專(zhuān)利名稱(chēng)：重組恥垢分支桿菌其制備及在治療膀胱腫瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)制品及其制備方法及在制備藥物上的用途，具體涉及重組恥垢分枝桿菌疫苗、其制備方法、及在制備用于治療淺表型膀胱腫瘤、原位癌、無(wú)法手術(shù)治療的晚期腫瘤及膀胱腫瘤術(shù)后防治復(fù)發(fā)等藥物中的應(yīng)用。
(二)、技術(shù)背景眾所周知膀胱腫瘤是泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的腫瘤，其主要特點(diǎn)是發(fā)病率、復(fù)發(fā)率高、惡性程度低。據(jù)統(tǒng)計(jì)目前的發(fā)病率可高達(dá)30/10萬(wàn)，初次發(fā)病時(shí)70-80％的膀胱腫瘤為淺表乳頭狀瘤，但單純手術(shù)切除復(fù)發(fā)率達(dá)50-92％。每次復(fù)發(fā)其病理分級(jí)增高，最終發(fā)展為浸潤(rùn)性癌轉(zhuǎn)移而致死。目前，用于防治膀胱腫瘤的卡介苗的有如下缺點(diǎn)1.臨床上應(yīng)用卡介苗給藥劑量大(65-130mg/次)2.用藥次數(shù)多3.副作用多50％以上的病人伴有尿路刺激癥狀、血尿和發(fā)燒等副作用，少數(shù)病人還可發(fā)生尿道結(jié)核、膀胱結(jié)核、甚至全身粟粒性結(jié)核，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致病人死亡4.生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，制備困難，生產(chǎn)成本高?？ń槊缟L(zhǎng)周期為一個(gè)月。IL-2也具有防治膀胱腫瘤的作用，但費(fèi)用高。
恥垢分枝桿菌(M.smegmatis mc2155)是一種已知的快生長(zhǎng)型分枝桿菌，它是從土壤中分離出來(lái)的非致病性分枝桿菌，在顯微鏡下通過(guò)抗酸染色可以觀察到紅色桿狀或短棒狀細(xì)菌。目前未見(jiàn)有恥垢分枝桿菌在藥學(xué)上應(yīng)用的文獻(xiàn)報(bào)道及應(yīng)用，也未見(jiàn)有恥垢分枝桿菌重組基因疫苗及應(yīng)用的文獻(xiàn)報(bào)道。
(三)、發(fā)明的內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之一就是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的以上不足而設(shè)計(jì)一種重組膀胱腫瘤基因疫苗。該疫苗利用來(lái)源于土壤的非致病性恥垢分支桿菌所具有的免疫原性強(qiáng)、無(wú)毒副作用、無(wú)致病性、繁殖周期短、生產(chǎn)成本低的特點(diǎn)，采用分子生物學(xué)技術(shù)，構(gòu)建了分枝桿菌-大腸桿菌穿梭表達(dá)質(zhì)粒，將IL-2基因?qū)氲椒种U菌中，研制了一種安全有效、無(wú)毒副作用、生產(chǎn)成本低廉的新型膀胱腫瘤基因疫苗。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之二是提供一種制備所述重組恥垢分支桿菌。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之三是提供重組恥垢分支桿菌在藥學(xué)上的應(yīng)用。
本發(fā)明解決所述技術(shù)問(wèn)題之一是采用這樣的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的即一種重組恥垢分支桿菌，其特征是a.由恥垢分枝桿菌和由分枝桿菌表達(dá)質(zhì)粒，人結(jié)核桿菌熱休克蛋白70啟動(dòng)子cDNA，堪薩斯分枝桿菌α抗原信號(hào)肽cDNA及人白細(xì)胞介素-2cDNA組成的分枝桿菌穿梭表達(dá)載體構(gòu)成；b.經(jīng)基因工程重組后的恥垢分支桿菌，在含有卡那霉素抗性的Lemco broth培養(yǎng)基中可以穩(wěn)定生長(zhǎng)傳代，即為本重組菌；表現(xiàn)為黃白色菌落，通過(guò)蛋白印跡分析法和ELLSA免疫分析法檢測(cè)到其中的IL-2蛋白表達(dá)。
本發(fā)明解決所述技術(shù)問(wèn)題之二是通過(guò)這樣的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，即一種重組恥垢分支桿菌的制備方法，其特征在于第一步，將含有堪薩斯分枝桿菌和編碼基因的重組質(zhì)粒pIJK-1，根據(jù)其全長(zhǎng)序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物分別帶有NcoI和XbaI酶切位點(diǎn)，從中擴(kuò)增出堪薩斯分枝桿菌α抗原信號(hào)肽基因，將含有人結(jié)核分枝桿菌hsp70的啟動(dòng)子和編碼基因重組質(zhì)粒pY6013，經(jīng)NcoI和XbaI酶切消化后，加入α抗原信號(hào)肽基因構(gòu)建4.5kb的重組質(zhì)粒pY-α；第二步，重組質(zhì)粒pHIG53含有人白細(xì)胞介素-2編碼基因，PCR擴(kuò)增不含信號(hào)肽的人白細(xì)胞介素-2編碼基因片斷；重組質(zhì)粒pY-α用相應(yīng)的限制性?xún)?nèi)切酶HindII和XbaI酶切消化，將目的基因片段和載體進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化，構(gòu)建成中間克隆載體pY-α-IL-2
第三步，將分枝桿菌質(zhì)粒pRR3用限制性?xún)?nèi)切酶ScaI消化，并用牛小腸堿性磷酸酶(CIP)去磷酸化，重組質(zhì)粒pY-α-IL-2用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI消化，與載體pRR3進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化，構(gòu)建成4.54kb大小的分支桿菌穿梭表達(dá)載體pR-α-IL-2；第四步，利用電穿孔轉(zhuǎn)化法將穿梭表達(dá)載體pR-α-IL-2轉(zhuǎn)入恥垢分枝桿菌M.smegmatis mc2155中，構(gòu)建了表達(dá)人IL-2的分枝桿菌菌株，即重組恥垢分枝桿菌。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之三是提出重組恥垢分枝桿菌在制備治療膀胱腫瘤藥物上的應(yīng)用。
本發(fā)明具有安全有效，造價(jià)底，使用方便，無(wú)痛苦、無(wú)毒副作用，對(duì)防治膀胱腫瘤的復(fù)發(fā)療效好等特點(diǎn)。


本發(fā)明有如下附圖附圖1為重組恥垢分枝桿菌的構(gòu)建示意圖；附圖2為重組恥垢分枝桿菌免疫反應(yīng)柱狀比較圖；附圖3為重組恥垢分枝桿菌免疫反應(yīng)柱狀比較圖；附圖4為重組恥垢分枝桿菌免疫反應(yīng)毒性線段比較圖；附圖5為T(mén)24細(xì)胞增值反應(yīng)柱狀比較圖；附圖6為BTT739細(xì)胞增值反應(yīng)柱狀比較圖；附圖7為EJ細(xì)胞增值增值反應(yīng)柱狀比較圖；附圖8為BIU87細(xì)胞增值反應(yīng)柱狀比較圖。
(五)、實(shí)施及實(shí)驗(yàn)以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述參見(jiàn)附圖1，重組質(zhì)粒pY6013含有人結(jié)核分枝桿菌hsp70的啟動(dòng)子和編碼基因，該DNA片段定向克隆于pUC19的XbaI和EcoRI位點(diǎn)上。重組質(zhì)粒pIJK-1含有堪薩斯分枝桿菌和編碼基因，根據(jù)其全長(zhǎng)序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物分別帶有NcoI和XbaI酶切位點(diǎn)，從中擴(kuò)增出堪薩斯分枝桿菌α抗原信號(hào)肽基因，然后將克隆載體pY6013分別經(jīng)NcoI和XbaI酶切消化后，加入α抗原信號(hào)肽基因構(gòu)建4.5kb的重組質(zhì)粒pY-α。
重組質(zhì)粒pHIG53含有人白細(xì)胞介素-2編碼基因。PCR擴(kuò)增不含信號(hào)肽的人白細(xì)胞介素-2編碼基因。
重組質(zhì)粒pY-α用相應(yīng)的限制性?xún)?nèi)切酶HindII和XbaI酶切消化，將目的片段和載體進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化，構(gòu)建成中間克隆載體pY-α-IL-2；分枝桿菌質(zhì)粒pRR3用限制性?xún)?nèi)切酶ScaI消化，并用牛小腸堿性磷酸酶(CIP)去磷酸化，重組質(zhì)粒pY-α-IL-2用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI消化，與載體pRR3進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化，構(gòu)建成4.54kb大小的分支桿菌穿梭表達(dá)載體pR-α-IL-2。
利用電穿孔轉(zhuǎn)化法將穿梭表達(dá)載體pR-α-IL-2轉(zhuǎn)入恥垢分枝桿菌M.smegmatis mc2155中，構(gòu)建了表達(dá)人IL-2的分枝桿菌菌株。
將重組恥垢分枝桿菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，收集生長(zhǎng)良好、無(wú)污染的菌苔，經(jīng)一系列處理后，以無(wú)致敏原性的保護(hù)劑配置成原液，再按每毫升含0.75mg的濃度配成菌苗，采用真空冷凍干燥技術(shù)分裝而成。使用時(shí)用生理鹽水50ml稀釋2支本產(chǎn)品，搖動(dòng)使其充分混勻，稀釋后應(yīng)在半小時(shí)內(nèi)使用，以防分枝桿菌死亡或污染。將稀釋后的分枝桿菌經(jīng)尿道注入膀胱，變換體位，保留半小時(shí)。依據(jù)病情，一般1周灌一次。
本發(fā)明可以這樣實(shí)現(xiàn)即在膀胱腫瘤手術(shù)中，用2ml生理鹽水稀釋本產(chǎn)品，在切除腫瘤后，膀胱粘膜局部注射。
重組恥垢分枝桿菌疫苗抗腫瘤活性的研究1、重組膀胱腫瘤基因疫苗株對(duì)小鼠免疫功能的影響(1)實(shí)驗(yàn)步驟a.重組分枝桿菌菌株生長(zhǎng)至OD600為1-1.5，用PBS沖洗重懸使其OD600值相同，雌性BALB/c經(jīng)腹腔注射200μl重組分枝桿菌菌液。
b.注射后6和16周，分別處死小鼠(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)用4至6只小鼠)。取脾臟放于RPMI培養(yǎng)基中。用70μm孔徑的塑料網(wǎng)過(guò)濾脾臟，使其產(chǎn)生單細(xì)胞懸液，沖洗后放于與上面相同的培養(yǎng)基中，使其濃度為4×106/ml。
c.取1ml體積用于細(xì)胞增埴3H-Tdr摻入法分析。加入PPD(分枝桿菌抗原20μg/ml)，于作用后72小時(shí)前每6小時(shí)加入3H-Tdr，測(cè)定其放射活性，以檢測(cè)小鼠中細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。
d.淋巴細(xì)胞抗腫瘤活性的測(cè)定從正常小鼠和重組分枝桿菌免疫小鼠的脾臟中分離淋巴細(xì)胞，以不同的效應(yīng)比加入，MTT法測(cè)定其抗腫瘤活性。(2)結(jié)果a.重組基因疫苗介導(dǎo)的免疫反應(yīng)參見(jiàn)附圖2、3，如圖所示，接種后16周，重組疫苗組較正常對(duì)照組免疫活性有明顯升高(t檢驗(yàn)P＜0.001)。
b.正常小鼠與重組疫苗免疫小鼠淋巴細(xì)胞細(xì)胞毒性比較參見(jiàn)附圖4，由圖可見(jiàn)重組疫苗組較正常對(duì)照組在體外的細(xì)胞毒活性上有明顯的差別(P＜0.05)。
2、重組膀胱腫瘤基因疫苗對(duì)膀胱移行癌細(xì)胞的作用(1)實(shí)驗(yàn)步驟a.人膀胱腫瘤細(xì)胞株EJ、BIU87、T24及鼠源性膀胱移行癌細(xì)胞BTT739生長(zhǎng)在含有10％牛血清、10mM Hepes、2mM L-谷氨酰胺的RPMI-1640培養(yǎng)基中。
b.重組膀胱腫瘤基因疫苗抗腫瘤細(xì)胞增殖分析將消化好的4種膀胱腫瘤細(xì)胞懸液接種于將消化好的3種膀胱腫瘤細(xì)胞懸液接種于96孔平底培養(yǎng)板上，使細(xì)胞數(shù)5×107/ml，每孔加入100μl，使每孔為1000-5000個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)16小時(shí)。野生型或重組的分枝桿菌以最佳濃度(5×105CFU/ml)加入到對(duì)數(shù)培養(yǎng)中期的細(xì)胞中，37℃，5％CO2孵箱中培養(yǎng)24、48、72小時(shí)后，更換培養(yǎng)液，無(wú)菌條件下每孔加入0.5μCi的[3H]-TdR，再繼續(xù)孵育16小時(shí)后，終止反應(yīng)，收集細(xì)胞于9999型玻璃纖維濾紙上，濾紙經(jīng)紅外線烘干后置入閃爍瓶中，加入PPO/POPOP/二甲苯閃爍液，用液閃計(jì)數(shù)器進(jìn)行[3H]-TdR摻入量的測(cè)定，記錄cpm值，計(jì)算變化率。公式為變化率＝(實(shí)驗(yàn)組cpm值/對(duì)照組cpm值)×100％。
c.重組膀胱腫瘤基因疫苗抗腫瘤細(xì)胞毒分析將野生型分枝桿菌及重組膀胱腫瘤疫苗所誘導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞放入96孔V形底板中，每組設(shè)3復(fù)孔置37℃，5％CO2孵箱中培養(yǎng)4小時(shí)，用[3H]-TdR摻入法測(cè)定細(xì)胞毒性。
(2)結(jié)果a.我們的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明重組膀胱腫瘤基因疫苗抗腫瘤細(xì)胞增殖活性是BCG的100倍，4種膀胱腫瘤細(xì)胞株的結(jié)果基本一致。重組膀胱腫瘤基因疫苗在抑制腫瘤細(xì)胞增殖方面較野生型分枝桿菌有明顯的效果，具體結(jié)果見(jiàn)附圖5-8。
b.不同效應(yīng)細(xì)胞所產(chǎn)生的細(xì)胞毒比較。每種細(xì)胞下的數(shù)值分別代表效應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞毒性的平均值。野生型與重組型無(wú)明顯差別。
靶細(xì)胞效應(yīng)細(xì)胞EJBIU87T24 BTT739LAK765467594852 4650WT-SMAK271928301816 2124IL-2-SMAK 302932372935 2732Vect-SMAK 341836302824 29373、重組膀胱腫瘤基因疫苗對(duì)荷瘤鼠免疫治療作用的研究(1)實(shí)驗(yàn)步驟10周齡近交系同基因鼠T739 40只分為4組，每組各10只，前3組腋下接種BTT739腫瘤細(xì)胞1×105/鼠，選擇最佳不同時(shí)相點(diǎn)處死動(dòng)物，觀察腫瘤形成情況，制備荷瘤小鼠動(dòng)物模型。
實(shí)驗(yàn)小組分四組a.空白對(duì)照組荷瘤小鼠給予PBS治療b.BCG組荷瘤小鼠給予野生型BCG菌株治療c.分枝桿菌組荷瘤小鼠給予野生型分枝桿菌治療d.重組膀胱腫瘤基因疫苗組荷瘤小鼠給予重組膀胱腫瘤基因疫苗治療4組實(shí)驗(yàn)組分別于接種腫瘤后0、2、6、9、13天于接種腫瘤部位給予治療，腫瘤直徑達(dá)到1.44cm時(shí)處死小鼠。
(2)結(jié)果40只小鼠在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中有39只在注射部位長(zhǎng)出腫瘤，重組膀胱腫瘤基因疫苗組有1只沒(méi)有腫瘤生長(zhǎng)。
結(jié)果經(jīng)多因素分析表明腫瘤生長(zhǎng)及存活時(shí)間上有明顯差異(p＝0.0066)，重組膀胱腫瘤疫苗在體內(nèi)表現(xiàn)出一定殺腫瘤活性，說(shuō)明重組膀胱腫瘤基因疫苗可以成為一種新型的抗膀胱腫瘤制劑。
權(quán)利要求
1.一種重組恥垢分支桿菌，其特征是a.由恥垢分枝桿菌和由分枝桿菌表達(dá)質(zhì)粒，人結(jié)核桿菌熱休克蛋白70啟動(dòng)子cDNA，堪薩斯分枝桿菌α抗原信號(hào)肽cDNA及人白細(xì)胞介素-2cDNA組成的分枝桿菌穿梭表達(dá)載體構(gòu)成；b.經(jīng)基因工程重組后的恥垢分支桿菌，其特性不變，同時(shí)在含有卡那霉素抗性的Lemco broth培養(yǎng)基中可以穩(wěn)定。即為本重組菌生長(zhǎng)傳代，表現(xiàn)為黃白色菌落，通過(guò)蛋白印跡分析法和ELLSA免疫分析法檢測(cè)到其中的IL-2蛋白表達(dá)。
2.一種制備重組恥垢分支桿菌的方法，其特征在于第一步，將含有堪薩斯分枝桿菌和編碼基因的重組質(zhì)粒pIJK-1，根據(jù)其全長(zhǎng)序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物分別帶有NcoI和XbaI酶切位點(diǎn)，從中擴(kuò)增出堪薩斯分枝桿菌α抗原信號(hào)肽基因，將含有人結(jié)核分枝桿菌hsp70的啟動(dòng)子和編碼基因重組質(zhì)粒pY6013，經(jīng)NcoI和XbaI酶切消化后，加入α抗原信號(hào)肽基因構(gòu)建4.5kb的重組質(zhì)粒pY-α；第二步，重組質(zhì)粒pHIG53含有人白細(xì)胞介素-2編碼基因，PCR擴(kuò)增不含信號(hào)肽的人白細(xì)胞介素-2編碼基因片斷；重組質(zhì)粒pY-α用相應(yīng)的限制性?xún)?nèi)切酶HindII和XbaI酶切消化，將目的基因片段和載體進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化，構(gòu)建成中間克隆載體pY-α-IL-2；第三步，將分枝桿菌質(zhì)粒pRR3用限制性?xún)?nèi)切酶ScaI消化，并用牛小腸堿性磷酸酶(CIP)去磷酸化，重組質(zhì)粒pY-α-IL-2用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI消化，與載體pRR3進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化，構(gòu)建成4.54kb大小的分支桿菌穿梭表達(dá)載體pR-α-IL-2；第四步，利用電穿孔轉(zhuǎn)化法將穿梭表達(dá)載體pR-α-IL-2轉(zhuǎn)入恥垢分枝桿菌M.smegmatis mc2155中，構(gòu)建了表達(dá)人IL-2的分枝桿菌菌株，即重組恥垢分枝桿菌。
3.重組恥垢分枝桿菌在用于制備膀胱腫瘤藥物上的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種防治和治療膀胱腫瘤的重組微生物制劑,即重組恥垢分枝桿菌,由恥垢分枝桿菌和分枝桿菌穿梭表達(dá)載體構(gòu)成,后者是由分枝桿菌表達(dá)質(zhì)粒,人結(jié)核桿菌熱休克蛋白70啟動(dòng)子cDNA,堪薩斯分枝桿菌α抗原信號(hào)肽cDNA及人白細(xì)胞介素－2cDNA組成。主要用于治療淺表型膀胱腫瘤、原位癌、無(wú)法手術(shù)治療的晚期腫瘤及膀胱腫瘤術(shù)后防治復(fù)發(fā)等。將本產(chǎn)品的成品制劑用一定量的生理鹽水稀釋,灌入膀胱腫瘤患者的膀胱中,變換體位保留一定時(shí)間即可,也可在膀胱腫瘤手術(shù)中,用2ml生理鹽水稀釋本產(chǎn)品,在切除腫瘤后,膀胱粘膜局部注射。
文檔編號(hào)A61P13/10GK1339583SQ0112892
公開(kāi)日2002年3月13日 申請(qǐng)日期2001年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月28日
發(fā)明者靳鳳爍, 姚建忠 申請(qǐng)人:靳鳳爍, 姚建忠