(jié)果表明，重組融合蛋白可與鹿結(jié)核病陽性血清作用，而與鹿副結(jié)核病、鹿病毒性腹 瀉、鹿鹿傳染性胸膜肺炎和鹿布魯氏菌病陽性血清無交叉反應(yīng)，見附圖5。
[0019] 實施例4融合基因表達產(chǎn)物間接ELISA鹿結(jié)核病 1、間接ELISA最佳工作條件的確定 方差分析的結(jié)果顯示，試驗中各因素的3個水平對陽性血清0D490nm值和陽性血清 與陰性血清0D490nm值的比值（P/N值）影響均不顯著（a=〇. 05)。同時，考慮陽性血清的 0D490nm值應(yīng)該接近1. 0。因此，抗原、一抗和二抗的工作濃度分別選擇0. 25yg/mL、l:200 和1:5 000。方差分析確定封閉時間、一抗作用時間和二抗作用時間均為1h，顯色時間為 10min〇
[0020] 2、間接ELISA檢測結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn) 檢測得到50份陰性血清的0D490nm值，計算其平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。確定0D490nm值平 均+3XSD為0? 5, 0D490nm值平均+2XSD為0? 4。根據(jù)樣品0D490nm值（S)、陽性血清對 照0D490nm值（P)和陰性血清對照0D490nm值（N)，按照以下公式計算樣品血清的效價（S/ P) :S/P= (S-N) / (P-N)。當(dāng)被檢樣本S/P彡0. 5,應(yīng)判為鹿結(jié)核病抗體反應(yīng)陽性，S/P〈0. 4 為反應(yīng)陰性，0. 5>S/P多0. 4為可疑。
[0021] 3、CT-ELISA檢測方法的特異性和敏感性分析 CT-ELISA檢測結(jié)果表明，50份健康鹿血清中只有4份血清的S/P值大于0. 5,達到陽 性。其余血清的S/P值小于0. 4,為陰性。即CT-ELISA檢測方法的特異性為96. 0%(96/100)。 67份感染結(jié)核病的鹿血清中，有59份血清的S/P值大于0. 5,達到陽性。另26份血清的S/ P值小于〇. 4,為陰性。即本方法的敏感性為88. 1% (59/67)。
[0022] 2. 9CT-ELISA檢測方法與PH)及進口ELISA試劑盒的比對試驗 117份PPD變態(tài)反應(yīng)陽性鹿血清，應(yīng)用CT-ELISA方法進行血清抗體檢測，結(jié)果有46份 為結(jié)核抗體陽性，21份為結(jié)核抗體陰性，陽性符合率為68. 7% (46/67)。50份PH)皮試陰 性鹿血清ELISA檢測則全部為陰性，陰性符合率為100% (50/50)。所以，CT-ELISA方法與 PH)皮試的符合率為82. 1% (96/117)。對相同樣品用R&DDeerTBIgGELISA試劑盒檢 測后，67份PH)變態(tài)反應(yīng)陽性鹿血清中結(jié)果有48份為結(jié)核抗體陽性，陽性符合率為71. 6% (48/67)。50份PH)皮試陰性鹿血清ELISA檢測則全部為陰性，陰性符合率為100%(50/50)。 所以，R&DDeerTBIgGELISA方法與PPD皮試的符合率為 83. 8% (98/117)，CT-ELISA與 R&DDeerTBIgGELISA的符合率為98. 0%，比較結(jié)果見表1所示
【主權(quán)項】
1. 結(jié)核分枝桿菌重組基因片段CF/價?其堿基序如序列表SEQ ID NO. 3 所示。
2. 結(jié)核分枝桿菌重組蛋白CFP10-ESAT6-PPE68,它是堿基序如序列表SEQ ID NO. 3所 不的基因表達的蛋白。
3. 鹿結(jié)核分支桿菌多表位抗原間接ELISA檢測試劑盒，它的檢測抗原為堿基序如序列 表SEQ ID NO. 3所示的基因表達的蛋白。
【專利摘要】本發(fā)明公開了結(jié)核分枝桿菌重組蛋白CFP10-ESAT6-PPE68，二抗作2500倍稀釋，重組融合蛋白可與鹿結(jié)核病陽性血清作用，而與鹿副結(jié)核病、鹿病毒性腹瀉、鹿鹿傳染性胸膜肺炎和鹿布魯氏菌病陽性血清無交叉反應(yīng)，以其為抗原制備的鹿結(jié)核分支桿菌多表位抗原間接ELISA檢測試劑盒，檢測117份PPD變態(tài)反應(yīng)陽性鹿血清，陽性符合率為68.7%。陰性符合率為100%。對相同樣品用進口的R&D Deer TB IgG ELISA試劑盒檢測，陽性符合率為71.6%。陰性符合率為100%。鹿結(jié)核分支桿菌多表位抗原間接ELISA檢測試劑盒與R&D Deer TB IgG ELISA的符合率為98.0%。
【IPC分類】C12R1-32, C12N15-31, C07K14-35, G01N33-68, G01N33-569
【公開號】CN104745601
【申請?zhí)枴緾N201510108396
【發(fā)明人】宋戰(zhàn)昀, 劉金華, 王振國, 孟日增, 魏春艷, 劉陽, 劉韜
【申請人】吉林出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心
【公開日】2015年7月1日
【申請日】2015年3月12日